一種基于高密度遺傳標(biāo)記的親子鑒定方法及其應(yīng)用

張哲，羅元宇，李晴晴，賀金龍，高寧，張豪，丁向東，張勤，李加琪

1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，國家生豬種業(yè)工程中心，廣東省農(nóng)業(yè)動(dòng)物基因組與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642；

2. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，北京 100193

系譜是人類遺傳及動(dòng)植物育種研究的重要信息來源之一。系譜錯(cuò)誤在遺傳研究及育種生產(chǎn)中普遍存在，如英國奶牛群體的系譜錯(cuò)誤率約為 10%[1]，以色列為10.8%[2]，丹麥為5%～15%[3]，荷蘭為12%[4]，愛爾蘭為7%～20%[5]，國外奶牛系譜平均錯(cuò)誤率約為11%[6]。我國天津及北京奶牛場的系譜錯(cuò)誤率分別為12%[7]和17%～21%[8,9]。除奶牛外，系譜錯(cuò)誤在其他畜種中也有研究報(bào)道[10]。系譜錯(cuò)誤會(huì)減慢群體的遺傳進(jìn)展，比系譜缺失帶來更大的育種損失[11]，也會(huì)影響其他利用系譜信息的研究，如QTL(Quantitative trait locus)定位和基因組選擇結(jié)果的可靠性。

用血型和血液蛋白型[12]及分子標(biāo)記[13]可對疑似親子關(guān)系進(jìn)行親子鑒定。但前者進(jìn)行親子鑒定準(zhǔn)確率低，在實(shí)際應(yīng)用中受到諸多限制[1]。近年來，隨分子生物學(xué)的發(fā)展，尤其是測序及生物芯片技術(shù)的進(jìn)步，小衛(wèi)星[14,15]、微衛(wèi)星[16,17]和單核苷酸多態(tài)(Single nucleotide polymorphism, SNP)[18]等分子標(biāo)記逐漸用于畜禽系譜重建或校正[2,19]以及人類親子鑒定[20]。其中，SNP標(biāo)記因遺傳穩(wěn)定性高、突變率低、全基因組覆蓋率高、分型準(zhǔn)確性高和成本低等特點(diǎn)[21]已成為人類及動(dòng)植物遺傳研究中常用的一種分子標(biāo)記。

目前可用于親子鑒定的方法主要有排除法、似然法和基因重構(gòu)法，它們主要用于自然群體的親子鑒定，在家畜親子鑒定中前兩種方法使用較多[22]。基于這些方法的親子鑒定軟件主要有 Cervus[23]、KINSHIP[24]等。雖然各軟件的特點(diǎn)和效果有一定差別[22]，但它們均為親子鑒定而設(shè)計(jì)，可解決不同情形下的親子推斷問題。為降低親子鑒定的基因型檢測成本，它們多采用相對復(fù)雜的算法，以保證用少量標(biāo)記準(zhǔn)確完成親子鑒定。

近年來，很多研究通過利用高密度SNP標(biāo)記進(jìn)行基因組掃描或全基因組關(guān)聯(lián)分析定位QTL[25,26]，或通過全基因組選擇預(yù)測動(dòng)植物個(gè)體的育種值[27]或人類的患病風(fēng)險(xiǎn)[28]。這些研究的前期數(shù)據(jù)處理中，多數(shù)都需用到系譜以進(jìn)行數(shù)據(jù)校正、基因型填充和單倍型推斷等。因此，開展研究之前需先對系譜進(jìn)行校正，以保證后續(xù)研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。然而，目前能直接使用全基因組高密度SNP標(biāo)記的親子鑒定方法尚缺。據(jù)此，本研究首先提出一種在群體中直接利用全基因組SNP標(biāo)記進(jìn)行親子鑒定的新方法，進(jìn)而在杜洛克豬及荷斯坦奶牛兩個(gè)實(shí)驗(yàn)群體中進(jìn)行驗(yàn)證，最后對該方法的應(yīng)用效果及特性進(jìn)行了詳細(xì)討論。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)群體及基因型檢測

本研究共使用2個(gè)實(shí)驗(yàn)群體。第一個(gè)群體是來自北京地區(qū)的2180頭中國荷斯坦奶牛，包括87頭公牛和2093頭母牛。系譜記錄顯示所有母牛均來自14個(gè)公牛家系[29,30]。所有個(gè)體的基因組DNA從母牛凝血或公牛冷凍精液中提取，使用 Illumina BovineSNP 50 BeadChip[31]進(jìn)行全基因組SNP標(biāo)記檢測，該芯片共包含54 001個(gè)SNPs。

