高效液相色譜法測定截短側(cè)耳素的含量

張　婷，金　鑫，李　倩， 涂小進(jìn)

(1.武漢軟件工程職業(yè)學(xué)院，湖北 武漢430205；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北 武漢430070)

截短側(cè)耳素(pleuromutilin)是高等真菌擔(dān)子菌綱側(cè)耳屬Pleurotsmutilus和Pleurotspasseckerianus菌種經(jīng)深層培養(yǎng)產(chǎn)生的一種抗生素，屬雙萜類化合物。已上市的截短側(cè)耳素衍生物泰妙菌素(tiamulin)和沃尼妙林(valnemulin)被廣泛用作獸藥，2007年由英國葛蘭素史克研發(fā)的另一種衍生物瑞他莫林(retapamulin)通過美國FDA和歐盟批準(zhǔn)，是第一個(gè)人類使用的局部外用截短側(cè)耳素類抗生素[1]。作為半合成起始原料的截短側(cè)耳素將會(huì)有很好的市場。在截短側(cè)耳素研制過程中，需要對(duì)其和雜質(zhì)含量建立一種快速、準(zhǔn)確的分析方法。鑒于此，作者采用HPLC法對(duì)截短側(cè)耳素和雜質(zhì)的含量進(jìn)行分析測定。

1　實(shí)驗(yàn)

1.1　試劑與儀器

截短側(cè)耳素供試品，湖北健源化工有限公司；截短側(cè)耳素標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司；乙腈，色譜純；KH2PO4，分析純。

Agilent1260型高效液相色譜儀，安捷倫科技公司；UV-1801型紫外可見分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器有限公司。

1.2　方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)品/供試品溶液的配制

1.2.2系統(tǒng)適應(yīng)性溶液的配制

精密量取1 mL截短側(cè)耳素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度。

1.2.3色譜條件

色譜柱為Agilent Zorbax C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為CH3CN-0.02 mol·L-1KH2PO4緩沖溶液(50∶50，體積比)，流速1.0 mL·min-1，檢測波長205 nm，進(jìn)樣量20 μL，柱溫25 ℃。

2　結(jié)果與討論

2.1　檢測波長的選擇

取截短側(cè)耳素標(biāo)準(zhǔn)品適量，配制成濃度為20μg·mL-1的溶液，掃描紫外吸收光譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，截短側(cè)耳素在205 nm處有最大吸收，故選擇檢測波長為205 nm。

2.2　流動(dòng)相的選擇

1)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，選用CH3CN-0.02 mol·L-1KH2PO4緩沖溶液作為流動(dòng)相的分離效果與CH3CN-0.1 mol·L-1KH2PO4緩沖溶液作為流動(dòng)相時(shí)的分離效果相當(dāng)[2-3]。為滿足實(shí)驗(yàn)分析方法要求，選擇CH3CN-0.02 mol·L-1KH2PO4緩沖溶液作為流動(dòng)相。

2)當(dāng)用10 mol·L-1KOH溶液調(diào)節(jié)CH3CN-0.02 mol·L-1KH2PO4緩沖溶液pH值為7.0±0.2時(shí)，由于10 mol·L-1KOH溶液濃度高，黏度大，導(dǎo)致儀器系統(tǒng)壓力波動(dòng)大，分離效果與不調(diào)節(jié)pH值時(shí)沒有明顯區(qū)別。故本實(shí)驗(yàn)不需調(diào)節(jié)緩沖溶液pH值。

（1）剛性的規(guī)章制度起主要作用。在被問及學(xué)校的管理發(fā)展到哪個(gè)階段時(shí)，64.67%的同學(xué)表示學(xué)校的管理現(xiàn)在處于第二階段，主要依靠一套完善的管理制度和機(jī)制。只有 14%的同學(xué)表示學(xué)校的管理處在第三個(gè)階段，主要依靠校園文化（此處的文化是指價(jià)值理念層面），這說明，目前該大學(xué)的管理中價(jià)值理念層面的文化起到一定的作用，但主要是依靠剛性的規(guī)章制度。

