HPLC法測(cè)定雙氫青蒿素哌喹片中雙氫青蒿素的含量Δ

周 琳（重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院/重慶市藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶 401121）

雙氫青蒿素哌喹片為雙氫青蒿素和磷酸哌喹的復(fù)方制劑。雙氫青蒿素為青蒿素衍生物[1-2]，是青蒿素體內(nèi)活性物質(zhì)，對(duì)瘧原蟲無性體有較強(qiáng)殺滅作用，能迅速殺滅瘧原蟲，控制疾病癥狀。雙氫青蒿素和磷酸哌喹合用具有協(xié)同作用，可延緩瘧原蟲耐藥性的產(chǎn)生[3]?！吨袊?guó)藥典》2010年版第一增補(bǔ)本收載了雙氫青蒿素哌喹片，并采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定雙氫青蒿素的含量，但該方法不能有效排除磷酸哌喹的影響。本文參考《國(guó)際藥典》2011 V2.2版中雙氫青蒿素的含量測(cè)定方法[4]，對(duì)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中的測(cè)定方法進(jìn)行了改進(jìn)。

1 材料

2695型HPLC儀，包括2998型二極管陣列檢測(cè)器和Empower工作站（美國(guó)Waters公司）；KQ5200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：200 W，頻率：40 kHz）；ME215S型十萬分之一天平（德國(guó)Sartorius公司）。

雙氫青蒿素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100184-201202，純度：99.94%），青蒿素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100202-201004，純度：100%）；雙氫青蒿素哌喹片（華立巖康制藥有限公司，批號(hào)：011110、010212、010512）；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters YMC-Pack ODS-AQ（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：216 nm；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取雙氫青蒿素對(duì)照品約25 mg，精密稱定，置于25 ml量瓶中，加乙腈-水（60∶40，V/V）適量，超聲處理10 min使溶解，放冷，用乙腈-水（60∶40，V/V）稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 臨用新制。取本品10片，精密稱定，研細(xì)，取粉末適量（相當(dāng)于雙氫青蒿素約25 mg），精密稱定，置于25 ml量瓶中，加乙腈-水（60∶40，V/V）適量，超聲處理10 min使溶解，冷卻，用乙腈-水（60∶40，V/V）稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液作為供試品溶液。

2.2.3 空白溶液 按處方比例配制無雙氫青蒿素的陰性對(duì)照品，精密稱取相當(dāng)于雙氫青蒿素約25 mg的粉末，置于25 ml量瓶中，加乙腈-水（60∶40，V/V）適量，超聲處理10 min使溶解，冷卻，用乙腈-水（60∶40，V/V）稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液作為空白溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取雙氫青蒿素、青蒿素對(duì)照品各適量，精密稱定，加乙腈-水（80∶20，V/V）超聲處理10 min，并稀釋制成每1 ml中含雙氫青蒿素和青蒿素各1 mg的系統(tǒng)適用性溶液。精密吸取20 μl注入HPLC儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，雙氫青蒿素（呈兩個(gè)色譜峰）第一個(gè)色譜峰與青蒿素峰相比，相對(duì)保留時(shí)間為0.6；各組分峰之間的分離度＞2.0；理論板數(shù)以β-雙氫青蒿素峰計(jì)算＞3 000。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 空白干擾試驗(yàn)

分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白溶液各20 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。按外標(biāo)法計(jì)算供試品溶液中雙氫青蒿素的含量，色譜見圖1。結(jié)果表明，空白溶液無干擾。

2.5 線性關(guān)系考察

精密稱取雙氫青蒿素對(duì)照品0.482 5 g，置于200 ml量瓶中，加乙腈-水（60∶40，V/V）適量，超聲處理10 min使溶解，置37℃水浴中保溫1 h，冷卻后用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為2.412 mg/ml的雙氫青蒿素標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取雙氫青蒿素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用乙腈-水（60∶40，V/V）稀釋并制成雙氫青蒿素質(zhì)量濃度分別為1.930、0.965 0、0.482 5、0.096 50、0.048 25、0.009 650 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣20 μl測(cè)定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、雙氫青蒿素兩個(gè)峰面積之和（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y＝3.086 8×107x+28.833（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，雙氫青蒿素的質(zhì)量濃度在0.009 650～1.930 mg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.6 雙氫青蒿素雙峰轉(zhuǎn)換

