燕麥多酚純化、發(fā)芽燕麥不同組分的多酚分布及抗氧化活性

付曉燕，隋 勇，謝筆鈞，孫智達，*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)楚天學(xué)院食品與生物科技學(xué)院，湖北武漢 430205；

2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢 430070)

燕麥多酚純化、發(fā)芽燕麥不同組分的多酚分布及抗氧化活性

付曉燕1，隋 勇2，謝筆鈞2，孫智達2，*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)楚天學(xué)院食品與生物科技學(xué)院，湖北武漢 430205；

2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢 430070)

采用大孔樹脂純化與液相萃取相結(jié)合的方法，對燕麥多酚的純化工藝進行優(yōu)化，并對發(fā)芽燕麥不同組分的多酚分布及抗氧化活性進行研究。結(jié)果表明：采用AB－8大孔樹脂，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗脫，萃取前將溶液pH調(diào)至2，選擇乙酸乙酯作為萃取溶劑，能夠有效地分離純化燕麥多酚。燕麥發(fā)芽后籽粒、芽和根中蒽酰胺的含量顯著提高，且主要集中在乙醇洗脫組分中，水洗組分中含有一定量的酚酸類物質(zhì)。還原力實驗結(jié)果表明，在相同試樣濃度下，蒽酰胺的抗氧化活性弱于酚酸。

燕麥，多酚，純化，發(fā)芽，抗氧化活性

燕麥富含多種生物活性成分，具有抗氧化、降血脂等保健功能，酚類物質(zhì)是燕麥抗氧化功能的最主要來源[1]。燕麥中的酚類化合物主要包括簡單的酚類（如各種酚酸）、燕麥蒽酰胺和黃酮類化合物[2]。在燕麥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的酚酸有咖啡酸、阿魏酸、p－香豆酸、對羥基苯甲酸、香草酸、芥子酸、原兒茶酸、丁香酸、沒食子酸、水楊酸、苯乙酸等[3－4]。燕麥蒽酰胺是一系列羥基肉桂酸及其衍生物和鄰氨基苯甲酸及其衍生物通過酰胺鍵（－HNCO－）連接而成的物質(zhì)，是燕麥中特有的抗氧化成分[5]。目前在燕麥中發(fā)現(xiàn)的蒽酰胺至少有24種，含量最高的是p－香豆酸、阿魏酸和咖啡酸分別與5－羥基鄰氨基苯甲酸通過酰胺鍵連接而成的物質(zhì)，簡稱2p、2f和2c[6－7]。燕麥中黃酮類化合物含量較少。研究證實燕麥酚類提取物對活性氧自由基具有較強的清除能力，能夠抑制β－胡蘿卜素褪色及亞油酸氧化，并能提高機體內(nèi)超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性，是天然抗氧化劑的重要來源之一[7－9]。

發(fā)芽是無害化、低成本提升植物種子營養(yǎng)價值和功能性質(zhì)的重要手段，研究表明燕麥發(fā)芽過程中酚類物質(zhì)的含量顯著提高，但對其分離純化的研究還鮮有報道。大孔樹脂具有吸附容量大、選擇性強、再生方便等優(yōu)點，液液萃取法工藝簡單、成本低、能有效萃取出目標(biāo)組分，二者被廣泛用于天然產(chǎn)物的分離純化[10－11]。本研究采用大孔樹脂純化與液液萃取相結(jié)合的手段，對燕麥多酚的純化工藝進行了優(yōu)化，并對發(fā)芽燕麥不同組分的多酚分布及抗氧化活性進行了研究，旨在為燕麥多酚的利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

晉燕八號裸燕麥 由山西省農(nóng)科院高寒區(qū)作物研究所提供；Folin－Ciocalteau試劑 Sigma公司；AB－8、D101大孔樹脂 南開大學(xué)化工廠；HP－20大孔樹脂 上海摩速科學(xué)器材有限公司；ADS－17大孔樹脂 天津市海光化工有限公司；甲醇、乙醇、沒食子酸、碳酸鈉、鹽酸、乙酸乙酯、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 均為分析純。

250B生化培養(yǎng)箱 江蘇金壇市宏華儀器廠；FD－1－50冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器公司；AC 210S電子天平 美國Sartorius Instrument Ltd；DK－98－IIA數(shù)顯恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；RE111型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司；755B分光光度計、UV1700可見－紫外分光光度計 上海精制科學(xué)儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 燕麥多酚的提取 準(zhǔn)確稱取一定量粉碎后的原樣和6d籽粒置于帶塞三角瓶中，按料液比1∶40（W/V）加入體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液，置于50℃水浴搖床中浸提2h，提取結(jié)束后抽濾，將提取液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上回收乙醇，得燕麥多酚濃縮液。

