SARS冠狀病毒病毒樣顆粒疫苗的研究進展

孟娟麗，沈曉玲，譚文杰

1.內蒙古醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院微生物學教研室，內蒙古 呼和浩特 010110；2.中國疾病預防控制中心 病毒病預防控制所，北京 102206

冠狀病毒（coronavirus，CoV）是一類有包膜的單股正鏈RNA病毒，宿主范圍廣泛，人和多種動物普遍易感，與人和動物的許多疾病有關。有4種普遍流行的人冠狀病毒[1]，包括HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63和HCoV-HKU1，主要引起普通感冒癥狀。除此之外，2003年暴發(fā)的SARS-CoV和2012年9月新鑒定的MERS-CoV均屬于高致病性人冠狀病毒[2-3]，常導致嚴重呼吸窘迫綜合征，有較高的病死率。2003年自中國暴發(fā)的嚴重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）波及30多個國家，導致約8000人感染，其中700余人死亡，病死率約10%。2005年以來未見新的感染病例報道，但多種研究證據(jù)表明SARS-CoV來源于動物，再次發(fā)生跨種屬傳播的可能性依然存在。

目前尚無治療SARS-CoV感染的特效抗病毒藥物，故研制安全有效的SARS疫苗，開展人群特別是高危人群免疫接種是較好的防控措施之一。目前已報道的SARS-CoV疫苗包括滅活疫苗、基因工程亞單位疫苗、DNA疫苗、病毒載體疫苗和病毒樣顆粒（virus-like particles，VLP）疫苗[4]。其中VLP疫苗是由某種病毒的一個或多個結構蛋白組成的不含病毒基因組的空心顆粒，因此不能自主復制，不具有感染性。VLP疫苗較滅活疫苗或減毒活疫苗更安全，同時較亞單位疫苗或DNA疫苗的免疫原性強，因此，SARS-CoV VLP很有潛力成為候選應用疫苗。我們對SARS-CoV VLP疫苗的組成、制備與應用簡要綜述如下。

1 SARS-CoV結構蛋白及VLP疫苗的組成與免疫特性

SARS-CoV基因組全長約27 kb，由14個開放讀框組成。其中5個開放讀框是所有已知的冠狀病毒都具有的，分別編碼復制酶1a/1b、S蛋白、M蛋白、E蛋白和N蛋白；其余的8個開放讀框編碼大小為39～274個氨基酸殘基的輔助蛋白（3a、3b、6、7a、7b、8a、8b、9b），是SARS-CoV所特有的，與其他冠狀病毒輔助蛋白的氨基酸序列幾乎無同源性[4]。S蛋白、3a蛋白、M蛋白和E蛋白是SARS-CoV的包膜蛋白，位于病毒表面，理論上都能產生中和性抗體保護機體。研究表明，S蛋白和3a蛋白在體外均能誘導中和性抗體[5]；S蛋白和N蛋白共同引起較強的免疫反應，但被動轉移研究表明S蛋白是保護性免疫的主要抗原，僅S特異性抗體能阻止SARS-CoV在小鼠模型中復制[6]。

S蛋白是SARS-CoV最大的結構蛋白，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，是冠狀病毒感染細胞的重要蛋白，決定其感染的種屬特異性和組織嗜性。同時，S蛋白也是產生中和性抗體和細胞免疫反應的主要靶抗原[5]。S蛋白S1區(qū)的受體結合區(qū)（RBD）包含多種構象中和表位，與血管緊張素轉換酶2（ACE2）受體結合，介導SARS-CoV進入宿主細胞。S蛋白是高度糖基化蛋白，主要抗原表位的抗原性依賴于蛋白構象和糖基化，故S蛋白適合在真核系統(tǒng)中表達。

M蛋白是SARS-CoV最大的跨膜蛋白，包含3個跨膜區(qū)，大部分位于包膜內與N蛋白結合，僅N端N-糖基化小部分位于包膜外。M蛋白的3個跨膜區(qū)都參與M蛋白的自我組裝與亞細胞定位，其中第一個跨膜區(qū)最重要[7]，缺失突變M蛋白的跨膜區(qū)影響M蛋白的亞細胞定位[8]。糖基化方式不影響M蛋白的定位、自我組裝及釋放。

E蛋白屬于Ⅱ型跨膜蛋白，至少包含1個跨膜區(qū)，相對分子質量約為10 000，僅在病毒包膜及感染細胞表面少量表達。不論在體內或體外，E蛋白不是SARS-CoV復制所必需的，但缺乏E蛋白導致其毒力減弱。E蛋白不僅能改變宿主細胞膜的滲透性[9]，而且能作用于PALS1（參與上皮細胞緊密連接的一種蛋白質），破壞肺上皮細胞的緊密連接[10]。

