雙氫青蒿素對(duì)宮頸癌U14 裸鼠移植瘤的作用及對(duì)免疫抑制分子的影響

李 穎，王 凱，胡 瓊

（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563003）

宮頸癌是女性常見的生殖道惡性腫瘤［1-2］，其高發(fā)病率躍居女性腫瘤第二位。據(jù)統(tǒng)計(jì)［3］，全球每年有約50 萬新發(fā)宮頸癌病例，26 萬死亡病例，且主要集中在欠發(fā)達(dá)國(guó)家。雖然宮頸癌細(xì)胞學(xué)篩選極大的改善了宮頸癌的發(fā)現(xiàn)和治療［4］，但高危型人乳頭狀瘤病毒（HPV）感染率的提升使宮頸癌發(fā)病率逐年上漲［5］。目前，宮頸癌的治療主要分為手術(shù)治療和同期放化療，其中手術(shù)治療運(yùn)用于宮頸癌早期患者，而同期放化療則主要針對(duì)晚期復(fù)發(fā)性宮頸癌患［6］。同期放化療雖能提升患者的近期療效和生存率，然而患者的5 年生存率僅為66%，同時(shí)部分患者由于無法耐受順鉑等一線化療藥物的毒副而中途退出治療［7］。因此急需開發(fā)具有良好抗腫瘤活性且低毒副作用的化療替代藥物。近年來，雙氫青蒿素（DHA）引起了學(xué)者的廣泛興趣，研究發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素不僅能調(diào)節(jié)免疫，抑制結(jié)腸癌、胃癌等，同時(shí)還能逆轉(zhuǎn)某些耐藥菌株的耐藥性［8-9］。基于此，本研究探討了雙氫青蒿素對(duì)宮頸癌U14 裸鼠移植瘤的抑制作用，并分析了其對(duì)免疫抑制分子的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物、細(xì)胞株 雌性BALB／c 裸鼠15 只，5～6 周齡，體質(zhì)量18～22 g ［廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（粵）2013-0002］。U14 小鼠子宮頸癌細(xì)胞（上海復(fù)祥生物科技有限公司）。

1.2 試藥 雙氫青蒿素（重慶通和藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20050082）；順鉑（齊魯制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20073652）。二甲基亞砜（DMSO）、甲醇（百靈威科技有限公司）。DMEM 高糖培養(yǎng)基（上海微科生物技術(shù)有限公司）；胎牛血清（上海碩欣生物科技有限公司）；白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）、前列腺素E2（PGE2）ELISA 試劑盒（上海仁捷生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 造模、分組、給藥 在含胎牛血清（10%）的DMEM培養(yǎng)基中將U14 宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。隨后將0.2 mL 密度為5×107／mL 的U14 單細(xì)胞懸液注入小鼠左后肢近背部皮下，并以此日為第1 天，觀察、記錄小鼠移植瘤生長(zhǎng)情況。當(dāng)腫瘤直徑≥5 mm 時(shí)，隨機(jī)將小鼠分為對(duì)照組（生理鹽水，肌肉注射0.2 mL）、順鉑組（腹腔注射2 mg／kg）、雙氫青蒿素低、高劑量組（灌胃給藥100、200 mg／kg），每組各5 只，1 d／次，連續(xù)給藥10 d。于第11 天處死小鼠，剝瘤稱重。

2.2 檢測(cè)U14 荷瘤裸鼠生長(zhǎng)狀況及瘤重 自接種瘤細(xì)胞之日起，觀察小鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)、毛發(fā)、皮膚、飲食等一般情況。每隔2 d 稱量并記錄小鼠體質(zhì)量，同時(shí)對(duì)小鼠移植瘤的最長(zhǎng)徑（L）和最短徑（W）進(jìn)行測(cè)量，瘤體積V=0.5×L×W2。處死小鼠當(dāng)日稱取瘤重，抑瘤率=（1-平均瘤重給藥組／平均瘤重對(duì)照組）×100%。

2.3 檢測(cè)免疫抑制分子水平 處死老鼠前經(jīng)摘眼球取血約2 mL，血液靜置于室溫2 h，1 500 r／min 離心20 min，取上清液并于-80 ℃保存。根據(jù)試劑盒說明書分別對(duì)IL-4、IL-6、TGF-β1、PGE2進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)盡量避免血清樣品反復(fù)凍融。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 雙氫青蒿素對(duì)U14 荷瘤裸鼠生長(zhǎng)狀況的影響 接種U14 細(xì)胞后4 天左右，小鼠體內(nèi)成瘤，并伴有局部炎癥反應(yīng)，總成瘤率為100%。給藥前各組小鼠的平均腫瘤大小、體質(zhì)量均無顯著差異（P＞0.05）。給藥期間，對(duì)照組老鼠精神欠佳、進(jìn)食少；順鉑組小鼠精神萎靡，反應(yīng)遲緩，食欲低下；雙氫青蒿素高、低劑量組小鼠正常進(jìn)食，精神狀態(tài)良好。治療后與對(duì)照組比較，順鉑組小鼠體質(zhì)量明顯下降，而雙氫青蒿素高、低劑量組明顯上升（P＜0.05），見表1。