第二個(gè)群體是來自福建省某種豬場的 191頭純種杜洛克豬，其中公豬18頭，母豬173頭，系譜記錄完整。全部個(gè)體的基因組DNA均從耳組織提取，用 Illunima PorcineSNP60 BeadChip進(jìn)行全基因組SNP標(biāo)記基因型檢測，該芯片包含61 565個(gè)SNPs[32]。系譜顯示該基因型檢測的群體中有73對親子對，且均為后代與母親的關(guān)系。

所有SNP數(shù)據(jù)均進(jìn)行質(zhì)量控制，去除SNP檢出率＜0.9、最小等位基因頻率(Minor allele frequency,MAF)＜0.01的 SNP位點(diǎn)和個(gè)體檢出率＜0.9的個(gè)體，然后進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2 系譜錯(cuò)誤的檢驗(yàn)方法

本檢驗(yàn)方法基于孟德爾遺傳定律，即每個(gè)遺傳位點(diǎn)的等位基因均以孟德爾遺傳方式由親本傳遞給后代。據(jù)此，在疑似親本和疑似后代個(gè)體所構(gòu)成的待檢測親子對間，可對每一個(gè)雙等位基因的遺傳位點(diǎn)用如下規(guī)則進(jìn)行孟德爾錯(cuò)誤判定：(1) 若疑似親本為純合基因型，而疑似后代為另一種純合基因型，如親本為AA，后代為aa，則可判定為一個(gè)孟德爾錯(cuò)誤；(2) 若疑似親本為雜合基因型，則兩種等位基因均有可能傳遞給后代，因此在另一親本未知的情況下，無論后代為何種基因型均無法進(jìn)行孟德爾錯(cuò)誤判定。假定共有N個(gè)位點(diǎn)可用于進(jìn)行該檢驗(yàn)，其中疑似親本為雜合基因型的位點(diǎn)數(shù)為Nh個(gè)，疑似親子對間孟德爾錯(cuò)誤次數(shù)為Nme，則有效檢測次數(shù)為N - Nh，孟德爾錯(cuò)誤率Re= Nme/(N - Nh)。需要注意的是，該方法基于如下假定：(1) 所有個(gè)體的DNA樣品采集及基因型檢測過程無誤；(2) 基因型分型無錯(cuò)誤發(fā)生或者有完全隨機(jī)的分型錯(cuò)誤發(fā)生，但錯(cuò)誤率極低。

基于群體基因型數(shù)據(jù)，用上述規(guī)則對疑似親子對及無關(guān)個(gè)體對進(jìn)行孟德爾檢測，即可獲得孟德爾錯(cuò)誤率的經(jīng)驗(yàn)分布，劃定錯(cuò)誤率的閾值，即可對系譜的正確性進(jìn)行判定。

1.3 系譜錯(cuò)誤檢驗(yàn)的程序?qū)崿F(xiàn)及應(yīng)用

利用1.2所述原理，使用R語言[33]進(jìn)行程序開發(fā)，程序命名為EasyPC(Easy Pedigree Checking)。輸入文件為群體基因型文件和待檢測系譜文件。該程序可自動(dòng)對群體孟德爾錯(cuò)誤進(jìn)行檢測，并依據(jù)經(jīng)驗(yàn)分布劃定閾值，判斷待檢測系譜是否正確。程序最后自動(dòng)輸出系譜檢測結(jié)果，并對錯(cuò)誤率進(jìn)行圖形輸出。EasyPC軟件程序代碼及測試數(shù)據(jù)已免費(fèi)共享至https://github.com/SCAU-AnimalGenetics/EasyPC。

本研究將開發(fā)的程序應(yīng)用于 1.1所述的兩個(gè)群體中進(jìn)行系譜錯(cuò)誤檢驗(yàn)。因群體結(jié)構(gòu)不同，本研究在兩個(gè)群體中使用了不同的檢測策略。在奶牛群體中，檢測全部公牛與全部母牛間的孟德爾錯(cuò)誤率；在豬群體中，檢測全部個(gè)體間的孟德爾錯(cuò)誤率。

為進(jìn)一步了解1.2所描述的方法的運(yùn)行效率，本研究對比了EasyPC與Cervus 3.0[23]程序標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)設(shè)置時(shí)的運(yùn)行時(shí)間及資源占用情況。全部對比均在同一操作環(huán)境下進(jìn)行，CPU 主頻3.1GHz，內(nèi)存4.0GB，Win7操作系統(tǒng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型數(shù)據(jù)

