利用基因組編輯技術(shù)創(chuàng)制抗白粉病小麥

王延鵬, 程曦, 高彩霞, 邱金龍

1.中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所植物細(xì)胞與染色體工程國家重點(diǎn)實驗室, 北京100101;

2.中國科學(xué)院微生物研究所植物基因組學(xué)國家重點(diǎn)實驗室, 北京 100101

普通小麥(Triticum aestivumL., 2n=42, AABBDD)是異源六倍體, 是世界上最重要的糧食作物之一, 為人類提供約20%的能量。由于其基因組龐大(17 Gb), 約為人類基因組的5倍, 并且80%～90%的基因都存在3個或多個拷貝, 因此利用傳統(tǒng)的正向或反向遺傳學(xué)手段來解析小麥基因功能以及作物的性狀改良都有很大的難度, 這使得小麥基因組研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他作物。隨著小麥基因組測序的逐步完成, 建立一種高效的反向遺傳學(xué)手段將成為小麥基因組功能解析和作物改良的關(guān)鍵?；蚓庉嫾夹g(shù)是目前突變或改造基因的最具潛力的技術(shù)體系, 特別是類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)因子核酸酶(TALENs)和成簇規(guī)律間隔的回文重復(fù)序列及相關(guān)系統(tǒng)(CRISPR/Cas9 system), 具有效率高、特異性好以及高通量的特點(diǎn)。

在小麥里解析與其親緣關(guān)系較近物種中控制重要性狀基因的同源基因功能是反向遺傳學(xué)研究的主要內(nèi)容, 有助于對小麥中相應(yīng)性狀的遺傳改良。小麥和大麥具有較近的親緣關(guān)系, 白粉病是大麥和小麥主要的世界性病害, 嚴(yán)重的影響到他們的產(chǎn)量和品質(zhì)。大麥里由于MLO基因的功能缺失突變使其具有廣譜和持久的抗性, 這種抗性在生產(chǎn)上已成功應(yīng)用了30多年還沒有被打破。在小麥中也存在MLO基因,在小麥 A、B、D基因組上各有一個拷貝(TaMLO-A1,TaMLO-B1,TaMLO-D1), 它們與大麥的MLO基因具有很高的相似性。將TaMLO-B1轉(zhuǎn)入大麥MLO基因的突變體里, 可使其恢復(fù)對白粉病的感病性, 這說明MLO基因的功能在進(jìn)化過程中具有保守性。因此, 對小麥MLO等位基因的缺失突變有望產(chǎn)生廣譜抗白粉病的品種。

中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞課題組和中國科學(xué)院微生物研究所邱金龍課題組合作, 利用基因組編輯技術(shù)首次在六倍體小麥中對MLO基因的3個拷貝同時進(jìn)行了突變, 獲得了對白粉病具有廣譜抗性的小麥材料。該研究首先利用TALEN技術(shù)實現(xiàn)了多個拷貝基因的同時突變,即根據(jù)小麥MLO基因3個拷貝的保守區(qū)設(shè)計一對TALENs,發(fā)現(xiàn)TALEN誘導(dǎo)的突變可以穩(wěn)定遺傳到后代, 并符合孟德爾遺傳規(guī)律。突變體材料經(jīng)過一代或兩代自交, 獲得了MLO基因不同組合的純合突變體(tamlo-aa,tamlo-bb,tamlo-dd,tamlo-aabb,tamlo-aadd,tamlo-bbdd,tamlo-aabbdd)。通過小麥白粉菌接種實驗, 發(fā)現(xiàn)只有小麥A、B和D基因組上3個MLO基因拷貝同時突變的純合突變體tamlo-aabbdd表現(xiàn)出對白粉菌極為顯著的廣譜抗性, 而其他組合的純合突變體與野生型一樣對白粉病具有感病性(圖 1)。該結(jié)果表明小麥MLO基因的 3個拷貝在功能上存在冗余, 這也可能是到目前為止在自然條件下或利用傳統(tǒng)育種手段而沒有獲得小麥mlo抗病材料的主要原因。

圖1 TaMLO基因3個拷貝的純合突變體使小麥對白粉病表現(xiàn)出極為顯著的抗性

該研究還利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)實現(xiàn)了對小麥MLO基因的定向突變, 即針對MLO基因的單個拷貝設(shè)計CRISPR/Cas9靶位點(diǎn), 原生質(zhì)體和轉(zhuǎn)基因植物中的結(jié)果表明突變只發(fā)生在A基因組上。這個結(jié)果表明, 在多倍體的小麥中, 利用基因編輯技術(shù)既可以同時突變多個拷貝,也可以特異地突變單個基因拷貝。此外, 該研究還利用基因組編輯系統(tǒng)引發(fā)的DNA自身修復(fù)途徑非同源末端連接(NHEJ)在小麥MLO位點(diǎn)實現(xiàn)了基因的定點(diǎn)插入, 插入的片段可以穩(wěn)定遺傳。

該研究首次在一個多倍體物種中證明可以對多個部分同源的基因同時并準(zhǔn)確地進(jìn)行編輯, 并展示了通過基因組編輯可以實現(xiàn)不同物種的育種信息資源共享。此外,創(chuàng)制的小麥mlo突變體具有持久、廣譜抗白粉病的優(yōu)點(diǎn),也將為小麥白粉病的抗病育種提供重要的起始材料。該工作為小麥基因功能的研究以及育種新材料或品種的創(chuàng)制提供了一個全新的思路和技術(shù)路線。研究結(jié)果于2014年7月20日在線發(fā)表在生物技術(shù)領(lǐng)域權(quán)威期刊《自然-生物技術(shù)》(Nature Biotechnology)雜志上(http://dx.doi.org/10.1038/nbt.2969)。Nature Biotechnology同期配發(fā)一篇“News and Views”, 對該研究及相關(guān)領(lǐng)域的進(jìn)展進(jìn)行全面評述。