南極磷蝦煮蝦和蝦粉的急性毒性研究

趙守渙，楊靖亞，汪之和，宋書杰，孫立春

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306）

南極磷蝦煮蝦和蝦粉的急性毒性研究

趙守渙，楊靖亞*，汪之和，宋書杰，孫立春

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306）

目的：通過急性毒性實驗，初步了解南極磷蝦蒸煮的整蝦和蝦粉的安全性。方法：24h內(nèi)喂食由南極磷蝦和蝦粉制成的受試物樣品，對照組喂食SPF鼠糧。連續(xù)觀察7d以及相關(guān)記錄。結(jié)果：煮蝦和蝦粉制作的樣品水分含量分別為14.14%和15.47%，灰分含量分別為12.54%和10.93%，樣品脂肪含量為15.95%和2.56%，干重氟含量分別為1399.84mg/kg和186.77mg/kg；7d觀察，小鼠無死亡均屬正常情況，實驗組小鼠體重和對照組無明顯差異；鼠糧、煮蝦和蝦粉的小鼠原樣最大給樣量分別是290.89、599.04、62.71g/kg，折算成70kg成人劑量分別為32.73、64.22、7.18g/kg；煮蝦組的肝臟系數(shù)與對照組有極顯著差異（p＜0.01），其他均無顯著差異。結(jié)論：小鼠對南極磷蝦煮蝦和蝦粉的最大耐受量分別大于599.04g/kg和62.71g/kg，而南極磷蝦煮蝦可能對肝臟有損傷，其安全性需亞慢性實驗進一步研究。

南極磷蝦，急性毒性實驗，最大給樣量，最大耐受量

南極磷蝦（Euphausiasuperba），又名南極大磷蝦或者大磷蝦，節(jié)肢動物門、甲殼綱、磷蝦目[1]。南極磷蝦以浮游植物為食物，一般體長可達6cm，質(zhì)量約2g，可存活6年。南極磷蝦資源蘊藏量約8億噸，是人們可以利用的蘊藏量最為豐富的物種之一[2]。另外南極磷蝦的營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)，還富含各種必需氨基酸、亞油酸、亞麻酸等多不飽和脂肪酸和一些礦物質(zhì)元素[3]。但是，南極磷蝦具有富集氟的特性。有資料顯示，南極磷蝦整蝦的總氟含量為2400mg/kg，頭胸部總氟含量為4260mg/kg，甲殼總氟含量為3300mg/kg，肌肉總氟含量為570mg/kg[4]，對機體產(chǎn)生一定程度的危害，因此南極磷蝦未得到大規(guī)模的開發(fā)利用。本文進行了南極磷蝦受試物的急性毒性實驗，觀察短期毒性，做出受試物的毒理學(xué)安全性評價，為進一步研究南極磷蝦的安全性和大規(guī)模開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南極磷蝦 2012年捕于南極海域48.2區(qū)，在-20℃冷凍保藏；南極磷蝦蝦粉 購于山東科芮爾生物制品有限公司；實驗動物 昆明種小鼠，雄雌各半，由上海復(fù)旦大學(xué)提供；SPF級鼠糧 購于江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司；硫酸、鹽酸、乙醚等試劑 均為分析純。

JA1003B光電分析天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；DHG-9140A烘箱 上?；厶﹥x器制造有限公司；KGL-1200-5馬弗爐 上海司陽精密設(shè)備有限公司；I10實驗室超細(xì)勻漿機 上海依肯機械設(shè)備有限公司；PHS.3C精密pH計、氟離子選擇電極 上海精密科學(xué)儀器；TD5002A電子天平 濰坊三水檢驗設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 凝固劑瓊脂粉溶液的配制 稱取100g瓊脂粉置于250mL的三角瓶中，加入100mL的去離子水并95℃下加熱30min，不停的攪拌加速溶解，60℃水浴保存，用于下一步樣品的成型。

1.2.2 南極磷蝦煮蝦受試物樣品制備 稱取一定質(zhì)量的南極磷蝦，常溫（用流動自來水）解凍2h，勻漿機145W功率下加工10min，加入占總質(zhì)量1%的上述瓊脂粉溶液燒杯內(nèi)攪拌，電磁爐沸水煮制0.5h后放置于一次性培養(yǎng)皿塑料模型中，40℃烘箱中干燥，樣品凝固成型時取出稱重，0℃冷藏，待喂小鼠。

1.2.3 南極磷蝦蝦粉受試物樣品制備 稱取一定質(zhì)量的蝦粉，常溫（用流動自來水）解凍2h，加入1%質(zhì)量的上述瓊脂粉溶液燒杯內(nèi)攪拌，電磁爐沸水煮制0.5h后放置于40℃烘箱干燥，樣品凝固成型時取出稱重，0℃冷藏，待喂小鼠。

