釀酒酵母組蛋白H3 K4L和K36L突變對細胞生長和GAL1、SSA3、PHO5表達的影響

李芬, 楊敬輝, 吳秀麗, 張衛(wèi)林, 王冠峰, 岳曉杰

1．河南師范大學生命科學學院，新鄉(xiāng) 453007；

2．河北農(nóng)業(yè)大學海洋學院，秦皇島 066003；

3．資源微生物與功能分子河南省高校重點實驗室培育基地，新鄉(xiāng) 453007

已知組蛋白可逆的乙?；⒓谆揎棇虮磉_具有重要影響。組蛋白甲基化多發(fā)生在賴氨酸(K)和精氨酸(R)殘基上，組蛋白K甲基化由不同的組蛋白賴氨酸特異性甲基轉(zhuǎn)移酶 (Histone lysine methyltransferases) 和賴氨酸特異性去甲基酶(Lysine-specific demethylase)共同維持，H3 的 K4、K9、K27、K36、K79和H4的K20是常見的甲基化位點，其氨基側(cè)鏈可發(fā)生單、二和三甲基化，發(fā)生在不同組蛋白賴氨酸的甲基化修飾可對轉(zhuǎn)錄起激活或抑制作用。

H3-K4甲基化常與基因激活相關(guān)聯(lián)。對H3-K4不同甲基化及其在不同生物體分布情況的分析顯示，該位點的三甲基化局限于活性轉(zhuǎn)錄基因的5′端，二甲基化則分布于這些基因的主要部分[1]。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)H3-K4的3種甲基化均由Set1催化，H3-K36甲基化則由 Set2負責，兩種酶均與延伸階段的RNA多聚酶Ⅱ相關(guān)聯(lián)[2]。但H3-K36的二、三甲基化都主要分布于活性轉(zhuǎn)錄基因的3′端，參與轉(zhuǎn)錄終止，是活性基因的重要標志[3,4]。組蛋白乙?；０l(fā)生在賴氨酸殘基，有些位點可發(fā)生多種轉(zhuǎn)錄后修飾(如甲基化、乙酰化修飾都可發(fā)生在H3-K4)，且不同修飾之間還相互影響，因而使組蛋白不同轉(zhuǎn)錄后修飾位點的功能研究較為困難。已知H3、H4尾部多個賴氨酸突變都能引起特定的生長和轉(zhuǎn)錄缺陷[5～7]。但對不同組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾位點功能的比較研究及其與特定基因激活間的認識尚很缺乏。

為研究組蛋白不同轉(zhuǎn)錄后修飾位點的功能差異，豐富對“組蛋白密碼”假說的認識，本文以釀酒酵母為材料，構(gòu)建了H3-K4、H3-K36單獨和二者共同突變?yōu)榱涟彼?L)的3種組蛋白突變株，并對其在高溫、高鹽等不同條件下的生長及誘導基因GAL1、SSA3、PHO5等的表達情況進行比較，結(jié)果表明不同轉(zhuǎn)錄后修飾位點突變對細胞生長和誘導基因表達的影響不同，其中H3-K4的修飾對于細胞快速適應不利環(huán)境條件可能更重要。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒

野生型釀酒酵母W303-1a：MATa ade2-1 ura3-1 his3-11,15，leu2-3，112 trp1-1 can1-100和缺失兩拷貝組蛋白H3/H4，由LFH菌株：MATa ade2-1 ura3-1 his3-11,15, leu2-3,112 trp1-1 can1-100, hht1-hhf1Δ::TRP1 hht2-hhf2Δ::LEU2,pRS316: HHT1-HHF1(URA3)、pUC19、pRS313質(zhì)粒。

1.2 質(zhì)粒制備、大腸桿菌轉(zhuǎn)化

參照 Sambrook等[8]的方法進行大腸桿菌轉(zhuǎn)化。

1.3 定點突變及攜帶 H3 K4L和/或 K36L突變的H3/H4拷貝1的pRS313質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