經(jīng)過質(zhì)控，奶牛和豬的數(shù)據(jù)集分別剩余2112和190個(gè)個(gè)體，45 738和40 999個(gè)SNPs用于系譜錯(cuò)誤檢測。本研究所用的奶牛群體中SNPs最小等位基因頻率分布見圖1。由圖1可見，全部SNPs的MAF呈均勻分布，豬數(shù)據(jù)集的MAF分布與圖1相似(結(jié)果未展示)。奶牛群體和豬群體的平均 MAF分別為0.26和0.25，雜合度均為0.35。

圖 1 中國荷斯坦奶牛群體最小等位基因頻率(MAF)分布圖

2.2 孟德爾錯(cuò)誤率分布

對質(zhì)控后的奶牛群體中87頭公牛及2025頭母牛個(gè)體間進(jìn)行孟德爾錯(cuò)誤率計(jì)算，分布如圖 2。孟德爾錯(cuò)誤率整體呈正態(tài)分布，但在錯(cuò)誤率接近0處有另一單峰。正態(tài)分布處為非親子個(gè)體對間孟德爾錯(cuò)誤率，0點(diǎn)單峰處應(yīng)為真正的親子對間孟德爾錯(cuò)誤率。兩部分分布的界限清晰，所以本研究選擇1.0%作為對本數(shù)據(jù)集孟德爾錯(cuò)誤率的判定閾值。孟德爾錯(cuò)誤率最小值為0，最大值為0.18，平均值為0.11。

圖2 87頭公牛與2025頭母牛配對的孟德爾錯(cuò)誤率分布圖

為獲得杜洛克豬群體孟德爾錯(cuò)誤率的經(jīng)驗(yàn)分布，對該群體中經(jīng)過質(zhì)控后的全部 190個(gè)個(gè)體間進(jìn)行孟德爾錯(cuò)誤率計(jì)算，結(jié)果如圖 3。孟德爾錯(cuò)誤率整體呈正態(tài)對稱分布，但在 0點(diǎn)處有一單峰。兩部分分布界限清晰，所以本研究選擇1.0%作為對本數(shù)據(jù)集孟德爾錯(cuò)誤率的判定閾值。孟德爾錯(cuò)誤率最小值為0，最大值為0.17，平均值為0.09。

圖3 190頭杜洛克豬個(gè)體對間孟德爾錯(cuò)誤率分布圖

2.3 系譜錯(cuò)誤分析

根據(jù)以上的孟德爾錯(cuò)誤率分析可知，在孟德爾錯(cuò)誤率的群體經(jīng)驗(yàn)分布圖中，兩部分分布界限十分清晰。在本研究的兩個(gè)群體中，均選定1.0%為鑒定系譜錯(cuò)誤與否的孟德爾錯(cuò)誤率閾值。用該閾值對奶牛群體進(jìn)行系譜錯(cuò)誤統(tǒng)計(jì)：在2025頭母牛中，1937頭母牛同時(shí)具有父親基因型，可用于系譜錯(cuò)誤檢測。其中1 547頭母牛系譜經(jīng)基因型鑒定為系譜正確，剩余的 390條系譜中母牛與父親公牛間孟德爾錯(cuò)誤率超過閾值，可判定為錯(cuò)誤系譜。因此，該群體中系譜錯(cuò)誤率為 20%。通過該方法，390頭系譜錯(cuò)誤的母牛中有320頭在公牛群體中配對發(fā)現(xiàn)孟德爾錯(cuò)誤率低于閾值，參考牛的出生時(shí)間記錄即可推測為正確的親子關(guān)系。據(jù)此，可更正錯(cuò)誤系譜并記錄正確的親子關(guān)系，有效地提升系譜正確率。

豬群體中的系譜錯(cuò)誤分析表明：在73對系譜記錄的同時(shí)進(jìn)行基因型檢測的親子對中，4對親子對因質(zhì)控而被剔除，只剩下69對可用于后續(xù)研究。其中，有65對親子對間孟德爾錯(cuò)誤率小于閾值，即判定為系譜正確，其余 4對個(gè)體間系譜記錄錯(cuò)誤。因此，該杜洛克豬群體中系譜錯(cuò)誤率為6%。此外，本研究在對所有個(gè)體進(jìn)行孟德爾錯(cuò)誤進(jìn)行計(jì)算時(shí)，還發(fā)現(xiàn)了 4對個(gè)體間錯(cuò)誤率小于閾值，可推斷為親子關(guān)系，用于系譜校正。

