分子印跡固相萃取液相色譜質(zhì)譜法測定果蔬中20種三唑類農(nóng)藥殘留

胡艷云　徐慧群等

摘 要 以三唑酮為模板分子，三氟甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，合成了對(duì)三唑類農(nóng)藥具有高選擇性的分子印跡聚合物。將印跡聚合物作為固相萃取填料，優(yōu)化分離、富集三唑類農(nóng)藥的最優(yōu)上樣、淋洗和洗脫條件。結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，實(shí)現(xiàn)了果蔬樣品中20種三唑類殺菌劑的高通量特異性檢測。對(duì)樣品前處理過程中的加標(biāo)回收率進(jìn)行了考察，并對(duì)比了分子印跡固相萃取和ENVICarb/SPE小柱的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明：在1.0， 2.0 和10.0 μg/kg加標(biāo)水平下，三唑類農(nóng)藥的回收率在 81.0%～109.7% 之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于12.6%，基質(zhì)效應(yīng)在 91.1%～121.8%之間。方法靈敏、準(zhǔn)確度高，與ENVICarb/SPE 小柱相比，能更有效減弱基體效應(yīng)。

關(guān)鍵詞 分子印跡聚合物； 固相萃取； 三唑類農(nóng)藥

1 引 言

三唑類殺菌劑是指含有1，2，4三唑環(huán)的化合物，由于具有低毒、內(nèi)吸性強(qiáng)、持效期長等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于水果、蔬菜、稻谷等病蟲害的防治 [1～3 ]。隨著三唑類農(nóng)藥的廣泛應(yīng)用，其在農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境中的殘留問題，也逐漸引起人們的重視。對(duì)其在食品和環(huán)境中的殘留分析需要從復(fù)雜的基質(zhì)樣品中將低濃度的目標(biāo)化合物高效提取和凈化，因此對(duì)樣品前處理提出較高要求。而傳統(tǒng)上廣泛使用的固相萃取技術(shù)特異性不強(qiáng)，常發(fā)生雜質(zhì)共萃取現(xiàn)象 [4，5 ]。因此亟待開發(fā)一種快速、靈敏、特異的檢測技術(shù)。

分子印跡聚合物（MIPs）能夠選擇性提取復(fù)雜樣品中的目標(biāo)分子或與目標(biāo)分子結(jié)構(gòu)相似的化合物， 適合作為固相萃取的材料 [6～8 ]。與傳統(tǒng)的固相萃取柱相比，分子印跡固相萃?。∕ISPE）克服了試樣體系復(fù)雜、預(yù)處理繁瑣等不利因素，提高了分析準(zhǔn)確性，更適用于痕量分析 [9～12 ]。三唑類化合物的MISPE方法已有少量文獻(xiàn)報(bào)道，彭暢等 [13 ]采用鄰硝基苯酚為替代模板，4乙烯基吡啶為功能單體，合成了對(duì)7種三唑類化合物具有特異性吸附的印跡聚合物，并應(yīng)用于土壤樣品的分析中。

本研究以三唑酮為模板分子，三氟甲基丙烯酸為功能單體，合成了對(duì)20種三唑類農(nóng)藥具有高選擇性的MIP材料。MISPE結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，實(shí)現(xiàn)了果蔬樣品中三唑類殺菌劑殘留的特異性分離富集和檢測，方法快速、靈敏、準(zhǔn)確度高，與現(xiàn)有SPE技術(shù)相比，有效降低了樣品基質(zhì)效應(yīng)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑與儀器

Agilent 1200液相色譜儀（美國Agilent公司），API 4000液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Applied Biosystems公司）；E811全自動(dòng)索氏提取儀（瑞士Buchi公司）。

三唑酮等農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（Dr. Ehrenstorfer公司）；三氟甲基丙烯酸（Trifluoromethyl acrylic acid， TFMAA），乙二醇二甲基丙烯酸酯（Ethyleneglycol dimethacrylate， Egdma），均為分析純（SigmaAldrich公司），使用前純化；偶氮二異丁腈 （Azobisisbutyronitrile， AIBN，化學(xué)純，上海試劑四廠）；乙酸（分析純，國藥集團(tuán)）；乙腈、乙酸乙酯、甲醇、三氯甲烷、甲苯（色譜純， 美國Tedia公司）。石墨化碳黑SPE柱（ENVICarb/PSA PE，0.5 g， 6 mL，美國SigmaAldrich公司）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取三唑酮等農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（純度>99.5%）各10～20 mg， 溶于乙腈并定容至 100 mL，配制成100～200 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。混合標(biāo)準(zhǔn)中間液以單標(biāo)儲(chǔ)備液稀釋配制而成，濃度為1.0 mg/L， 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.2， 0.1， 0.05， 0.02， 0.01， 0.005和0.001 mg/L）由混合標(biāo)準(zhǔn)中間液用乙腈逐級(jí)稀釋而成。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