1.2.2 燕麥多酚的純化 采用大孔樹脂純化與液相萃取純化相結(jié)合的方法[12]。

1.2.2.1 大孔樹脂的篩選 將相同濃度的燕麥多酚濃縮液分別通過相同體積和高度的大孔樹脂D－101、AB－8、HP－20和ADS－17進行吸附，先用水洗至無糖，再用體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇洗脫至洗脫液無色為止，將洗脫液于50℃下真空濃縮，冷凍干燥后稱重、測定總酚含量，計算總酚吸附率、解吸率和回收率，公式如下：

式中：B0—上柱總多酚量，mg；B1—水洗脫多酚量，mg；B2—乙醇洗脫多酚量，mg；Q1—吸附率，%；Q2—解吸率，%；R—總酚回收率，%。

1.2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定 將燕麥多酚濃縮液上AB－8大孔樹脂，先用水洗至無糖，然后分別用體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%和90%的乙醇洗脫至洗脫液無色為止，收集洗脫液，減壓回收乙醇，真空冷凍干燥后稱重、測定總酚含量，總酚回收率按公式（3）計算。

1.2.2.3 pH對萃取效果的影響 稱取一定量的大孔樹脂純化產(chǎn)物，用一定體積蒸餾水溶解，分別用2mol/L鹽酸將試樣pH調(diào)至2、4和6，加入與試樣相同體積的乙酸乙酯萃取3次，每次萃取時間為30min，收集乙酸乙酯相，回收有機溶劑，冷凍干燥后稱重、測定總酚含量，計算總酚回收率，公式如下：

式中：C0—萃取前多酚量，mg；C1—有機相多酚量，mg；S—總酚回收率，%。

1.2.2.4 萃取溶劑的選擇 稱取一定量的大孔樹脂純化產(chǎn)物，用一定體積蒸餾水溶解，將試樣pH調(diào)至2，分別加入與試樣相同體積的氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取3次，每次萃取時間為30min，收集有機相，回收有機溶劑，冷凍干燥后稱重、測定總酚含量，總酚回收率按公式（4）計算。

1.2.3 總酚含量的測定 采用Folin－Ciocalteau法[13]，準(zhǔn)確吸取待測液0.1mL，依次加入6mL蒸餾水，0.5mL Folin－Ciocalteau試劑，混勻后加入20%的Na2CO3溶液1.5mL，充分混勻，定容10mL，在室溫下靜置1h后于765nm下測定其吸光度。以溶液濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，得回歸方程為：y=0.0011x+ 0.008，R2=0.9999。

1.2.4 燕麥種子發(fā)芽實驗 將燕麥種子用2%次氯酸鈉溶液于室溫下浸泡15min，洗去殘余的次氯酸鈉溶液，用蒸餾水浸漬種子于18℃生化培養(yǎng)箱中浸泡16～18h，將種子瀝干后置于自制發(fā)芽盤中于18℃培養(yǎng)箱中連續(xù)發(fā)芽6d（前期研究表明發(fā)芽6d后總酚含量增長趨勢逐漸變緩，故選取發(fā)芽6d樣品進行后續(xù)實驗），培養(yǎng)箱保持濕度在95%以上。將發(fā)芽6d的燕麥分為籽粒、芽和根3部分，于冷凍干燥機中干燥36h，備用。

1.2.5 發(fā)芽前后燕麥多酚不同組分的制備 稱取一定量的未發(fā)芽燕麥種子、發(fā)芽6d的燕麥籽粒、芽和根，按圖1流程對酚類物質(zhì)進行提取純化，得組分Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ進行后續(xù)實驗。

1.2.6 燕麥多酚的紫外可見光譜分析 取一定量原樣、6d籽粒、6d芽和6d根的純化產(chǎn)物（包括組分Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ），分別用甲醇溶解，在紫外可見光譜儀上掃描，掃描波長為200～500nm。

圖1 燕麥發(fā)芽前后不同多酚組分的制備流程Fig.1 Preparation flow of different phenolic fraction separated from ungerminated and germinated oat

1.2.7 燕麥多酚還原能力的測定 采用Liu等[14]報道的方法，取不同濃度的樣品溶液1.0mL，加入0.2mol/L，pH6.6的磷酸鈉緩沖液1.0mL及1%的鐵氰化鉀溶液1.0mL，于50℃水浴反應(yīng)20min后急速冷卻，加入10%的三氯乙酸溶液1.0mL，3000r/min離心10min，取上清液2.5mL，加入蒸餾水2.0mL及0.1%三氯化鐵溶液0.5mL，混合均勻，10min后于700nm處測定其吸光度，吸光值越大表示還原能力越強。