表1 雙氫青蒿素對(duì)U14 荷瘤裸鼠體質(zhì)量的影響（±s， n=5）

表1 雙氫青蒿素對(duì)U14 荷瘤裸鼠體質(zhì)量的影響（±s， n=5）

注：與對(duì)照組比較，?P＜0.05；與順鉑組比較，＃P＜0.05

3.2 雙氫青蒿素對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響 與對(duì)照組比較，順鉑組、雙氫青蒿素組能顯著抑制腫瘤質(zhì)量和腫瘤體積（P＜0.05），雙氫青蒿素低劑量組對(duì)腫瘤體積無顯著影響（P＞0.05），順鉑組對(duì)腫瘤質(zhì)量、腫瘤體積的抑制作用明顯優(yōu)于雙氫青蒿素組（P＜0.05）。給藥治療后，順鉑組抑瘤率最高（59.67%），其次為雙氫青蒿素高劑量組（41.15%），而低劑量組則相對(duì)較低（26.74%）。見表2、圖1。

表2 雙氫青蒿素對(duì)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響（±s， n=5）

表2 雙氫青蒿素對(duì)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響（±s， n=5）

注：與對(duì)照組比較，?P＜0.05；與順鉑組比較，＃P＜0.05；與雙氫青蒿素低劑量組比較，△P＜0.05

圖1 各組裸鼠腫瘤生長(zhǎng)情況

3.3 雙氫青蒿素對(duì)IL-4、IL-6、TGF-β1、PGE2水平的影響與對(duì)照組比較，順鉑組、雙氫青蒿素組血清IL-4、IL-6 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而TGF-β1、PGE2水平顯著降低（P＜0.05）；雙氫青蒿素高劑量組對(duì)TGF-β1、PGE2水平的抑制作用較順鉑組均更顯著（P＜0.05）。見表3。

表3 雙氫青蒿素對(duì)IL-4、IL-6、TGF-β1、PGE2水平的影響（±s， n=5）

表3 雙氫青蒿素對(duì)IL-4、IL-6、TGF-β1、PGE2水平的影響（±s， n=5）

注：與對(duì)照組比較，?P＜0.05；與順鉑組比較，＃P＜0.05；與雙氫青蒿素低劑量組比較，△P＜0.05

4 討論

宮頸癌是一類由人乳頭狀瘤病毒反復(fù)持續(xù)感染而導(dǎo)致的嚴(yán)重危害女性健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率一直直居高不下［10-11］。然而由于其臨床癥狀的隱匿性及早期檢測(cè)手段有效性的欠缺，致使該疾病分布具有一定的區(qū)域性，其中發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率和死亡率占全球80%左右［12］。宮頸癌診斷與治療指南指出宮頸癌的治療主要為化療聯(lián)合手術(shù)和放療［6］，其中順鉑（DDP）為主要的一線化療藥物。然而順鉑屬于周期性非特異性抗癌藥物，其非選擇性特性導(dǎo)致其不僅能與腫瘤細(xì)胞的DNA 結(jié)合，同時(shí)還與血清蛋白、谷胱甘肽、半胱氨酸等還原性生物分子結(jié)合，從而對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生毒性，最終表現(xiàn)為腎毒性、肝毒性、神經(jīng)毒性等多種不良反應(yīng)［13］。因此，開發(fā)新作用機(jī)制、低毒性的抗腫瘤藥物刻不容緩。雙氫青蒿素（DHA）是抗瘧疾倍半萜內(nèi)酯藥物青蒿素的體內(nèi)活性代謝物。研究發(fā)現(xiàn)［8-9，14］，雙氫青蒿素不僅具有較好的抗瘧疾、抗病毒活性，其對(duì)腫瘤如肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等均有抑制作用，甚至還能逆轉(zhuǎn)耐藥腫瘤細(xì)胞的耐藥性。故本研究探討了不同劑量雙氫青蒿素對(duì)宮頸癌裸鼠移植瘤的作用，并對(duì)相應(yīng)的免疫抑制分子表達(dá)水平進(jìn)行了分析。