2.4 運(yùn)行效率對比分析

本研究在奶牛數(shù)據(jù)集中隨機(jī)篩選了不同標(biāo)記數(shù)及不同個(gè)體數(shù)的組合，對比了EasyPC與Cervus的運(yùn)行時(shí)間(表 1)。在所篩選的個(gè)體中，有 50頭公牛作為其余母牛的候選父親，兩軟件均在全部50頭公牛與全部母牛間進(jìn)行親子鑒定。結(jié)果表明：相同情況下Cervus計(jì)算時(shí)間明顯高于EasyPC，如2500標(biāo)記，1000個(gè)體時(shí)兩者相差約 20倍。隨著標(biāo)記數(shù)的增加，兩個(gè)軟件的運(yùn)行時(shí)間均呈線性增加，但Cervus運(yùn)行時(shí)間增加速度大于 EasyPC，且在標(biāo)記數(shù)多于2500時(shí)無法運(yùn)行。Cervus運(yùn)行時(shí)間隨個(gè)體數(shù)的增加無明顯變化，EasyPC雖呈線性增長，但即使個(gè)體數(shù)增至2000時(shí)，運(yùn)行時(shí)間仍遠(yuǎn)低于Cervus。

表1 不同個(gè)體數(shù)及標(biāo)記數(shù)時(shí)兩種方法運(yùn)行時(shí)間對比

值得注意的是，除了本研究記錄的運(yùn)行時(shí)間以外，在應(yīng)用兩軟件前的基因型數(shù)據(jù)及系譜整理方面也有較多差異。EasyPC僅需按格式提供完整的全基因組基因型文件和系譜文件即可，而Cervus則需按要求對全基因組基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行復(fù)雜的標(biāo)記篩選和嚴(yán)格質(zhì)控，這也降低了此種情況下軟件應(yīng)用的便利性。

3 討 論

本研究提出了一種基于全基因組SNP標(biāo)記，并以孟德爾錯(cuò)誤率為判定依據(jù)來進(jìn)行系譜錯(cuò)誤檢驗(yàn)的方法，并命名該方法為EasyPC。在奶牛及豬兩個(gè)畜禽群體中的驗(yàn)證結(jié)果表明該方法能有效進(jìn)行親子間的系譜錯(cuò)誤檢驗(yàn)，更適用于全基因組基因型數(shù)據(jù)的親子鑒定。

本研究所提出的系譜錯(cuò)誤檢驗(yàn)方法簡單易行，尤其適用于全基因組高密度遺傳標(biāo)記數(shù)據(jù)。與Cervus的運(yùn)行效率對比結(jié)果表明：常用親子鑒定軟件只能使用少量標(biāo)記進(jìn)行親子鑒定，如在郭剛等人的研究[9]中對255個(gè)挑選的高多態(tài)性的SNP標(biāo)記使用 Cervus進(jìn)行計(jì)算。當(dāng)我們嘗試使用超過 2500個(gè)標(biāo)記運(yùn)行該軟件時(shí)，該軟件則無法正常獲得結(jié)果。在全基因組高密度標(biāo)記全部可用的前提下，若使用這些軟件進(jìn)行親子鑒定，則要按照一定要求只篩選部分少量標(biāo)記，進(jìn)而按照操作步驟完成親子鑒定。從信息利用的角度考慮，這顯然不是最優(yōu)化的方法，而且增加親子鑒定操作的復(fù)雜度。但這些軟件的算法更多是專為親子鑒定或系譜重建工作而設(shè)計(jì)，以親子鑒定為直接目的的研究或應(yīng)用可使用這些軟件以降低基因型檢測的成本。相比之下，本研究所用的EasyPC方法簡單易行。該方法依據(jù)孟德爾遺傳定律及簡單的假定條件，即可利用全基因組高密度遺傳標(biāo)記快速準(zhǔn)確地實(shí)施系譜錯(cuò)誤鑒定。在全基因組標(biāo)記數(shù)據(jù)非常普遍的情況下，很多用到全基因組數(shù)據(jù)的研究都需首先進(jìn)行系譜錯(cuò)誤鑒定，進(jìn)而開展其他研究，如全基因組關(guān)聯(lián)分析、全基因組選擇等。本文提出的這種簡單易用的系譜校正方法必然會(huì)給相關(guān)研究的前期數(shù)據(jù)處理帶來更多便利。