色譜柱為Waters C18柱（100 mm × 2.1 mm， 3.5 μm）；柱溫：40 ℃；流速：200 μL/min；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：乙腈（A），10 mmol/L乙酸銨溶液（B）；梯度：0～5 min，10%～30% A；5～15 min，30%～50% A；15～25 min，50%～95% A；25～25.1 min，95%～10% A；25.1～35 min，10% A。

電噴霧電壓：5500 V；霧化氣壓力： 4.14 MPa；氣簾氣壓力：1.38 MPa；輔助氣流速：4.14×103； 離子源溫度：450 ℃；正離子多反應(yīng)監(jiān)測；碰撞氣：Medium；，定性離子對(duì)和定量離子對(duì)的去簇電壓（Declustering potential，DP）、碰撞能量（Collision energy，CE）見表1。

2.4 印跡聚合物制備

將1 mmol三唑酮溶于60 mL三氯甲烷甲苯（2 ∶ 1， V/V）中， 加入4 mmol TFMAA，超聲1 h，使三唑酮與TFMAA充分作用；加入20 mmol EGDMA和60 mg AIBN，超聲0.5 h，充分混溶后，通N2脫氧30 min，真空狀態(tài)下密封；將其放入60 ℃的恒溫水浴中反應(yīng)24 h，取出，干燥，研磨過篩， 以甲醇乙酸（9 ∶ 1， V/V）為提取劑，索氏提取24 h； 用甲醇洗至中性，在25 ℃下真空干燥過夜，得到印跡聚合物MIPs。非印跡聚合物（Nonimprinted polymers，NIPs）的合成除不加分子模板三唑酮外，其余步驟同上。

2.5 三唑酮分子印跡的平衡吸附實(shí)驗(yàn)

取MIPs以及NIPs各50 mg放入具塞試管中，分別加入10 mL不同濃度（0～2.6 mmol/L）的三唑酮溶液，渦旋10 min。計(jì)算其吸附量Q，由Q作結(jié)合等溫線圖，并進(jìn)行Scatchard分析。

聚合物吸附率的計(jì)算公式：Q=（C0-Ct）V/m， 單位（μmol/g）， 其中C0為三唑酮的原始濃度， Ct為三唑酮吸附過程中的平衡濃度， V為三唑酮溶液的體積， m為聚合物的質(zhì)量。

2.6 樣品的預(yù)處理

稱取5.0 g（準(zhǔn)確至0.01 g）粉碎后的樣品于50 mL離心管內(nèi)，加20 mL丙酮乙酸乙酯正己烷（12 ∶ 1， V/V）渦旋混勻提取2 min ，以3000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至濃縮瓶中。在離心管中再加入20 mL提取液，重復(fù)上述操作，合并提取液，在40 ℃以下，濃縮至近干，用2 mL乙腈清洗，用水定容至10 mL，待凈化。

2.7 固相萃取實(shí)驗(yàn)

2.7.1 MISPE柱的制備及萃取條件優(yōu)化 稱取50 mg MIPs加入到空SPE柱中，加入篩板，壓緊制成MISPE柱。將三唑類混標(biāo)溶解在不同的溶劑中配成0.10 mg/L的溶液，取10 mL溶液過柱，采用不同溶劑進(jìn)行淋洗和洗脫，收集洗脫液，吹干后溶解于10 mL乙腈中，用LCMS/MS測定?？疾觳煌纳蠘印⒘芟?、洗脫條件下MISPE柱對(duì)20種三唑類農(nóng)藥的保留能力。

2.7.2 MISPE柱、ENVICarb/PSA柱對(duì)實(shí)際樣品中三唑類物質(zhì)的分離、富集 MISPE：依次用2 mL乙腈、2 mL 20%乙腈（V/V）淋洗活化MISPE柱，將2.6節(jié)預(yù)處理制得的10 mL三唑類溶液，以不超過1.0 mL/min的流速過柱， 用2 mL 20%乙腈洗滌，最后用5 mL乙腈洗脫。

ENVICarb/PSA SPE：柱中加入約2 cm高的無水硫酸鈉，用2 mL乙腈甲苯（3 ∶ 1，V/V）活化柱體。樣品參照2.6節(jié)凈化處理后，用6 mL 乙腈甲苯（3 ∶ 1， V/V）分3次洗滌濃縮瓶。將上述提取液傾入柱中，收集流出液。

