徐淮山羊Oct4啟動子功能的初步分析

韋光輝, 李東, 左其生, 張亞妮, 朱睿, 張蕾, 劉志永, 邱峰龍, 李碧春

揚州大學動物科學與技術學院, 江蘇省動物遺傳繁育與分子設計重點實驗室, 揚州 225009

Oct4(Octamer-binding transcription factor 4)即八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子, 又稱為 POU5F1, 屬于 POU家族的一個同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子[1～3]。Oct4是第一個被發(fā)現(xiàn)只在多能細胞中表達的轉(zhuǎn)錄因子, 對于調(diào)控胚胎干細胞的自我更新、維持其未分化狀態(tài)起著關鍵性作用。因此, Oct4經(jīng)常被用來作為鑒定多能細胞的標記物[4～7]。

研究表明, 轉(zhuǎn)錄因子Oct4的精確表達對維持胚胎干細胞多能性具有關鍵調(diào)控作用, 表達量過高或過低均會影響胚胎干細胞的自我更新狀態(tài)[8]。同時,Oct4基因與胚胎干細胞(ES)分化密切相關。Niwa等[9,10]研究表明, 通過調(diào)控 ES細胞中Oct4基因的表達水平導致ES細胞向不同方向分化。當Oct4正常表達水平上調(diào)50%時, ES細胞分化為原始內(nèi)胚層和中胚層, 而當Oct4正常表達水平下調(diào)50%時, ES細胞會向滋養(yǎng)層方向分化。只有Oct4維持正常表達水平時, ES細胞才能夠保持其未分化狀態(tài)和多能性。此外, Oct4還通過與Sox、FoxD3等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,共同調(diào)控下游靶基因的表達, 從而維持胚胎干細胞的自我更新狀態(tài)。另一方面, 在多能細胞中, Oct4也能激活一系列有助于維持細胞多能性的基因表達[11,12]。

Oct4基因的表達水平對多能干細胞的維持和向不同方向分化起著重要作用。啟動子區(qū)域決定基因起始時間、控制基因表達的程度, 是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控最重要的結(jié)構(gòu)。因此, 研究Oct4基因啟動子對于闡明其基因表達調(diào)控是必不可少的。de Silva等[13]利用曲古抑菌素誘導CD4+T細胞,提高了SAMHD1基因的表達量。Teng等[14]添加丙戊酸后增強了小鼠Oct4基因啟動子的活性。Oct4是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因, 目前關于羊Oct4基因啟動子的功能研究報道較少。本研究采用雙熒光素酶報告基因載體對徐淮山羊Oct4基因啟動子進行分析, 通過瞬時轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細胞(gEF)、非洲綠猴 SV40轉(zhuǎn)化的腎細胞(COS7)和P19(小鼠畸胎瘤細胞)細胞系, 檢測雙熒光報告基因活性, 確定了徐淮山羊Oct4基因啟動子的核心調(diào)控區(qū)域, 同時探討了TSA和VPA對Oct4基因啟動子活性的調(diào)控作用, 為進一步揭示山羊Oct4基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制提供了理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

徐淮山羊來自江蘇丹陽珥陵山羊交易市場,PGL3-Basic、pRL-SV40、pEGFP-N1和感受態(tài) DH5α為本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 徐淮山羊Oct4基因啟動子克隆

參照GenBank數(shù)據(jù)庫已公布的山羊Oct4基因序列, 采用 Primer5.0設計一對特異性引物 PGL3-Oct4P1(表 1), 以提取的徐淮山羊血液基因組 DNA為模板進行PCR擴增反應。擴增條件：95℃ 4 min;98℃ 10 s, 60℃ 18 s, 72℃ 90 s, 共 30個循環(huán); 72℃延伸 6 min。PCR產(chǎn)物末端加A后進行瓊脂糖凝膠電泳, PCR產(chǎn)物連接pMD19-T載體。經(jīng)轉(zhuǎn)化、酶切鑒定后命名為 pMD19-Oct4P1, 由上海英俊生物工程有限公司測序。

1.2.2 Oct4基因啟動子各缺失片段的克隆

參照Oct4基因啟動子區(qū)域以及潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預測的結(jié)果, 固定下游引物不變, 變化上游引物, 設計了6對不同長度片段的啟動子引物(引物序列見表1)。以pMD19-Oct4P1為模板進行各片段的擴增, 分別與 pMD19-T載體連接, 構(gòu)建包含Oct4基因啟動子不同片段的克隆載體。構(gòu)建后由上海英俊生物工程有限公司測序。