1.2.4 檢測方法

1.2.4.1 水分含量 采用國標(biāo)（GB/T5009.3-2010）直接干燥法測定。

1.2.4.2 脂肪含量 采用國標(biāo)（GB/T5009.6-2003）索氏抽提法測定。

1.2.4.3 灰分含量 采用國標(biāo)（GB/T5009.4-2003）馬福爐550℃灼燒法測定。

1.2.4.4 氟含量 采用國標(biāo)（GB/T5009.18-2003）氟離子選擇電極法測定。

1.2.5 急性毒性實驗 參照經(jīng)典的急性毒性實驗方法，進行南極磷蝦煮蝦受試物和蝦粉受試物的急性毒性實驗[5-8]，24h內(nèi)多次喂食小鼠受試物加工成的樣品，記錄小鼠的一般情況，并做相關(guān)計算，做出毒理學(xué)安全性評價。

在進行正式實驗之前，首先進行預(yù)實驗以便為正式實驗提供依據(jù)。預(yù)實驗中，選取昆明種小鼠12只，體重18～25g，隨機分為3組（煮蝦組、蝦粉組、對照組），每組4只，雄雌各半，在禁食不禁水12h后，喂食制成按1.2.2和1.2.3中方法制作成的受試物樣品，對照組喂食SPF鼠糧，24h內(nèi)小鼠自由攝食，觀察小鼠的體重、活動、飲食、毛發(fā)、大小便以及死亡情況。如死亡率≥30%，則測定半數(shù)致死量（LD50）；如不足以引起死亡，則采用最大耐受量法，即先求出最大給樣量，以推測最大耐受量范圍。

1.2.5.1 小鼠一般反應(yīng)情況的確定 昆明種小鼠60只，隨機分成三組：煮蝦組、蝦粉組、對照組，每組20只，雌雄各半。24h內(nèi)喂食由樣品制成的飼料，連續(xù)觀察7d，詳細(xì)記錄小鼠的活動、飲食、毛發(fā)、大小便以及死亡情況。

1.2.5.2 小鼠體重變化 小鼠實驗前，TD5002A電子天平稱量小鼠體重，精確到0.01g，實驗后，連續(xù)觀察7d，詳細(xì)記錄小鼠的體重。

1.2.5.3 最大給樣量的確定 根據(jù)24h內(nèi)小鼠攝食的總樣品量，以及樣品制作前后的質(zhì)量比，計算出最大給樣量。最大給樣量計算公式如下所示，當(dāng)南極磷蝦煮蝦和蝦粉均為100.00g時，制作出的煮蝦和蝦粉樣品成品的質(zhì)量分別為19.57g和109.89g，代入下列公式計算最大給樣量。

煮蝦/蝦粉最大給樣量（g/kg）=[24h內(nèi)小鼠進食的煮蝦/蝦粉樣品總量（g/kg）×小鼠體重（g）×a]/[小鼠體重（g）×b]

其中，a為原樣南極磷蝦煮蝦或蝦粉質(zhì)量（g），b為制作成煮蝦和蝦粉飼料樣品成品的質(zhì)量（g）。

1.2.5.4 成人轉(zhuǎn)化劑量 小鼠對南極磷蝦煮蝦和蝦粉的最大進食量，按照系數(shù)折算法折算成70kg成人的劑量，小鼠的原樣劑量（g/kg）＝X（g/kg）×70（kg）×0.0026/ Y（g），則X（g/kg）=小鼠的原樣劑量（g/kg）×Y（g）/182，其中X（g/kg）為70kg成人的劑量，Y（g）為小鼠體重；70kg成人劑量中含量（mg）=[70kg成人劑量（g/kg）× 70kg×原樣中氟含量（mg/kg）]/1000。

1.2.5.5 小鼠臟器觀察和臟器系數(shù)計算 7d后解剖，對小鼠器官進行大體檢查，并將重要器官和組織用冰生理鹽水清洗干凈，濾紙吸去多余水分，稱重并進行固定保存。計算小鼠的臟器系數(shù)，臟器系數(shù)（%）=臟器重量（g）/小鼠體重（g）×100。

1.3 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

所有的數(shù)據(jù)用x±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)采用Independent Samples t Test，統(tǒng)計軟件用SPSS 17.0，p＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，p＜0.01表示差別有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 南極磷蝦煮蝦和蝦粉受試物樣品的成分含量結(jié)果