N蛋白的氨基酸序列相對保守，與RNA結合形成核衣殼，相對分子質量為50 000～60 000，位于包膜內，其特異性抗體在體外不能中和SARS-CoV。SARS-CoV N蛋白組裝入病毒樣顆粒的主要功能區(qū)位于N蛋白168～421氨基酸殘基[11]。N蛋白常被用于血清學診斷。

3a蛋白由開放讀框3編碼，包含274個氨基酸殘基，位于S與E蛋白之間，相對分子質量約31 000，是SARS-CoV最大的輔助蛋白。3a蛋白是包含3個跨膜區(qū)的O型糖基化蛋白，不僅能活化NF-κB、上調上皮細胞纖維蛋白原表達促進SARS-CoV的感染，也能促進破骨細胞生成[12]。盡管3a蛋白能插入VLP，但3a蛋白不是SARS-CoV組裝所必需的?；謴推诓∪说难逯心軝z測到3a特異性抗體。

多項研究表明，SARS-CoV的M蛋白與E蛋白或N蛋白同時表達能組裝成VLP，M蛋白對病毒顆粒的組裝至關重要。此外，S蛋白的2個軟脂酰化半胱氨酸（C1234/1235）是S蛋白組裝入VLP必不可少的，但不參與M-S共定位，M-S共定位和S蛋白組裝入VLP彼此是相互獨立的[13]。最近，Tseng等發(fā)現(xiàn)SARS-CoV M蛋白具有自我組裝并以包膜小泡形式釋放到胞外的能力，和N蛋白同時表達能組裝成VLP[8，14]。體外實驗也表明，SARS-CoV M 蛋白的保守區(qū)是介導M-M相互作用的基礎，N蛋白與M蛋白相互作用促進包膜蛋白復合物的組裝[7]。

2 SARS-CoV病毒樣顆粒的制備方法

對病毒感染性疾病而言，VLP是一種理想的疫苗形式。形態(tài)上，VLP類似未成熟的病毒粒子；功能上，具有天然病毒的類似嗜性，通過和病毒感染一樣的途徑呈遞給免疫細胞，激發(fā)強有力的特異性體液和細胞免疫[15]。目前獲準用于人類的VLP疫苗包括乙型肝炎病毒疫苗、人乳頭瘤病毒疫苗和戊型肝炎病毒疫苗，已在人群中廣泛應用并取得良好效果。同時，許多病毒的VLP也被用于基礎性研究，如病毒的組裝機制及結構研究、病毒與宿主或蛋白與蛋白之間的相互作用[8，13-14]。

多種表達系統(tǒng)可用于制備病毒樣顆粒，包括原核表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)、桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統(tǒng)（B/IC）、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)和轉基因植物。其中B/IC和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)均能進行蛋白質翻譯后修飾并易于快速生產，是應用最為廣泛的VLP制備技術平臺。

2.1 桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統(tǒng)

桿狀病毒表達系統(tǒng)是以桿狀病毒為外源基因載體、昆蟲細胞或活體昆蟲為受體的真核表達系統(tǒng)。桿狀病毒能容納大片段的外源基因，關閉宿主細胞早期基因轉錄而高水平表達目的蛋白，并能進行簡單的翻譯后修飾。重組桿狀病毒制備簡單、快速，能在10～12周內完成新病毒VLP疫苗的生產，特別是一些表面蛋白易于突變的病毒如流感病毒、冠狀病毒等。B/IC系統(tǒng)的主要缺點是同時表達大量難以與VLP分離的桿狀病毒粒子，其具有佐劑活性，如果不去除或滅活，能顯著增加VLP的免疫原性[16]。除此之外，超速離心是純化VLP的主要方法，難以滿足大規(guī)模生產的需求。

用B/IC系統(tǒng)制備SARS-CoV VLP須同時表達M蛋白和E蛋白[17]，在昆蟲細胞內能組裝成穩(wěn)定光滑類似于SARS-CoV粒子的球形VLP；若同時表達S蛋白，則能高效組裝和釋放分泌型VLP[18]；同時表達3a蛋白、M蛋白和E蛋白，3a蛋白也組裝進VLP[17]。Liu等利用B/IC系統(tǒng)同時表達SARS-CoV的S蛋白和流感病毒M1基質蛋白，組裝成了高產量的嵌合型S/M1 VLP，免疫小鼠后可誘導SARS-CoV S蛋白特異的免疫應答及中和抗體，并獲得有效保護[19]。Bai等同時表達SARS-CoV的M、E蛋白和SARS樣CoV（SARS-like CoV，SL-CoV）的S蛋白，也成功獲得嵌合型VLP，S蛋白插入了VLP表面[20]。因此，應用B/IC系統(tǒng)制備SARS-CoV VLP，必須至少同時表達M蛋白和E蛋白。