小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)結(jié)果顯示，順鉑組和雙氫青蒿素治療組的實(shí)體瘤瘤重低于對(duì)照組，其中順鉑組瘤重下降最為明顯，而雙氫青蒿素高劑量治療組實(shí)體瘤重顯著低于低劑量治療組（P＜0.05），與之相應(yīng)的順鉑組的抑瘤率最高（59.67%），雙氫青蒿素高劑量組的抑瘤率（41.15%）高于低劑量組（26.74%），表明順鉑和雙氫青蒿素對(duì)宮頸癌移植瘤有抑制作用，且雙氫青蒿素的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。Hu 等［15］報(bào)道雙氫青蒿素在體外能夠顯著誘導(dǎo)宮頸癌Hela 和Caski 細(xì)胞凋亡［（80.30±6.01）%、（83.32±3.28）%；（11.39±2.32）%、（12.17±2.89）%］。

在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中可分泌多種免疫抑制分子，這些免疫抑制分子促使免疫細(xì)胞不能及時(shí)有效地識(shí)別并清除腫瘤細(xì)胞，造成腫瘤細(xì)胞免疫逃逸而降低腫瘤治療有效率。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究了雙氫青蒿素對(duì)宮頸癌移植瘤小鼠體內(nèi)免疫抑制分子IL-4、IL-6、TGF-β1和PGE2水平的影響。

IL-4 作為免疫調(diào)節(jié)分子參與多種生理過程，可抑制Th1 細(xì)胞產(chǎn)生，促進(jìn)免疫抑制分子IL-10 產(chǎn)生，致使機(jī)體自我免疫功能被抑制［16］；IL-6 是一類促炎因子，能抑制T 淋巴細(xì)胞、抑制自然殺傷細(xì)胞，同時(shí)誘導(dǎo)Th2 細(xì)胞漂移、IL-10 分子分泌，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［17］。與對(duì)照組比較，順鉑和雙氫青蒿素治療組小鼠血清IL-4、IL-6 水平未見明顯變化，表明雙氫青蒿素對(duì)這2 種分子水平無調(diào)節(jié)作用。

TGF-β1是一類與腫瘤息息相關(guān)的息息相關(guān)的分子，在腫瘤初期能上調(diào)細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑水平而抑制腫瘤生長(zhǎng)，但隨著腫瘤的發(fā)展，TGF-β1則通過抑制T 細(xì)胞、誘導(dǎo)Th2 細(xì)胞漂移、抑制自然殺傷細(xì)胞功能而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)［18］；PGE2是花生四烯酸經(jīng)環(huán)氧合酶催化生成的脂質(zhì)代謝物［19］，具有與TGF-β1相似的免疫抑制機(jī)制。結(jié)果顯示，順鉑組和雙氫青蒿素組血清TGF-β1和PGE2水平均顯著低于對(duì)照組，然而順鉑組TGF-β1水平均明顯高于雙氫青蒿素高、低劑量組（P＜0.05），而順鉑組PGE2水平雖與雙氫青蒿素低劑量組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但仍然呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，表明順鉑對(duì)小鼠免疫可能存在損害，而雙氫青蒿素則可能一定程度上逆轉(zhuǎn)免疫損害情況。該結(jié)果與Zhao等［20］研究類似，即在一定劑量時(shí)雙氫青蒿素能影響T 細(xì)胞功能，同時(shí)雙氫青蒿素能調(diào)節(jié)TGF-β ／Smad 途徑而達(dá)到抗炎活性。炎癥是腫瘤發(fā)生發(fā)展中主要的表現(xiàn)癥狀，雙氫青蒿在逆轉(zhuǎn)炎癥微環(huán)境的同時(shí)，下調(diào)TGF-β1和PGE2水平，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答，使機(jī)體的免疫分子能及時(shí)有效的識(shí)別并清除腫瘤細(xì)胞，最終達(dá)到治療腫瘤的效果。

綜上所述，雙氫青蒿素能抑制宮頸癌U14 小鼠移植瘤的生長(zhǎng)，可能通過抑制TGF-β1和PGE2等免疫抑制分子而產(chǎn)生作用。它是青蒿素的體內(nèi)活性代謝產(chǎn)物，具有口服生物利用度高、毒性小等優(yōu)點(diǎn)，可作為潛在抗宮頸癌化療替代藥物。然而，本研究還存在小鼠樣本較少、機(jī)制研究不夠全面等局限性，對(duì)于雙氫青蒿素的具體作用機(jī)理還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。