H3 K4L、K36L突變所需引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成，引物序列見表1。將H3 K4L和H3 K36L的引物分別與野生型組蛋白引物H3/4S和H3/4A相匹配，以pUCHHF1-HHT1為模板，經(jīng)兩輪PCR獲得約300 bp和1100 bp兩個短片段；再以二者等摩爾混合物為模板，以H3/4S和 H3/4A為引物進行第三輪PCR擴增得到含H3 K4L和K36L單突變的突變組蛋白H3/H4，將其分別克隆入pUC19并測序。以測序正確的含 H3 K4L的 pUCHHF1-hht1-K4L為模板，將H3 K36L引物分別與H3/4S和 H3/4A相匹配經(jīng)兩輪PCR獲得約300 bp和1100 bp兩個短片段，再將二者等摩爾混合物為模板，以H3/4S和 H3/4A為引物進行第三輪PCR擴增，得到含H3 K4L和H3 K36L雙突變的組蛋白H3/H4，將其克隆入pUC19并測序。將測序正確的3種突變的組蛋白經(jīng)EcoR I和XbaI雙酶切，回收后分別亞克隆入經(jīng)同樣雙酶切的 pRS313載體，得到的陽性克隆經(jīng)EcoR I和XbaI雙酶切驗證。

1.4 酵母轉(zhuǎn)化及基因置換實驗(Plasmid Shuffle)實驗

酵母轉(zhuǎn)化及特定甲基化位點突變株制備、基因置換實驗、組蛋白突變株篩選等參照文獻[9～12]。

1.5 PCR鑒定3種組蛋白突變株

已知 pRS313 攜帶長度為 657 bp 的HIS3 基因，pRS316攜帶長度為801 bp的URA3基因，針對其序列設計引物，序列見表1。采用菌落PCR法鑒定突變株，挑取新鮮轉(zhuǎn)化株單菌落(直徑＞ 2 mm)，在15 μL 2%SDS中渦旋15 s充分混勻，90℃ 孵育4 min，離心1 min，取上清-20℃保存?zhèn)溆?。PCR擴增體系為50 μL：10 ×PCR Buffer 5.0 μL，50 mmol/ L MgCl21.5 μL，10 mmol/L dNTP 1.0 μL，25% Triton X-100 2 μL，引物 10 μmol/L各 0.5 μL，Taq酶 0.5 μL，上述 DNA 粗提液 1 μL ，加ddH2O至50 μL。PCR擴增程序：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，53℃變性1 min，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸 10 min，4℃保存?zhèn)溆谩U增產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 引物序列

1.6 突變株表型檢測

參照李芬等[11,12]的方法，取鑒定正確的各組蛋白突變株和對照單菌落接種于適量培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min 過夜后計數(shù)并調(diào)整各樣品至同一濃度，對各菌株均作5個濃度梯度稀釋，分別接種10 000，2000、400 、80 、16 個細胞于配制好的各種平板上，于 30℃和 39℃培養(yǎng)并觀察各菌株生長，在 2 d、4 d 時拍照。

1.7 GAL1、PHO5和SSA3的誘導表達

GAL1、SSA3誘導表達主要參照李芬等[11,12]的方法。PHO5的誘導：在SD培養(yǎng)基中接種待測菌株，30℃、200 r/min培養(yǎng)至指數(shù)中期即OD值約1.0，取適量培養(yǎng)物作對照，剩余轉(zhuǎn)入低磷培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，分別于90 min、180 min取樣，提取總RNA。