2 結(jié)果與分析

2.1 燕麥多酚的純化

2.1.1 大孔樹脂的篩選 由于大孔樹脂的極性、孔徑、比表面積、孔容等不同，故對某一類化學(xué)物質(zhì)的吸附性能存在差異，從而達到分離純化的目的。在本研究所選樹脂中，D－101為非極性，AB－8為弱極性，HP－20為中等極性，ADS－17為極性[15]。由表1可以看出，AB－8型大孔樹脂對燕麥多酚的吸附率和解吸率均較好，總酚回收率明顯高于其他3種樹脂，故采用AB－8型大孔樹脂作為燕麥多酚分離純化的柱填充材料較為適宜。

表1 四種大孔樹脂對燕麥多酚的吸附分離性能比較Table 1 Comparison of adsorbing and separating capability of four types of maeroporous resin on oat phenols

2.1.2 乙醇洗脫濃度的確定 采用AB－8型大孔樹脂作為柱材料，不同濃度乙醇對燕麥多酚的洗脫效果見圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總酚回收率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the recovery rate of total phenols

由圖2可知，在一定范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度增加，總酚回收率逐漸提高。當(dāng)用30%的乙醇洗脫時，總酚回收率只有47.19%，而當(dāng)乙醇濃度提高到70%時，總酚回收率可達76.83%。再將乙醇濃度提高到90%，總酚回收率反而有所下降，這可能是由于燕麥多酚中含有某些極性物質(zhì)，當(dāng)乙醇濃度較高時，這些極性物質(zhì)不易被洗脫?？梢?0%的乙醇可以作為對燕麥多酚比較適宜的洗脫溶劑，這與張守文等[10]的研究結(jié)果相一致。

2.1.3 pH對萃取效果的影響 對初步純化產(chǎn)物采用有機溶劑進一步萃取純化，pH對萃取效果的影響見圖3。

圖3 pH對總酚回收率的影響Fig.3 Effect of pH on the recovery rate of total phenols

由圖3可以看出，當(dāng)pH為2時，總酚回收率較高，約66.04%的多酚都能集中在乙酸乙酯層，隨著pH的增大，乙酸乙酯相中的多酚含量越來越少，當(dāng)pH為6時，總酚回收率僅有22.81%。由于燕麥中含有多種酚酸，在酸性條件下，羧基的解離傾向受到抑制，多酚更容易以分子的形式存在于溶液中[16]，從而有利于乙酸乙酯的萃取，因此選擇萃取前將樣品溶液的pH調(diào)至2。

2.1.4 萃取溶劑的選擇 由圖4可以看出，3種溶劑對燕麥多酚回收率的大小順序為：乙酸乙酯＞正丁醇＞氯仿，說明乙酸乙酯的極性與燕麥中酚類物質(zhì)的極性較為接近，可以作為比較適合的萃取溶劑。

圖4 萃取溶劑對總酚回收率的影響Fig.4 Effect of extraction solvent on the recovery rate of total phenols

2.2 燕麥發(fā)芽前后不同組分的多酚分布

對未發(fā)芽燕麥種子、發(fā)芽6d的燕麥籽粒、芽和根按1.2.5制備流程分別得到4個樣品的組分Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，燕麥多酚在不同組分中的分布情況見表2。

由表2可以看出，未經(jīng)大孔樹脂處理的組分Ⅰ中總酚含量較高，經(jīng)大孔樹脂純化后酚類物質(zhì)有一定的損失，但對原樣、6d籽粒和6d芽來說，大部分多酚存在于組分Ⅲ中，表明其可被70%乙醇溶液洗脫，水洗組分中損失的酚類物質(zhì)較少。而在6d根中，水洗組分Ⅱ中總酚含量大于乙醇洗脫組分Ⅲ，說明根中可能含有大量極性較強的酚類物質(zhì)，它們不能被弱極性的AB－8大孔樹脂吸附而隨著水流失掉。

表2 燕麥發(fā)芽前后不同組分的多酚分布Table 2 Distribution of phenols in different fraction separated from ungerminated and germinated oat