本研究所提出的系譜錯(cuò)誤鑒定方法對系譜是否錯(cuò)誤進(jìn)行判定的依據(jù)是孟德爾錯(cuò)誤率，而判定的標(biāo)準(zhǔn)則是根據(jù)研究群體孟德爾錯(cuò)誤率的統(tǒng)計(jì)分布確定。在應(yīng)用該方法進(jìn)行判定時(shí)，應(yīng)在群體內(nèi)隨機(jī)個(gè)體間進(jìn)行孟德爾錯(cuò)誤率計(jì)算。因隨機(jī)個(gè)體間的孟德爾錯(cuò)誤率計(jì)算結(jié)果可為本檢測方法提供清晰的對照，為閾值的選取提供準(zhǔn)確的依據(jù)。根據(jù)孟德爾遺傳定律，親子對間的孟德爾錯(cuò)誤率極低，且在此僅受基因型檢測錯(cuò)誤的影響。因此，在標(biāo)記數(shù)量很大時(shí)，孟德爾錯(cuò)誤率極低。而隨機(jī)個(gè)體對間的孟德爾錯(cuò)誤率是群體MAF的函數(shù)，如某哈迪溫伯格平衡位點(diǎn)的MAF為0.25時(shí)，據(jù)1.2的孟德爾錯(cuò)誤率計(jì)算規(guī)則算得的錯(cuò)誤率為11.25%。本文奶牛群體平均MAF為0.26，隨機(jī)個(gè)體間平均錯(cuò)誤率為 11%，與理論預(yù)期相符。據(jù)此，由較高的隨機(jī)個(gè)體間孟德爾錯(cuò)誤率作為對照，真實(shí)親子對間因孟德爾錯(cuò)誤率極低而很容易鑒定。本研究兩個(gè)群體選擇1.0%為閾值是根據(jù)錯(cuò)誤率的群體經(jīng)驗(yàn)分布數(shù)據(jù)而定(圖2，圖3)。但不同的應(yīng)用中需要注意的是，MAF分布具有群體特異性。不同研究中，可能因基因型檢測技術(shù)及群體遺傳結(jié)構(gòu)不同，選取的閾值也會(huì)有差異。但無論如何確定閾值，在孟德爾錯(cuò)誤率的經(jīng)驗(yàn)分布中，群體在錯(cuò)誤率接近 0處會(huì)有一方差很小的正態(tài)分布峰，此處的個(gè)體對即為真實(shí)親子對。此處孟德爾錯(cuò)誤率不為0的主要原因是基因型檢測錯(cuò)誤導(dǎo)致孟德爾錯(cuò)誤發(fā)生，但這種錯(cuò)誤率在SNP芯片設(shè)計(jì)的容許范圍內(nèi)[24,34]，而且不影響利用全基因組標(biāo)記的親子鑒定工作。

畜禽系譜錯(cuò)誤在育種生產(chǎn)及科學(xué)實(shí)驗(yàn)過程中均會(huì)不可避免的發(fā)生。本研究所用的奶牛群體系譜來自生產(chǎn)現(xiàn)場，檢測的錯(cuò)誤率為 20%。而郭剛等[9]在同一群體內(nèi)用 Cervus3.0軟件進(jìn)行親子鑒定結(jié)果顯示系譜錯(cuò)誤率為 21%。兩研究結(jié)果基本相符，差別可能是由于所用群體的篩選標(biāo)準(zhǔn)以及判別軟件的不同所致，但都反映了生產(chǎn)現(xiàn)場系譜錯(cuò)誤率較高的實(shí)際情況。本研究所用的杜洛克豬群體系譜錯(cuò)誤率為6%，且其中有部分錯(cuò)誤可能是實(shí)驗(yàn)采樣或基因型檢測過程中出錯(cuò)，因此實(shí)際群體系譜錯(cuò)誤率可能更低。實(shí)際上該場是育種管理相對較為規(guī)范的育種場，從系譜錯(cuò)誤率方面也反映了現(xiàn)場管理工作的規(guī)范程度。因此，系譜錯(cuò)誤檢驗(yàn)對生產(chǎn)管理也有重要意義。除此之外，及時(shí)剔除或糾正錯(cuò)誤系譜可減少育種值估計(jì)誤差，保證選種選配工作的準(zhǔn)確性，提高育種工作的效率。

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