1.8 RNA的提取、RT-PCR和Real-time PCR

RNA提取采用熱酸性酚法[13]。分別取 1 μg總RNA，依照試劑盒說明書42℃ 反轉(zhuǎn)錄1 h，取1/25 cDNA做為模板進行PCR擴增檢測引物的特異性。擴增體系：Primix EX 25 μL，2 μmol / L 引物各 5 μL，無菌雙蒸水補至 50 μL。擴增條件：94℃ 3 min；94℃1 min，53℃ 1 min，72℃ 1 min，25個循環(huán)；最后再72℃ 5 min。定量 PCR 采用 SYBR Green (TaKaRa,Osaka, Japan) 熒光染料法依照說明書進行擴增，擴增體系：SYBR Green Real-time PCR Master mix 12.5 μL，5 μmol/L 引物各 1 μL，模板 2 μL，無菌雙蒸水補至25 μL。 擴增條件：95℃ 1 min，然后 95℃ 15 s和60℃ 1 min，45個循環(huán)。擴增GAL1、SSA3和ACT1基因的引物序列見李芬等[11,12]方法；擴增PHO5基因的引物序列見表1。上述引物進行PCR 擴增反應，ACT1為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算結(jié)果[13,14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 攜帶H3 K4L或/和K36L突變的H3/H4拷貝1的pRS313質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

以pUCHHF1-HHT1為模板，經(jīng)三輪PCR擴增獲得含H3 K4L和K36L單突變的H3/H4全長序列。各PCR產(chǎn)物均與預期吻合，無非特異擴增現(xiàn)象。將其分別克隆入pUC19，酶切鑒定正確(圖1A)，測序無突變；以測序正確的含H3 K4L的pUCHHF1-hht1-K4L為模板，經(jīng)3輪PCR擴增獲得含H3 K4L/K36L雙突變H3/H4全長序列，將其克隆入pUC19測序；酶切鑒定正確(圖1C)，3種突變拷貝測序結(jié)果表明，除引入的K4L和K36L外無其他突變(測序結(jié)果及比對略)。含 3種突變 H3/H4全長的 pUC19質(zhì)粒經(jīng)EcoR I/XbaI雙酶切，回收后分別克隆入經(jīng)上述兩種酶消化的 pRS313載體，得到的陽性克隆經(jīng)EcoR I/XbaI雙酶切驗證正確(圖1：B和D )。

2.2 3個組蛋白特定甲基化位點突變菌株的獲得及鑒定

采用乙酸鋰轉(zhuǎn)化法將分別攜帶突變 H3/H4的PRS313 質(zhì)粒：pRS313 K4L、pRS313 K36L、pRS313 K4L/K36L分別轉(zhuǎn)化LFH菌株，轉(zhuǎn)化液涂SD/-His/+5-FOA平板，已知該菌株基因組H3/H4缺失，其生存所必需的組蛋白H3/H4 由攜帶野生H3/H4拷貝1和URA3篩選標記的 pRS316 提供，當培養(yǎng)基中添加5-FOA 時，含pRS316質(zhì)粒提供野生H3/H4 的細胞會因表達URA3而死亡，丟失上述質(zhì)粒未轉(zhuǎn)入突變拷貝的細胞會因缺乏必需的H3/H4而死亡，只有該質(zhì)粒被含突變H3/H4和HIS3標記的pRS313質(zhì)粒替換的細胞方可存活。故利用SD/-His/+5-FOA篩選可獲得H3-K4、H3-K36和二者共同突變?yōu)榱涟彼岬腟4、S36和D436菌株。

以HIS3特異引物進行菌落 PCR 結(jié)果顯示，得到與預期相符的582 bp的擴增產(chǎn)物(圖2)，而URA3特異引物的PCR除對照得到預期的437 bp產(chǎn)物外，在3突變株中均無擴增條帶；用抗H3-K4 3種甲基化和乙酰化抗體對 H3-K4 (S4) 突變株進行的免疫印跡實驗進一步表明突變株該位點的甲基化和乙?；揎梿适В砻鞯拇_得到了正確的突變株。

圖1 攜帶H3 K4L或/和K36L突變H3/H4拷貝1的pRS313質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

圖2 組蛋白突變株的鑒定

2.3 S4、S36和D436菌株與野生型的表型比較

為研究H3-K4和K36兩重要位點轉(zhuǎn)錄后修飾喪失對酵母生長的影響，將單突變株S4、S36和雙突變株 D436與野生型(WT)在不同條件下的表型進行比較(圖3)。由圖3可以看出，3種組蛋白突變株的生長情況均不如野生型，其中雙突變株D436生長最慢，高溫、高鹽條件下單突變株S4比S36稍慢，表明組蛋白H3-4K和36K的轉(zhuǎn)錄后修飾對細胞維持正常生存非常重要。在對高溫、高鹽等不利環(huán)境條件的快速適應方面，H3-K4的修飾比H3-36K更重要。