南極磷蝦煮蝦和蝦粉受試物樣品的成分含量如表1所示。

表1 南極磷蝦煮蝦和蝦粉受試物樣品的成分含量Table 1 The component content of the boiled Antarctic krill and shrimp powder

2.2 急性毒性實驗結(jié)果

預(yù)實驗結(jié)果顯示所有受試小鼠毛色發(fā)亮，飲食、活動和大小便正常，鼻眼口耳無異常分泌物，而且無死亡情況，故無法測定半數(shù)致死量（LD50）。

2.2.1 7d觀察小鼠一般反應(yīng)情況結(jié)果 7d內(nèi)記錄小鼠的一般情況如表2所示。

由表2結(jié)果可以看出，小鼠按最大給樣量法給予小鼠最大限度的樣品之后，連續(xù)觀察7d內(nèi)，所有受試小鼠毛色發(fā)亮，飲食、活動和大小便正常，鼻眼口耳無異常分泌物，未出現(xiàn)不良情況和死亡情況，未出現(xiàn)急性毒性反應(yīng)。

表2 南極磷蝦樣品最大給樣量實驗對小鼠一般反應(yīng)情況影響Table2 General reaction of mice under the maximum does of the Antarctic krill samples

2.2.2 體重變化 南極磷蝦煮蝦和蝦粉受試物樣品的最大給樣量喂食小鼠，7d內(nèi)小鼠的體重變化情況如表3所示。

表3 南極磷蝦樣品最大給樣量實驗對小鼠體重改變的影響Table 3 The change of mice body weight under the maximum does of the Antarctic krill samples

由表3可以看出，所有受試小鼠的體重在7d后均增加，但實驗組與對照組比較，無顯著性差異。

2.2.3 最大給樣量的確定 計算出小鼠的喂食飼料樣品的最大進食量，結(jié)果如表4所示。

表4 南極磷蝦樣品最大給樣量Table 4 The maximum dose of the Antarctic krill samples

由表4可以看出，南極磷蝦煮蝦和蝦粉的最大給樣量分別為599.04、62.71g/kg，則小鼠對南極磷蝦煮蝦和蝦粉的最大耐受量分別大于599.04、62.71g/kg。2.2.4 成人轉(zhuǎn)化劑量 按照1.2.5.4的方法得出的成人轉(zhuǎn)化劑量，如表5所示。

世界上大多數(shù)國家均制定了人體每日氟攝入量標(biāo)準(zhǔn)。美國和德國提出的推薦標(biāo)準(zhǔn)是成人每日攝入量為1.5～4.0mg；日本標(biāo)準(zhǔn)為2.1～2.3mg；世界衛(wèi)生組織（WHO）規(guī)定，人均每天適宜的氟攝入量為2.5～ 4.0mg；我國衛(wèi)生部1986年頒布的“初級衛(wèi)生保健計劃”規(guī)定每人每日總氟攝入量不能超過4mg。南極磷蝦煮蝦和蝦粉受試物折算成70kg成人劑量分別是64.22、7.18g/kg，70kg成人劑量中的氟含量分別是1299.49、87.40mg，分別是我國規(guī)定每人每日總氟最大攝入量4mg的324.87倍和21.85倍。擬定成人南極磷蝦煮蝦和蝦粉受試物的攝入量均為100g，折算的70kg成人劑量分別是擬定攝入量的45倍和5倍。

表5 成人轉(zhuǎn)化劑量Table 5 The converted adult dose

2.2.5 小鼠臟器觀察和臟器系數(shù)計算 對各組小鼠進行大體解剖，觀察肝、脾、腎、胃、小腸等主要臟器，均未見組織有異常改變。臟器系數(shù)如表6所示。

臟器系數(shù)[9]是不同年齡期臟器質(zhì)量與體重質(zhì)量的比值。表6顯示，實驗組小鼠的腎臟、脾臟、小腸、胃和心臟系數(shù)與對照組均沒有顯著性差異，表明實驗組小鼠的腎臟、脾臟、小腸、胃和心臟未發(fā)生異常變化；南極磷蝦蝦粉組的肝臟系數(shù)與對照組也沒有顯著性差異，表明蝦粉組的肝臟未發(fā)生異常變化，但是南極磷蝦煮蝦組的肝臟系數(shù)與對照組有極顯著性差異，并且數(shù)值降低，則表明煮蝦組的肝臟可能發(fā)生萎縮等情況，但是具體判斷需要進一步實驗。

3 討論

表6 南極磷蝦樣品最大給樣量實驗后小鼠的臟器系數(shù)（%）Table 6 The organ coefficient of mice under the maximum does of the Antarctic krill samples（%）