精密稱取雙氫青蒿素原料10.00 mg，精密加入乙腈-水（60∶40，V/V）10 ml，超聲處理10 min使溶解，連續(xù)進(jìn)樣30次（每次運(yùn)行時(shí)間14 min，等度）。結(jié)果，峰面積之和的RSD為0.80%，表明雙氫青蒿素溶液在6 h內(nèi)兩峰面積間的比例變化較大，但兩峰面積之和基本一致，對(duì)測(cè)定結(jié)果無影響。

2.7 定量限與檢測(cè)限

精密稱取雙氫青蒿素對(duì)照品20.04 mg，置于100 ml量瓶中，加乙腈-水（60∶40，V/V）適量，超聲處理10 min使溶解，并稀釋至刻度，搖勻；再精密量取1.0 ml，置于100 ml量瓶中，加乙腈-水（60∶40，V/V）稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣5 μl測(cè)定，記錄色譜圖。按信噪比為10計(jì)算定量限、以信噪比為3計(jì)算檢測(cè)限。結(jié)果，α-雙氫青蒿素的定量限、檢測(cè)限分別為1.78、0.533 ng；β-雙氫青蒿素的定量限、檢測(cè)限分別為7.39、2.22 ng。

2.8 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液20 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以雙氫青蒿素兩個(gè)峰面積之和計(jì)算。結(jié)果，RSD為0.21%，表明儀器精密度良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，在室溫下放置0、1.5、3、4.5、6.5、8.5、10.5、14.5 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣20μl，以雙氫青蒿素兩個(gè)峰面積之和計(jì)算。結(jié)果，RSD為0.31%，說明供試品溶液在14.5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)：011110）適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以雙氫青蒿素兩個(gè)峰面積之和計(jì)算。結(jié)果，RSD為0.5%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.11 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品（批號(hào)：011110）適量，共9份，每3份為一組，分別精密加入相當(dāng)于雙氫青蒿素對(duì)照品質(zhì)量濃度80%、100%、120%的溶液各適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 2 Results of recovery tests（n＝9）

2.12 樣品含量測(cè)定

取3批樣品及雙氫青蒿素對(duì)照品各適量，按照“2.2”項(xiàng)下方法配制供試品和對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算樣品含量，結(jié)果以標(biāo)示量的百分含量表示，詳見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 3 Results of content determination of samples（n＝3）

3 討論

雙氫青蒿素哌喹片現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國(guó)藥典》2010年版第一增補(bǔ)本[5]中，其雙氫青蒿素含量測(cè)定方法為HPLC法，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，本文參照國(guó)際藥典2011 V2.2版[4]將檢測(cè)波長(zhǎng)改為216 nm，既能保證雙氫青蒿素含量測(cè)定的靈敏度，同時(shí)又能相對(duì)減少末端吸收的影響。

現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)流動(dòng)相為乙腈-水（60∶40，V/V），等度洗脫。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，等度洗脫時(shí)磷酸哌喹的保留時(shí)間較長(zhǎng)，不易洗脫，而且磷酸哌喹的色譜峰會(huì)影響雙氫青蒿素的色譜峰，出現(xiàn)峰重疊等現(xiàn)象。因此，本文采用乙腈和水的梯度洗脫方式，將磷酸哌喹洗脫，避免其對(duì)雙氫青蒿素含量測(cè)定的影響。

綜上所述，本方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速，可用于雙氫青蒿素哌喹片中雙氫青蒿素的含量測(cè)定。

[1]韋國(guó)峰，何有成，黃祖良.雙氫青蒿素的制備及其含量測(cè)定[J].右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，23（5）：691.

[2]王滿元.青蒿素類藥物的發(fā)展歷史[J].自然雜志，2012，34（1）：44.

[3]韓濤，代勇.簡(jiǎn)述使用青蒿素聯(lián)合西藥瘧疾的研究進(jìn)展[J].當(dāng)代醫(yī)藥論叢，2015，13（6）：10.

[4]World Health Organization.The international pharmacopoeiaFourth Edition Second Supplement[EB/OL].（2011）[2013-07-25].http：//apps.who.int/phint/en/p/docf/.

[5]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：第一增補(bǔ)本[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：271.