圖3 組蛋白不同轉(zhuǎn)錄后修飾位點突變對釀酒酵母生長的影響

2.4 S4、S36和 D436菌株與野生型 GAL1基因表達的比較

因半乳糖為單一碳源時，雙突變株生長明顯較慢，可能是因為H3-K4和H3-K36同時突變影響了GAL基因的表達。本研究以 W303為對照，對 S4、S36 和 D436 菌株的GAL1基因表達進行了RT-PCR(圖 4A)和 qRT-PCR檢測(圖 4B)。由圖 4A 可知，PCR擴增獲得與預期相符的特異性條帶，qRT-PCR結(jié)果顯示：未誘導時，各菌株GAL1基因的表達水平接近甚至趨于零，隨誘導時間的延長該基因的表達均緩慢上升，但不同菌株上升速度明顯不同；各突變株顯著低于野生型(P＜0.01)，表明組蛋白不同轉(zhuǎn)錄后修飾位點突變影響了GAL1表達；雙突變株D436的GAL1表達明顯比單突變株S4、S36低(P＜0.05)，而單突變株 S4低于 S36(P＜0.05)。表明上述兩位點突變使GAL1激活延遲，突變株在半乳糖為單一碳源時的表型缺陷是因該條件下細胞生存所必需的GAL基因激活延遲所致。

2.5 S4、S36和D436菌株與野生型SSA3基因表達的比較

因雙突變株對高溫敏感，可能因組蛋白突變影響了熱激蛋白基因的表達。本研究以野生型為對照，對3種組蛋白突變株的SSA3表達進行了RT-PCR(圖5A)和 qRT-PCR檢測(圖 5B)。圖 5A表明，PCR擴增獲得了與預期相符的特異性條帶。qRT-PCR結(jié)果顯示：未熱激時各菌株SSA3都有基礎水平的表達，熱激10 min后，其SSA3表達均有顯著升高(10 min與 0 min相比較：WT、S36、S4：P＜0.0001； D436：P＜0.05)，隨熱激時間延長各菌株SSA3表達呈下降趨勢(30 min同10 min相比較：P＞0.05)，但不同菌株SSA3表達下降速率明顯不同。其中組蛋白突變株SSA3表達均顯著低于野生型對照，以雙突變株D436最為明顯(WT 同D436相比較：P＜0.001；WT vs S4或S36：P＜0.05)。單突變株S36與S4差別不大(P＞0.05)。表明上述兩位點突變可延遲SSA3激活，組蛋白雙突變株的高溫敏感表型是因該條件下細胞生存所必需的Hsp基因激活延遲所致。

圖4 組蛋白不同轉(zhuǎn)錄后修飾位點突變對釀酒酵母GAL1基因表達的影響

2.6 S4、S36和D436菌株與野生型PHO5基因表達的比較

低磷條件可誘導酵母PHO5基因表達。為檢測組蛋白兩位點突變可造成誘導基因激活延遲，本研究以ACT1為內(nèi)參，對3突變株誘導基因PHO5進行 RT-PCR(圖 6A)和 qRT-PCR(圖 6B)分析。qRT-PCR結(jié)果表明，隨誘導時間的延長各菌株該基因的表達均緩慢上升，但不同菌株上升速率明顯不同；組蛋白突變株的該基因表達顯著低于野生型對照(WT同 S4或 S36相比較：P＜0.05)，其中以組蛋白雙突變株D436最為明顯(WT 同D436相比較:P＜0.01)，表明兩位點突變也顯著延遲了誘導基因PHO5的激活。