表1 用于擴增Oct4基因不同缺失片段的引物

1.2.3 雙熒光素酶表達載體PGL3-Oct4P的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoⅠ(Thermo公司)分別對包含Oct4基因不同啟動子片段的克隆載體pMD19-Oct4P(P1～P7)進行雙酶切, 同時用KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切 PGL3.0-Basic載體, 經(jīng)酶切得到的Oct4不同長度片段分別與雙酶切后的PGL3.0-Basic載體進行連接, 構(gòu)建7個包含不同長度的Oct4基因啟動子的熒光素酶表達載體, 分別命名為PGL3-Oct4P1、PGL3-Oct4P2、PGL3-Oct4P3、PGL3-Oct4P4、PGL3- Oct4P5、PGL3-Oct4P6 和PGL3-Oct4P7。載體構(gòu)建示意圖見圖1。

圖1 含有Oct4啟動子不同長度片段的雙熒光素酶報告載體PGL3-Oct4P構(gòu)建示意圖

1.2.4 pEGFP-N1/1546載體的構(gòu)建

分別用限制性內(nèi)切酶AseⅠ和XhoⅠ對pEGFP-N1和N1/p1546的PCR產(chǎn)物進行雙酶切, 酶切產(chǎn)物回收后進行連接、轉(zhuǎn)化。經(jīng) PCR、酶切、測序鑒定正確后命名為pEGFP-N1/1546。

1.2.5 細胞瞬時轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前一天將細胞接種于24孔板, 細胞密度為1×105細胞/孔, 待細胞匯合度培養(yǎng)至 80%～90%時進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染, 重組質(zhì)粒 PGL3-Oct4P (P1～P7)、pRL-SV40以30:1的比例共轉(zhuǎn)染gEF、P19和COS7細胞。同時共轉(zhuǎn)染空載體PGL3-Basic和pRL-SV40作為空白對照組; 另外, 用重組質(zhì)粒 pEGFP-N1/1546轉(zhuǎn)染gEF細胞, 同時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-N1, 作為陽性對照。具體參照LipofectamineTM2000產(chǎn)品操作步驟說明書。

1.2.6 TSA和VPA對Oct4長片段啟動子活性的誘導

采用終濃度為 1 μmol/L的 TSA和終濃度為 4 mmol/L的 VPA(均購自 SIGMA公司)對轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒 PGL3-Oct4P2的細胞進行誘導, 以無任何添加的重組質(zhì)粒PGL3-Oct4P2轉(zhuǎn)染組為對照組。36 h后進行雙熒光素酶報告基因檢測。

1.2.7 Oct4啟動子缺失片段活性分析和GFP的檢測

采用 Dual-Luciferase?Reporter assay System(Promega公司)檢測系統(tǒng)測定報告基因的表達水平。具體操作參照Promega雙熒光報告檢測試劑盒說明書。分別記錄螢火蟲熒光值和海腎熒光值的 3次讀取結(jié)果。熒光素酶相對活性的數(shù)值為 3次重復實驗結(jié)果的“平均值±標準差”。pEGFP-N1/1546載體轉(zhuǎn)染COS7細胞后在熒光顯微鏡下檢測綠色熒光。

2 結(jié)果與分析

2.1 Oct4基因啟動子各片段的克隆

以擴增得到的1966 bp的Oct4基因啟動子片段為模板, 用Oct4基因啟動子不同長度片段的上、下游引物分別進行PCR擴增。1.5%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示：擴增出的條帶為 1966 bp、1546 bp、976 bp、645 bp、465 bp、268 bp 和 126 bp, 與預期條帶大小一致(圖2)。

圖2 Oct4基因啟動子不同片段擴增產(chǎn)物電泳圖

2.2 雙熒光素酶表達載體PGL3-Oct4P和pEGFPN1/1546載體的酶切鑒定

包含Oct4啟動子不同片段的重組雙熒光素酶表達載體 PGL3-Oct4P分別采用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoI進行雙酶切驗證。經(jīng)2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測, 結(jié)果顯示：各泳道均出現(xiàn)兩條帶, 且條帶大小與預期結(jié)果一致, 表明所構(gòu)建的載體正確(圖3)。pEGFP-N1載體中的CMV啟動子替換為Oct4基因的啟動子片段 P2, 利用AseⅠ和XhoⅠ進行雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果出現(xiàn)兩條近似4300 bp和1546 bp的條帶, 分別與去除啟動子 CMV后的pEGFP-N1和P1546片段大小一致(圖4)。