2.8 基質(zhì)效應(yīng)

空白樣品按照上述前處理方法處理后，在空白基質(zhì)中添加1.0 mL的1.0 和10.0 mg/L的三唑類標(biāo)準(zhǔn)品，通過比較含樣品基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化合物的峰面積與溶解在純?nèi)軇┲谢衔锏姆迕娣e之比計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。

3 結(jié)果與討論

3.1 致孔劑對(duì)聚合物的影響

致孔劑不僅影響著聚合物的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，且在聚合時(shí)控制非共價(jià)鍵結(jié)合的程度，在分子印跡制備中發(fā)揮著重要作用 [14，15 ]。在非共價(jià)印跡體系中，致孔劑要對(duì)試劑有較高的溶解性，且不干擾模板和單體之間的相互作用。為了研究致孔劑對(duì)聚合物的影響，選用乙腈、氯仿、氯仿甲苯分別為致孔劑合成了分子印跡聚合物，用掃描電鏡進(jìn)行表征。從圖1可見，以乙腈為致孔劑得到的是大孔型聚合物且孔結(jié)構(gòu)不均勻；以氯仿為致孔劑的聚合物孔結(jié)構(gòu)致密，模板分子不易被洗脫，會(huì)造成模板泄露問題，且聚合物堅(jiān)硬、密實(shí)，研磨費(fèi)力。在氯仿中加少量甲苯發(fā)現(xiàn)，聚合物的硬度明顯變軟，呈現(xiàn)高度交聯(lián)的微孔結(jié)構(gòu)，這些孔結(jié)構(gòu)增加了聚合物的表面積，同時(shí)聚合物的多孔結(jié)構(gòu)有效避免了后續(xù)處理中模板分子難以洗脫分離的問題，從而為模板分子的吸附和洗脫提供了條件。

[TS（][HT5”SS] 圖1 不同致孔劑制備的分子印跡聚合物的掃描電鏡圖

Fig.1 Scanning electron microscope photographs of molecularly imprinted polymer （MIPs） prepared by different porogens

A. 乙腈 （Acetonitrile）； B. 三氯甲烷（Chloroform）； C. 三氯甲烷與甲苯的混合溶劑（Chloroformtoluene mixtures）。 [HT5][TS）]

3.2 吸附性能研究

通過靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)研究了三唑酮MIPs和NIPs上的吸附性，吸附等溫線如圖2。隨著三唑酮濃度的增加，MIPs對(duì)三唑酮的吸附容量增加且MIPs的吸附量明顯高于NIPs的吸附量，這是由于三唑酮與三氟甲基丙烯酸之間通過氫鍵形成了特異性的結(jié)合位點(diǎn)。NIPs的內(nèi)部由于不具有特異性的結(jié)合位點(diǎn)，主要依靠聚合物表面的非特異性吸附作用，無法對(duì)模板分子進(jìn)行有效地識(shí)別。對(duì)吸附時(shí)間動(dòng)力學(xué)也做了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，渦旋10 min后，三唑酮在MIPs的吸附達(dá)到飽和。

聚合物吸附率的計(jì)算公式：Q=（C0-Ct）V/m， 單位（μmol/g）， 其中C0為三唑酮的原始濃度， Ct為三唑酮吸附過程中的平衡濃度， V為三唑酮溶液的體積， m為聚合物的質(zhì)量。

2.6 樣品的預(yù)處理

稱取5.0 g（準(zhǔn)確至0.01 g）粉碎后的樣品于50 mL離心管內(nèi)，加20 mL丙酮乙酸乙酯正己烷（12 ∶ 1， V/V）渦旋混勻提取2 min ，以3000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至濃縮瓶中。在離心管中再加入20 mL提取液，重復(fù)上述操作，合并提取液，在40 ℃以下，濃縮至近干，用2 mL乙腈清洗，用水定容至10 mL，待凈化。

2.7 固相萃取實(shí)驗(yàn)

2.7.1 MISPE柱的制備及萃取條件優(yōu)化 稱取50 mg MIPs加入到空SPE柱中，加入篩板，壓緊制成MISPE柱。將三唑類混標(biāo)溶解在不同的溶劑中配成0.10 mg/L的溶液，取10 mL溶液過柱，采用不同溶劑進(jìn)行淋洗和洗脫，收集洗脫液，吹干后溶解于10 mL乙腈中，用LCMS/MS測定?？疾觳煌纳蠘?、淋洗、洗脫條件下MISPE柱對(duì)20種三唑類農(nóng)藥的保留能力。