圖5 組蛋白不同轉(zhuǎn)錄后修飾位點突變對釀酒酵母SSA3基因表達的影響

圖6 組蛋白不同轉(zhuǎn)錄后修飾位點突變對釀酒酵母PHO5基因表達的影響

3 討 論

發(fā)生在組蛋白特定氨基酸殘基的乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化及ADP核糖基化等修飾對基因轉(zhuǎn)錄活性有重要影響，通過影響組蛋白之間、組蛋白與DNA之間的相互作用而改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，進而調(diào)控基因表達。而且單一的組蛋白修飾常不能單獨起作用，一種修飾常?？梢种苹蛑笇Я硪恍揎椀拇嬖?，形成不同組蛋白修飾的級聯(lián)，而同時存在于組蛋白不同位點的多種修飾則作為一種語言或標志即“組蛋白密碼”被細胞內(nèi)多種非組蛋白所識別，并以此決定基因的表達，組蛋白密碼的存在大大豐富了傳統(tǒng)遺傳密碼的信息含量[4,15]。

為研究H3-K4和H3-K36兩位點功能的差異，豐富對組蛋白密碼假說的認識，本文以釀酒酵母為材料，構(gòu)建了兩位點可能存在的3種形式突變株即：4、36位單突變及兩位點同時突變，并比較了高溫、高鹽等條件下突變株的生長及PHO5、SSA3和GAL1表達情況，結(jié)果表明：同野生型相比，供試條件下各突變株的生長及幾個誘導基因的激活均有不同程度的減慢，雙突變株D436缺陷表型最嚴重。表明組蛋白H3-K4和H3-K36的轉(zhuǎn)錄后修飾對細胞生長和適應不利環(huán)境條件極為重要。

同本實驗室先前對 H3-K14 和 H4-K8 兩乙酰化位點突變株的研究結(jié)果類似[12]，單突變株S4和S36在半乳糖為單一碳源、30℃條件下無明顯差別，但其GAL1激活則有顯著差異(P＜0.05)?？赡芤驗榻M蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾位點突變僅使某些誘導基因的激活延遲，并非關(guān)閉，因組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾功能重疊的影響，隨誘導時間的延長，誘導基因經(jīng)由其他途徑被激活表達，從而使缺陷表型得到逐步緩解。細胞之所以能夠在高溫等不利條件下生存生長，是因能激活相應條件下細胞生存所必需的基因進行表達[12]，故單突變株S4和S36在不同環(huán)境中的差異表型表明同一位點的修飾對不同基因的轉(zhuǎn)錄激活影響不同，H3-K4的修飾對于細胞快速適應高溫等不利條件可能比H3-K36更重要。

組蛋白乙?；稽c H3-K14和 H4-K8突變的3種突變株表型與本文的突變株表型及GAL1激活延遲均非常類似，只是程度不同[12]，因此本研究認為該現(xiàn)象的產(chǎn)生是因組蛋白乙?；?、甲基化修飾相關(guān)聯(lián)所致。已知人類Mll基因與許多不同種類的白血病的發(fā)病機理密切相關(guān)，包括 AML(Acute myeloid leukemia)，Mll基因編碼的蛋白有特異的 H3-K4甲基轉(zhuǎn)移酶活性，H3的乙?；纱龠M其活性增加[16]。酵母中組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶Set1和Set2分別催化H3-K4和 H3-K36的甲基化[17]，作為 NuA4組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和 Rpd3組蛋白去乙酰轉(zhuǎn)移酶復合物組分的Eaf3可識別基因5′端甲基化的H3-K4和H3-K36[18]。其中H3-K36的甲基化除了提供Rpd3S對轉(zhuǎn)錄基因編碼區(qū)的去乙?；盘柾鈁19,20]，還通過抑制組蛋白伴侶分子的作用而阻止乙?；慕M蛋白摻入轉(zhuǎn)錄基因的編碼區(qū)[21]，以去除轉(zhuǎn)錄延伸相關(guān)的乙?；瘡亩种苹騼?nèi)的轉(zhuǎn)錄起始，保證 RNAPII轉(zhuǎn)錄的精確性。Morillon等發(fā)現(xiàn)H3-K4和H3-K36的甲基化與特定基因(Met16和Rrs11B)5'端Esa1 (組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶復合物NuA4的催化亞基)依賴的H4的乙?；嚓P(guān)[19]，而Esa1可通過克服染色質(zhì)的抑制狀態(tài)而促進PHO5的轉(zhuǎn)錄[22]。 由此可見3個組蛋白突變株的表型缺陷和GAL1，SSA3及PHO5等誘導基因表達延遲缺陷可能是因為組蛋白上述轉(zhuǎn)錄后修飾位點突變，不僅造成了該位點甲基化、乙酰化等修飾的喪失，可能也影響了其它位點的乙?；?，進而改變了組蛋白密碼，延遲該條件下細胞生存所必需的基因的激活導致的。