2.3 燕麥發(fā)芽前后不同組分的紫外可見光譜分析

原樣、6d籽粒、6d芽和6d根不同組分的紫外可見光譜圖見圖5。

由圖5可知，原樣組分Ⅰ的紫外光譜在280nm和320nm附近有較大的光吸收，符合酚類物質(zhì)的光譜特征；而發(fā)芽后籽粒、芽和根的組分Ⅰ都在340nm附近出現(xiàn)了明顯的吸收峰，這與燕麥蒽酰胺的光譜特征相吻合[17]，表明燕麥發(fā)芽過程中蒽酰胺的合成量增加。此外，由4個樣品組分Ⅱ和Ⅲ的光譜圖可以看出，水洗組分Ⅱ只在280nm附近有比較明顯的光吸收，340nm附近的吸收峰基本都集中在組分Ⅲ中，表明70%乙醇溶液能夠較好的富集燕麥蒽酰胺，而隨水流失掉的可能是一些極性較強的酚酸類物質(zhì)。

2.4 燕麥發(fā)芽前后不同組分還原能力的比較

研究表明，抗氧化劑的還原力與其抗氧化活性之間普遍存在相關(guān)性，可通過測定還原力來表示抗氧化活性的強弱[18]，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，隨著原樣、6d籽粒、芽和根提取物濃度的提高，吸光度均增大，還原力增強，且吸光度值與濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。通過對4個樣品組分Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的還原力進行比較發(fā)現(xiàn)，在相同的試樣濃度下，不同組分吸光度的大小順序均為組分Ⅱ＞組分Ⅰ＞組分Ⅲ，表明含有極性酚酸的水洗組分還原能力最強，未經(jīng)大孔樹脂純化的酚類物質(zhì)混合組分還原能力次之，而燕麥蒽酰胺較為集中的乙醇洗脫組分還原能力最弱。蒽酰胺是燕麥發(fā)芽過程中大量合成的物質(zhì)，也是燕麥所特有的抗氧化成分，但研究表明其抗氧化活性不如酚酸類物質(zhì)，可能由于分子量普遍較大、結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜所致。

3 結(jié)論

通過對4種大孔樹脂吸附分離性能的考察及對不同濃度乙醇洗脫效果的比較，確定AB－8作為分離純化燕麥多酚的樹脂，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇進行洗脫。對初純物進一步考察溶液pH和不同溶劑對萃取效果的影響，確定萃取前將溶液的pH調(diào)至2，選擇乙酸乙酯作為萃取溶劑。

對未發(fā)芽燕麥，發(fā)芽6d的燕麥籽粒、芽和根分別采用大孔樹脂純化與有機溶劑萃取得到組分Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，紫外可見光譜分析結(jié)果表明燕麥發(fā)芽過程中蒽酰胺的合成量增加，且蒽酰胺主要集中在乙醇洗脫組分Ⅲ中，水洗組分Ⅱ中含有一定量的酚酸類物質(zhì)。還原力實驗結(jié)果表明，在相同試樣濃度下，不同組分還原力的大小順序為組分Ⅱ＞組分Ⅰ＞組分Ⅲ，說明蒽酰胺的抗氧化活性弱于酚酸，這可能與其分子量和分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。

圖5 燕麥發(fā)芽前后不同組分的紫外可見光譜圖Fig.5 UV spectrogram of different fraction separated from ungerminated and germinated oat

圖6 燕麥發(fā)芽前后不同組分的還原能力Fig.6 Reducing power of different fraction separated from ungerminated and germinated oat

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Purification of oat phenols，distribution of phenolic compounds and antioxidant activity of different fractions separated from germinated oat

FU Xiao-yan1，SUI Yong2，XIE Bi-jun2，SUN Zhi-da2，*
（1.College of Food＆Biology Science and Technology，Chutian College，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430205，China；
2.College of Food Science and Technology Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）

The purification technology of oat phenols by maeroporous resin and liquid extraction was optimizated in this article.On this basis，distribution of phenolic compounds and antioxidant activity of different fractions separated from germinated oat were studied.The optimum purification technology was as follows：maeroporous resin was chosen AB-8 using 70%ethanol as elution solvent.pH value was adjusted to 2 using ethyl acetate as extraction solvent.The content of avenanthramides from germinated oat grains，buds and roots increased obviously.Avenanthramides mainly exist in the ethanol fraction and some phenolic acids were lost with water. The reducing power experiment results indicated that the antioxidant activity of avenanthramides was lower than phenolic acids at the same concentration.

oat；phenols；purification；germination；antioxidant activity

TS210.1

A

1002－0306（2014）08－0083－05

10.13386/j.issn1002－0306.2014.08.009

2013－08－19 *通訊聯(lián)系人

付曉燕（1985－），女，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。

“十一五”國家科技支撐計劃項目（2006BAD27B09）。