2.7.2 MISPE柱、ENVICarb/PSA柱對(duì)實(shí)際樣品中三唑類物質(zhì)的分離、富集 MISPE：依次用2 mL乙腈、2 mL 20%乙腈（V/V）淋洗活化MISPE柱，將2.6節(jié)預(yù)處理制得的10 mL三唑類溶液，以不超過1.0 mL/min的流速過柱， 用2 mL 20%乙腈洗滌，最后用5 mL乙腈洗脫。

ENVICarb/PSA SPE：柱中加入約2 cm高的無水硫酸鈉，用2 mL乙腈甲苯（3 ∶ 1，V/V）活化柱體。樣品參照2.6節(jié)凈化處理后，用6 mL 乙腈甲苯（3 ∶ 1， V/V）分3次洗滌濃縮瓶。將上述提取液傾入柱中，收集流出液。

2.8 基質(zhì)效應(yīng)

空白樣品按照上述前處理方法處理后，在空白基質(zhì)中添加1.0 mL的1.0 和10.0 mg/L的三唑類標(biāo)準(zhǔn)品，通過比較含樣品基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化合物的峰面積與溶解在純?nèi)軇┲谢衔锏姆迕娣e之比計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。

3 結(jié)果與討論

3.1 致孔劑對(duì)聚合物的影響

致孔劑不僅影響著聚合物的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，且在聚合時(shí)控制非共價(jià)鍵結(jié)合的程度，在分子印跡制備中發(fā)揮著重要作用 [14，15 ]。在非共價(jià)印跡體系中，致孔劑要對(duì)試劑有較高的溶解性，且不干擾模板和單體之間的相互作用。為了研究致孔劑對(duì)聚合物的影響，選用乙腈、氯仿、氯仿甲苯分別為致孔劑合成了分子印跡聚合物，用掃描電鏡進(jìn)行表征。從圖1可見，以乙腈為致孔劑得到的是大孔型聚合物且孔結(jié)構(gòu)不均勻；以氯仿為致孔劑的聚合物孔結(jié)構(gòu)致密，模板分子不易被洗脫，會(huì)造成模板泄露問題，且聚合物堅(jiān)硬、密實(shí)，研磨費(fèi)力。在氯仿中加少量甲苯發(fā)現(xiàn)，聚合物的硬度明顯變軟，呈現(xiàn)高度交聯(lián)的微孔結(jié)構(gòu)，這些孔結(jié)構(gòu)增加了聚合物的表面積，同時(shí)聚合物的多孔結(jié)構(gòu)有效避免了后續(xù)處理中模板分子難以洗脫分離的問題，從而為模板分子的吸附和洗脫提供了條件。

[TS（][HT5”SS] 圖1 不同致孔劑制備的分子印跡聚合物的掃描電鏡圖

Fig.1 Scanning electron microscope photographs of molecularly imprinted polymer （MIPs） prepared by different porogens

A. 乙腈 （Acetonitrile）； B. 三氯甲烷（Chloroform）； C. 三氯甲烷與甲苯的混合溶劑（Chloroformtoluene mixtures）。 [HT5][TS）]

3.2 吸附性能研究

通過靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)研究了三唑酮MIPs和NIPs上的吸附性，吸附等溫線如圖2。隨著三唑酮濃度的增加，MIPs對(duì)三唑酮的吸附容量增加且MIPs的吸附量明顯高于NIPs的吸附量，這是由于三唑酮與三氟甲基丙烯酸之間通過氫鍵形成了特異性的結(jié)合位點(diǎn)。NIPs的內(nèi)部由于不具有特異性的結(jié)合位點(diǎn)，主要依靠聚合物表面的非特異性吸附作用，無法對(duì)模板分子進(jìn)行有效地識(shí)別。對(duì)吸附時(shí)間動(dòng)力學(xué)也做了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，渦旋10 min后，三唑酮在MIPs的吸附達(dá)到飽和。

聚合物吸附率的計(jì)算公式：Q=（C0-Ct）V/m， 單位（μmol/g）， 其中C0為三唑酮的原始濃度， Ct為三唑酮吸附過程中的平衡濃度， V為三唑酮溶液的體積， m為聚合物的質(zhì)量。

2.6 樣品的預(yù)處理

稱取5.0 g（準(zhǔn)確至0.01 g）粉碎后的樣品于50 mL離心管內(nèi)，加20 mL丙酮乙酸乙酯正己烷（12 ∶ 1， V/V）渦旋混勻提取2 min ，以3000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至濃縮瓶中。在離心管中再加入20 mL提取液，重復(fù)上述操作，合并提取液，在40 ℃以下，濃縮至近干，用2 mL乙腈清洗，用水定容至10 mL，待凈化。