Carvin等[23]研究發(fā)現(xiàn)，Set1 缺失可導致PHO5和GAL1-10表達升高，該結(jié)果與本文H3 K4L突變引起的結(jié)果正好相反。我們認為該差異的產(chǎn)生可能是由于 Set1缺失僅影響 H3-K4的甲基化修飾，而H3 K4L突變則造成該位點各種轉(zhuǎn)錄后修飾的喪失(圖2B)；已知酵母中主要由Set1催化的H3-K4的甲基化修飾僅占H3總量大約34%[24]，剩余的H3-K4還可發(fā)生乙?；绒D(zhuǎn)錄后修飾；故嚴格說S4的表型實際上是H3-K4突變造成該位點轉(zhuǎn)錄后修飾喪失的綜合效應，而非僅由突變位點甲基化喪失引起的效應，這也再次體現(xiàn)了組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾功能的復雜性。Ucar 等[25]運用 CoSBI(Cohernt and shifted bicluster identification)算法，在人 CD4+ T 細胞全基因組范圍確定了包含 19 種轉(zhuǎn)錄后修飾的 873 種組蛋白修飾組合模式，其中 50% 以上的組合模式包含了H2BK5Ac、H4K8Ac、H2BK120Ac、H3K9Ac、3K18Ac、H3K27 Ac、H4K5Ac、H3K4Ac、H3K36Ac 和H3K4me3等10種修飾。Venkatatesh 等[21]對正常和Set2 缺失酵母菌株 6000 個基因的全部甲基化和乙?；V進行了比較，發(fā)現(xiàn)在正常細胞中，Set2 植入的抑制性甲基化標記(H3K36me)位于活躍轉(zhuǎn)錄的基因兩側(cè)，但在Set2 缺失突變株中，這些標記喪失，大部分基因的乙?；瘶擞浄炊日＜毎黾?。由此可見，組蛋白某個位點突變除造成該位點轉(zhuǎn)錄后修飾的喪失外，也影響其他位點的修飾，導致基因組組蛋白修飾模式改變，引發(fā)不同基因表達變化，最終影響表型。雙突變株D436缺陷表型之所以更為嚴重，是因為H3-K4和H3-K36同時突變，兩位點的乙?；图谆揎梿适Вl(fā)基因組組蛋白修飾模式發(fā)生比單突變更大的改變，從而影響更多基因的表達，導致它對各不利條件更敏感。正因為同時存在于組蛋白不同位點的多種修飾以組合模式的形式起作用，因此很難確定上述位點的乙?；图谆揎椀降啄姆N與突變體的表型直接相關(guān)，本文的組蛋白突變株的缺陷表型嚴格上應是相應位點突變導致多種修飾改變而引發(fā)組蛋白修飾模式改變所造成的綜合影響。

日益增多的證據(jù)表明組蛋白乙酰化、甲基化等轉(zhuǎn)錄后修飾不僅影響基因的表達，還與包括癌癥等在內(nèi)的多種人類重大疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此對不同組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾位點的功能差異進行深入的比較研究，不僅可以豐富并加深對組蛋白修飾功能和“組蛋白密碼假說”的認識，對于某些因組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾異常引起的人類重大疾病發(fā)病機理的揭示和治療均至關(guān)重要。

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