圖3 雙熒光素酶表達載體PGL3-Oct4P酶切鑒定

圖4 載體pEGFP-N1/1546雙酶切鑒定

2.3 Oct4基因啟動子活性分析

7個重組質(zhì)粒 PGL3-Oct4P(P1～P7)分別與 pRLSV40共轉(zhuǎn)染gEF、P19和COS7細胞, 同時設置對照組, 共轉(zhuǎn)染空載體PGL3-Basic和pRL-SV40。

雙熒光報告基因檢測結(jié)果表明,Oct4基因啟動子不同片段在 3種細胞中表現(xiàn)出不同程度的啟動子活性(圖 5), 并且Oct4啟動子相同片段在不同細胞中的活性也不同。在3種細胞中, P2(–1516～+30 bp)啟動子活性最高, P7(–96～+30 bp)活性最低。–238～–96 bp 區(qū)域啟動子活性下降明顯, –96～+30 bp區(qū)域基本無啟動子活性, 表明啟動子基本活性區(qū)域為–238～+30 bp; 在–1516～–946 bp、–615～–96 bp 區(qū)域, 啟動子活性隨片段長度增加而升高, 表明這些區(qū)域存在正調(diào)控元件, 而在–1936～–1516 bp、–946～–615bp區(qū)域啟動子活性隨著片段長度增加而下降, 表明這些區(qū)域存在負調(diào)控元件。

圖5 Oct4啟動子的活性檢測

2.4 TSA和VPA對Oct4基因啟動子活性的誘導

經(jīng)過對PGL3-Oct4P2質(zhì)粒不同濃度誘導的篩選,終濃度為 1μmol/L的 TSA和終濃度為 4mmol/L的VPA對Oct4基因啟動子活性誘導效率最高。誘導后的雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示：與對照組相比, 在 gEF、P19和 COS7細胞中, 單獨添加 VPA,Oct4啟動子活性分別相應提高了 2.5倍、3倍和 4倍; 單獨添加 TSA,Oct4啟動子活性分別相應提高了8.4倍、11.2倍和12倍; 而聯(lián)合添加VPA和TSA,Oct4啟動子活性分別相應提高了10.1倍、12.2倍和13.5 倍(圖 6)。

圖6 TSA和VPA對Oct4啟動子活性的誘導

2.5 Oct4長片段啟動子活性的定性分析

雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果證明Oct4基因啟動子具有啟動子活性, 為驗證其長片段是否具有啟動子活性, 選取啟動子Oct4啟動子長片段P2(–1516～+30 bp)片段替換 pEGFP-N1 載體中的CMV啟動子, 替換后轉(zhuǎn)染gEF細胞。同時轉(zhuǎn)染陽性對照 pEGFP-N1。熒光結(jié)果分析表明, 轉(zhuǎn)染pEGFP-N1/1546的gEF細胞有GFP表達, 但弱于陽性對照質(zhì)粒 pEGFP-N1(圖 7), 該結(jié)果進一步驗證了Oct4啟動子長片段能夠啟動GFP的轉(zhuǎn)錄, 具有啟動子活性。

圖 7 Oct4基因啟動子長片段啟動子活性的熒光檢測(100×)

3 討 論

啟動子是調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄水平的最基本結(jié)構(gòu), 通過研究啟動子的結(jié)構(gòu)和功能可以更好地了解基因的表達模式[15,16]。Oct4屬于POU轉(zhuǎn)錄因子家族, 對于維持胚胎干細胞的自我更新及其全能性具有重要作用, 同時也是參與體外誘導多功能干細胞的關鍵基因[17]。本研究針對山羊Oct4基因啟動子的功能進行了初步探討, 對于進一步揭示Oct4基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制具有重要意義。