上述結(jié)果顯示南極磷蝦煮蝦和蝦粉的最大給樣量分別是599.04、62.71g/kg，則小鼠對南極磷蝦煮蝦和蝦粉的最大耐受量分別大于599.04、62.71g/kg。折算成成人劑量時分別是我國規(guī)定的每人每天最大氟攝入量的324.87倍和21.85倍。有研究顯示[10]大鼠連續(xù)一周大量食用南極磷蝦會產(chǎn)生氟蓄積，測定機體主要部位的氟含量，表明蓄積的氟對機體特別是骨有一定的影響。南極磷蝦的氟富集反應(yīng)[11]是來自海水，可以通過殘殼對氟再吸收。如此高的氟攝入量，作為食品時進行安全性評價，根據(jù)我國的食品安全性毒理學(xué)評價程序和方法的相關(guān)規(guī)定的急性毒性劑量分級標(biāo)準(zhǔn)[12]，大鼠一次口服或者24h內(nèi)多次口服的LD50＞15000mg/kg時，大致相當(dāng)于體重70kg人的致死劑量＞1050g，無急性毒性，本實驗中，無實驗小鼠死亡，則可以判斷南極磷蝦煮蝦和蝦粉受試物無急性毒性。

另一方面，急性毒性實驗僅能判斷短時間內(nèi)受試物的急性毒性，而且一般用于研究新研發(fā)藥物的毒理性評價，在藥物實驗時，大多數(shù)引起死亡。本文中受試物南極磷蝦是一種可能的食品，則南極磷蝦的急性毒性實驗和藥物的急性毒性實驗是有較大區(qū)別的。一個全方面的食品安全性評價需要結(jié)合其他指標(biāo)，且需進一步的慢性實驗進行評價。本急性毒性實驗顯示南極磷蝦煮蝦可能對小鼠肝臟有損傷，但具體的判斷還需要進一步的實驗。

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[4]孫雷，周德慶，盛曉風(fēng).南極磷蝦營養(yǎng)評價與安全性研究[J].海洋水產(chǎn)研究，2008，29（6）：57-64.

[5]GB/T 15193.1-2003，食品安全性毒理學(xué)評價程序[S].

[6]GB/T 21757-2008，化學(xué)品急性經(jīng)口毒性實驗急性毒性分類法[S].

[7]張銑，劉毓谷.毒理學(xué)[M].北京：北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1997：233-234.

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[10]葛魯娜，劉肖帥，武曉云，等.食品與藥品[J].2012，14（5）：172-174.

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[12]GB/T 15193.1-21-2003，食品安全性毒理學(xué)評價程序和方法[S].

Study on acute toxicity of boiled Antarctic Krill and shrimp powder

ZHAO Shou-huan，YANG Jing-ya*，WANG Zhi-he，SONG Shu-jie，SUN Li-chun
（Food Science and Technology College of Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

Objective：An acute toxicity test was used to obtain a preliminary understanding of the safety of boiled Antarctic Krill and shrimp powder.Methods：Lab mice were classified into three categories.Two tested ones were fed with samples made by boiled Antarctic Krill and shrimp powderrespectively and the controlled ones were fed by SPF mice food.Seven consecutive days of observation and relevant record were needed.Results：Moisture content of samples，made by boiled Antarctic Krill and shrimp powder，were 14.14%and 15.47%，respectively，ash content were 12.54%and 10.93%，respectively.Furthermore，crude fat content of dry samples were 15.59%and 2.56%，respectively.And fluoride level were 1399.84mg/kg and 186.77mg/kg，respectively. After seven consecutive days of observation，there were no death cases.In fact，all the mice were normal.To conclude，there was nosignificant difference between the tested and controlled mice.The original maximum given dose of SPF mice food，boiled Antarctic Krill and shrimp powder were 290.89，599.04g/kg and 62.71g/kg，respectively.The converted adult doses were 32.73，64.22g/kg and 7.18g/kg，respectively.There was highly significant difference（p＜0.01）between liver coefficient of tested and controlled mice，and There was no significant difference between others.Conclusion：The maximum tolerance dose of boiled Antarctic Krill and shrimp powder were above 599.04g/kg and 62.71g/kg，respectively.The safety of boiled Antarctic Krill needs further subchronicresearch as it may be harmful to liver.

Antarctic Krill；acute toxicity test；maximum given dose；maximum tolerance dose

TS201.6

A

1002-0306（2014）08-0352-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.072

2013－08－05 *通訊聯(lián)系人

趙守渙（1990-），女，在讀碩士研究生，研究方向：海洋生物制藥。

國家高新技術(shù)研究發(fā)展（863）計劃海洋技術(shù)領(lǐng)域主題項目（2011AA090801）。