2.7 固相萃取實(shí)驗(yàn)

2.7.1 MISPE柱的制備及萃取條件優(yōu)化 稱取50 mg MIPs加入到空SPE柱中，加入篩板，壓緊制成MISPE柱。將三唑類混標(biāo)溶解在不同的溶劑中配成0.10 mg/L的溶液，取10 mL溶液過柱，采用不同溶劑進(jìn)行淋洗和洗脫，收集洗脫液，吹干后溶解于10 mL乙腈中，用LCMS/MS測定?？疾觳煌纳蠘?、淋洗、洗脫條件下MISPE柱對(duì)20種三唑類農(nóng)藥的保留能力。

2.7.2 MISPE柱、ENVICarb/PSA柱對(duì)實(shí)際樣品中三唑類物質(zhì)的分離、富集 MISPE：依次用2 mL乙腈、2 mL 20%乙腈（V/V）淋洗活化MISPE柱，將2.6節(jié)預(yù)處理制得的10 mL三唑類溶液，以不超過1.0 mL/min的流速過柱， 用2 mL 20%乙腈洗滌，最后用5 mL乙腈洗脫。

ENVICarb/PSA SPE：柱中加入約2 cm高的無水硫酸鈉，用2 mL乙腈甲苯（3 ∶ 1，V/V）活化柱體。樣品參照2.6節(jié)凈化處理后，用6 mL 乙腈甲苯（3 ∶ 1， V/V）分3次洗滌濃縮瓶。將上述提取液傾入柱中，收集流出液。

2.8 基質(zhì)效應(yīng)

空白樣品按照上述前處理方法處理后，在空白基質(zhì)中添加1.0 mL的1.0 和10.0 mg/L的三唑類標(biāo)準(zhǔn)品，通過比較含樣品基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化合物的峰面積與溶解在純?nèi)軇┲谢衔锏姆迕娣e之比計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。

3 結(jié)果與討論

3.1 致孔劑對(duì)聚合物的影響

致孔劑不僅影響著聚合物的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，且在聚合時(shí)控制非共價(jià)鍵結(jié)合的程度，在分子印跡制備中發(fā)揮著重要作用 [14，15 ]。在非共價(jià)印跡體系中，致孔劑要對(duì)試劑有較高的溶解性，且不干擾模板和單體之間的相互作用。為了研究致孔劑對(duì)聚合物的影響，選用乙腈、氯仿、氯仿甲苯分別為致孔劑合成了分子印跡聚合物，用掃描電鏡進(jìn)行表征。從圖1可見，以乙腈為致孔劑得到的是大孔型聚合物且孔結(jié)構(gòu)不均勻；以氯仿為致孔劑的聚合物孔結(jié)構(gòu)致密，模板分子不易被洗脫，會(huì)造成模板泄露問題，且聚合物堅(jiān)硬、密實(shí)，研磨費(fèi)力。在氯仿中加少量甲苯發(fā)現(xiàn)，聚合物的硬度明顯變軟，呈現(xiàn)高度交聯(lián)的微孔結(jié)構(gòu)，這些孔結(jié)構(gòu)增加了聚合物的表面積，同時(shí)聚合物的多孔結(jié)構(gòu)有效避免了后續(xù)處理中模板分子難以洗脫分離的問題，從而為模板分子的吸附和洗脫提供了條件。

[TS（][HT5”SS] 圖1 不同致孔劑制備的分子印跡聚合物的掃描電鏡圖

Fig.1 Scanning electron microscope photographs of molecularly imprinted polymer （MIPs） prepared by different porogens

A. 乙腈 （Acetonitrile）； B. 三氯甲烷（Chloroform）； C. 三氯甲烷與甲苯的混合溶劑（Chloroformtoluene mixtures）。 [HT5][TS）]

3.2 吸附性能研究

通過靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)研究了三唑酮MIPs和NIPs上的吸附性，吸附等溫線如圖2。隨著三唑酮濃度的增加，MIPs對(duì)三唑酮的吸附容量增加且MIPs的吸附量明顯高于NIPs的吸附量，這是由于三唑酮與三氟甲基丙烯酸之間通過氫鍵形成了特異性的結(jié)合位點(diǎn)。NIPs的內(nèi)部由于不具有特異性的結(jié)合位點(diǎn)，主要依靠聚合物表面的非特異性吸附作用，無法對(duì)模板分子進(jìn)行有效地識(shí)別。對(duì)吸附時(shí)間動(dòng)力學(xué)也做了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，渦旋10 min后，三唑酮在MIPs的吸附達(dá)到飽和。