3)有機(jī)相可選用甲醇或乙腈，但由于截短側(cè)耳素最大吸收波長較低，乙腈較甲醇吸收小，產(chǎn)生的噪聲小，保留時(shí)間、分離效果也較好，故有機(jī)相選擇乙腈。

4) 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，梯度洗脫雖然縮短了檢測時(shí)間，但是基線漂移，計(jì)算出的雜質(zhì)含量不準(zhǔn)確。故本實(shí)驗(yàn)采用等度洗脫。

2.3　適應(yīng)性與精密度實(shí)驗(yàn)

取同一份系統(tǒng)適應(yīng)性溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，所得色譜峰的峰面積RSD為0.30％,各峰之間的分離度均大于1.5；拖尾因子均小于2.0；理論塔板數(shù)均大于2 000[2]。表明方法的適應(yīng)性與精密度良好。

2.4　專屬性與重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取截短側(cè)耳素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液進(jìn)樣，截短側(cè)耳素與各雜質(zhì)峰之間的分離度均大于1.5。

取同一批截短側(cè)耳素供試品溶液6份，每份進(jìn)樣1次，計(jì)算總雜質(zhì)含量的RSD為1.3％，主成分含量的RSD為0.92％。表明方法的專屬性與重復(fù)性良好。截短側(cè)耳素供試品溶液的高效液相色譜見圖1。

圖1　截短側(cè)耳素供試品溶液的高效液相色譜

2.5　檢出限與定量限

取截短側(cè)耳素標(biāo)準(zhǔn)品，配制成合適濃度，連續(xù)進(jìn)樣3次，記錄峰高S，使信噪比S/N=3±1，測得檢出限為2.24 ng；使S/N=10±1，測得定量限為6.84 ng。

2.6　線性范圍

將截短側(cè)耳素標(biāo)準(zhǔn)品配制成5種不同濃度(μg·mL-1)：0.12、400、1 200、2 000、2 400，每個(gè)濃度連續(xù)進(jìn)樣2次，取平均值。以峰面積(A)為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品濃度(c)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，擬合得線性回歸方程為A=1.7559c+5.3832，R=0.9998。表明，截短側(cè)耳素濃度在0.12～2 400 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

圖2　截短側(cè)耳素溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.7　回收率實(shí)驗(yàn)

以截短側(cè)耳素系統(tǒng)適應(yīng)性溶液為本底，分別加入0.12 μg·mL-1、2 000 μg·mL-1、2 400 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液后進(jìn)樣檢測，回收率在90％～110％范圍內(nèi)，平均回收率為98.7％，RSD為2.0％。

2.8　穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將截短側(cè)耳素標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別放置1 d、2 d、3 d后進(jìn)樣檢測，RSD均小于2.0％，理論塔板數(shù)、拖尾因子均符合要求，峰面積基本不變，表明該溶液在3 d內(nèi)穩(wěn)定。

2.9　樣品測定

分別取3批截短側(cè)耳素供試品溶液，配制成適當(dāng)濃度，進(jìn)樣檢測，按外標(biāo)法計(jì)算含量分別為91.8％、91.4％和92.0％，RSD分別為0.35％、0.29％和0.32％。表明方法的準(zhǔn)確性、專屬性較好。

3　結(jié)論

建立了截短側(cè)耳素含量的HPLC檢測方法。結(jié)果表明，截短側(cè)耳素濃度在0.12～2 400 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好(R=0.9998)，平均回收率為98.7％，檢出限為2.24 ng，定量限為6.84 ng。該法簡便、準(zhǔn)確、專屬性好，適用于截短側(cè)耳素的含量測定[5]。

參考文獻(xiàn)：

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[2]鄒祥.高效液相色譜法測定發(fā)酵液中截短側(cè)耳素的含量[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2006,32(3):83-85.

[3]吳雪萍，孫鳳霞，蘇為科，等.截短側(cè)耳素的HPLC測定[J].河北科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2008,29(1):30-32.

[4]ICH Harmonised Tripartite Guideline：Validation of Analytical Procedures，Q2(R1)[S].

[5]吳春麗，覃春菀，張俊霞，等.菌渣中截短側(cè)耳素含量的高效液相色譜法測定[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2009,44(1)：178-180.