2.2 哺乳動物細胞表達系統(tǒng)

哺乳動物細胞表達系統(tǒng)是以質粒作為外源基因載體、哺乳動物細胞為宿主的真核表達系統(tǒng)，能夠指導蛋白質的正確折疊，進行復雜的糖基化、磷酸化和乙酰化等多種翻譯后加工功能，表達的產物在分子結構、理化特性和生物學功能方面都最接近于天然高等生物蛋白質，并且在蛋白合成起始信號、加工、分泌等方面具有獨特優(yōu)勢。哺乳動物細胞表達系統(tǒng)類似于BI/C，能表達單個結構蛋白或多個結構蛋白的VLP（多達5個結構蛋白），表達水平大多都能達1 mg/L。哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的主要不足之處是復雜的上、下游處理所需的高生產成本、表達產量低和可控性低。

應用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)生產SARS-CoV VLP的研究表明，M蛋白和N蛋白是形成SARSCoV VLP的必需結構蛋白[8，14]，缺乏M蛋白和（或）N蛋白均不能形成VLP[21-22]。除此之外，Hsieh等發(fā)現(xiàn)M蛋白和E蛋白必須同時表達才能形成SARS-CoV VLP[23]；Xu等進一步證實9b蛋白必須和M蛋白、E蛋白同時表達才能組裝入VLP，而不是依賴于N蛋白或S蛋白的表達[24]。但是，Siu等表明，M蛋白、E蛋白必須和N蛋白同時表達才能有效地組裝和釋放SARS-CoV VLP[25]。Lokugamage等分別同時表達SARS-CoV、小鼠肝炎病毒（MHV）的4個結構蛋白，均能組裝成VLP，且MHV VLP的產量較SARSCoV VLP高17倍。同時，Lokugamage等將SARSCoV的S蛋白與MHV的M蛋白、N蛋白、E蛋白同時表達，其嵌合VLP產量較SARS-CoV VLP高8倍。Lokugamage等通過用不同的轉染試劑和用不同濃度的質粒轉染不同的細胞系，表明293T細胞來源的嵌合VLP產量較Vero細胞高10倍[15]。

3 SARS-CoV VLP疫苗誘導的免疫應答特點與安全性

多項研究表明，SARS-CoV VLP免疫小鼠后能引起強有力的特異性體液免疫和細胞免疫[18-19,26]。SARS-CoV VLP可活化未成熟樹突狀細胞高表達共刺激分子CD40、CD86、CD80和成熟標記分子CD83，分泌細胞因子IL-6、IL-10、IL-4、TNF-α和TNF-γ，從而激活初始T細胞[20]。由于TNF-γ明顯高于IL-4，樹突狀細胞主要誘導初始CD4+T細胞分化為Th1細胞。皮下注射VLP的小鼠也能檢測到IL-4和TNF-γ增高，且 TNF-γ比 IL-4高 9倍[18]。SARSCoV VLP經腹腔注射或滴鼻免疫都能誘導血清特異性IgG升高，滴鼻組血清滴度相對較低，但局部黏膜sIgA的升高很明顯[26]。VLP肌注或滴鼻，在有或無佐劑的情況下都能完全保護攻毒的小鼠，抑制肺內病毒復制[15,19]。

Tseng等報道，SARS-CoV VLP免疫小鼠產生中和性抗體的同時，也導致肺組織產生了Th2型免疫病理損害[27]，類似于兒童接種滅活呼吸道合胞病毒疫苗后引起的免疫病理反應，他們認為N蛋白可能是引起肺組織免疫病理的主要抗原。因此，SARSCoV VLP抗原選擇與應用的安全性問題仍待進一步研究確認。

4 結語

近30年來，VLP大規(guī)模制備與純化技術已得到快速發(fā)展，迄今已有110余個VLP被制備及應用評估。與SARS-CoV亞單位蛋白或多肽相比，VLP類似于天然病毒，能提呈多種構象表位，誘導有效的體液和細胞免疫反應。更重要的是，對于高致病性的SARS-CoV，VLP不含SARS-CoV的基因組，無感染性，無須滅活或減毒，無生物安全隱患。盡管SARSCoV VLP疫苗具有很好的應用前景，但目前尚無SARS-CoV VLP疫苗產品獲準在人群中應用評價，其抗原選擇及制備工藝有待進一步優(yōu)化，VLP疫苗的應用策略與保護效果仍有待在大動物感染模型及人群中驗證與改進。

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