本文采用目前研究基因調(diào)控的常用方法——5′端逐步缺失突變技術[18,19], 研究Oct4啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。根據(jù)Oct4啟動子序列, 構(gòu)建了包含7個不同長度啟動子片段的螢光素酶報告基因表達載體,同時設置含有海腎熒光報告基因的PGL3-SV40載體作為內(nèi)參, 分別轉(zhuǎn)染gEF、COS7和P19細胞。雙熒光報告基因檢測結(jié)果表明：在同一種細胞中, 啟動子活性隨著啟動子片段大小的不同而不同; 而在不同細胞中, 片段相同的Oct4基因啟動子的活性強度存在差異。在以上轉(zhuǎn)染的 3種細胞中, 相同大小片段的啟動子在 COS7細胞中測得活性最高, 其次是P19細胞, 最后是 gEF細胞。分析原因可能是不同種屬細胞間存在的差異。COS7是經(jīng)SV40病毒基因轉(zhuǎn)化的細胞系, 能組成型地表達SV40 T抗原, 使得任何復制啟始位置帶有 SV40的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒能夠以很高的拷貝數(shù)進行復制[20], 常用于病毒和轉(zhuǎn)染研究以及對細胞基因轉(zhuǎn)錄的研究中。P19是小鼠畸胎瘤細胞, 是一種多能性細胞, 而 Oct4基因在多能細胞中表達量豐富, 是鑒定多能細胞的標記物。gEF是山羊胎兒成纖維細胞, 轉(zhuǎn)染效率低。Oct4基因啟動子活性的整體趨勢在以上 3種細胞中所檢測結(jié)果是一致的。

為驗證其長片段是否具有啟動子活性, 將pEGFP-N1載體中的CMV啟動子替換為Oct4啟動子的 P2(–1516～+30 bp)長片段, 替換后的重組質(zhì)粒pEGFP-N1/1546轉(zhuǎn)染gEF細胞。熒光結(jié)果分析表明,轉(zhuǎn)染的gEF細胞有GFP表達, 但弱于陽性對照質(zhì)粒pEGFP-N1, 該結(jié)果進一步驗證了Oct4啟動子長片段能夠啟動GFP的轉(zhuǎn)錄, 具有啟動子活性。

在本研究中, 與 P6(–238～+30 bp)區(qū)域相比較,P7(–96～+30 bp)區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性下降十分明顯, 幾乎無轉(zhuǎn)錄活性, 這表明–238～–96 bp之間存在重要的正調(diào)控元件, 同時也說明–238～+30 bp區(qū)域是Oct4基因啟動子的基本活性區(qū)域。生物信息學分析預測顯示：羊Oct4基因不含典型的 TATA框, 在–238～+30 bp區(qū)域存在 CCAAT box特征序列以及SP1、ADR1和MZF1等轉(zhuǎn)錄因子。已有研究證實, 一個基因的啟動子區(qū)域中缺少 TATA框, 轉(zhuǎn)錄因子SP1能夠參與該基因的轉(zhuǎn)錄起始[21～25]。由于SP1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點序列相對保守, 因此推測 SP1在缺乏 TATA 盒的羊Oct4基因啟動子中可能發(fā)揮了重要的作用, 確保Oct4啟動子的基本轉(zhuǎn)錄活性。

Cotterman等[26]研究證實, 可以通過改變基因富集區(qū)域和已知基因遠距離區(qū)域的組蛋白乙?；瘉碚{(diào)節(jié)整個基因組的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。本研究為進一步驗證Oct4基因的表達是否存在組蛋白修飾, 采用組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA、VPA來誘導Oct4啟動子活性。本研究參考DETSA最佳誘導濃度以及Teng摸索的VPA最適濃度, 對TSA和VPA最佳濃度進行了篩選, 結(jié)果表明終濃度為1 μmmol/L的TSA和4 mmol/L的VPA對Oct4啟動子誘導效率最高。通過對gEF、P19和COS7細胞的誘導檢測,Oct4啟動子活性均有不同程度的提高, 表明Oct4基因存在組蛋白乙?；揎椬饔?。

本研究成功構(gòu)建了包含Oct4基因5′側(cè)翼區(qū)一系列不同片段的重組報告基因載體PGL3-Oct4P。利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析了各片段的啟動子活性,確定了Oct4基因啟動子的核心區(qū)域及正負調(diào)控區(qū)域。研究結(jié)果表明：Oct4基因啟動子活性與啟動子片段大小并沒有呈現(xiàn)絕對正相關, 啟動子活性沒有隨著序列長度的增加而升高, 啟動子活性最高的片段是P2 (–1516～+30 bp), 不是最長序列片段 P1(–1936～+30 bp)。片段 P2的啟動子活性比 P3(–946～+30 bp)高, 從片段 P7(–96～+30 bp)到片段 P4(–615～+30 bp),啟動子活性逐步升高, 表明–1516～–946 bp區(qū)域、–615～–96 bp區(qū)域存在正調(diào)控元件, 但具體是哪些元件起增強作用還需要進一步研究。在–1936～–1516 bp、–946～–615 bp區(qū)域存在抑制啟動子活性的元件, 具體是哪些元件同樣也需要進一步的研究驗證。

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