HPLC法測定三葉青中槲皮素和山奈酚含量研究

劉洋+錢麗華

摘 要：目的：建立HPLC法測定三葉青中槲皮素和山奈酚的方法。方法：三葉青組培物樣品經(jīng)甲醇超聲提取，HLB固相萃取小柱凈化，在色譜條件：色譜柱Varian ODS C18（4.6mm×250mm×5μm）、柱溫30℃、流動相0.2%磷酸水-甲醇、流速1.0mL/min、檢測波長360nm下進行測定。結(jié)果：槲皮素和山奈酚的方法檢出限和線性范圍分別為0.05mg/kg和0.05～50μg/mL，且線性范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)均大于0.999 9，加標回收率為71.9%～105.8%，相對標準偏差為1.5%～3.4%。結(jié)論：HPLC法結(jié)合固相萃取技術(shù)可用于測定三葉青中槲皮素和山奈酚的含量，方法檢出限低，結(jié)果準確可靠，重復性好。

關(guān)鍵詞：HPLC；固相萃?。蝗~青；槲皮素；山奈酚

中圖分類號 R284 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）17-26-04

Study on the Determination of Quercetin and Kaempferol in Radix tetrastigmae by High Performance Liquid Chromatography

Liu Yang et al.

（Hangzhou Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310024，China）

Abstract：Objective：A high performance liquid chromatography method for determination of quercetin and kaempferol in Radix tetrastigmae was studied. Method：The samples of tissue cultures were extracted with methanol by ultrasonic and purified with HLB solid phase extraction. Then，the analysis was performed on a Varian ODS C18（4.6mm×250mm×5μm）chromatographic column with methanol and 0.2% phosphoric acid as mobile phase at a flow-rate of 1.0mL/min，the column temperature was 30℃ and the detection wavelength was 360nm.Results：method detection limits for quercetin and kaempferol were both 0.05mg/kg，and good linearity for them over the range of 0.05～50μg/mL（r>0.999 9）. The average recovery and RSD of the method for quercetin and kaempferol were 71.9%～105.8% and 1.5%～3.4%，respectively. Conclusion：high performance liquid chromatography（HPLC）method combined with solid phase extraction technology can be used for the determination of quercetin and kaempferol in Radix tetrastigmae with low method detection limits，high accuracy and good repeatability.

Key words：High performance liquid chromatography；Solid phase extraction；Radix tetrastigmae；Quercetin；Kaempferol

三葉青（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg）是葡萄科崖爬藤屬多年生蔓生藤本植物，為中國特有珍稀中藥植物，是一種民間常用的中草藥，其性涼味苦，具有清熱解毒、祛風化痰、活血止痛的功效[1-2]?；瘜W分析研究發(fā)現(xiàn)，三葉青中主要含有槲皮素、山奈酚、崖爬藤甙崖、異崖爬藤甙等黃酮類化合物，同時含有氨基酸類、萜類、強心苷類、甾體類、多糖類、有機酸類、揮發(fā)油、油脂以及豐富的微量元素，藥理學研究表明，三葉青黃酮類提取物具有抗腫瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡等的作用[3-4]。目前，鑒于三葉青葫蘆塊根人工栽培技術(shù)瓶頸尚未突破以及野生資源過度采挖造成瀕危、被列入了浙江省首批農(nóng)作物種質(zhì)資源保護名錄品種，利用生物技術(shù)來生產(chǎn)三葉青中抗癌黃酮等次生代謝物不失為一條很好的途徑。因此，這就需要明確三葉青組培物中黃酮類化合物的含量，為三葉青的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。本文首次采用高效液相色譜法結(jié)合固相萃取技術(shù)應用于三葉青中槲皮素和山奈酚含量的同時測定，并對三葉青組培物中的含量進行了測定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Waters E2695高效液相色譜儀，VARIAN ProStar高效液相色譜儀，離心機（Eppendorf 5810R），KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器，Waters Oasis HLB固相萃取小柱（6cc/500mg/60μm），Waters-Sep-Pak-C18固相萃取小柱（6cc/500mg/60μm），Waters Oasis MAX固相萃取小柱（6cc/500mg/60μm），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidolph公司）；槲皮素、山奈酚標準品（購自上海安譜科學儀器有限公司）；甲醇、乙腈、磷酸、甲酸、乙酸，色譜純；氨水，分析純；實驗室用水采用去離子水；

1.2 標準溶液的配制（1）標準儲備液：分別準確稱取一定量標準物質(zhì)用甲醇定容至濃度均為1 000.0μg/mL；-18℃避光保存，有效期3個月；（2）標準中間液：準確移取槲皮素、山奈酚標準儲備液各5mL，用甲醇定容至100mL；-4℃避光保存，有效期1個月。

1.3 樣品提取與凈化 準確稱取經(jīng)烘干磨碎過目篩的三葉青組培苗的根、莖、葉以及愈傷組織塊各2.00g于50mL離心管中，加入甲醇提取液35mL，漩渦混勻，超聲（功率100W，頻率40kHz，溫度40℃，時間90min），10 000r離心10min，過濾收集上清液，下層殘渣用10mL提取液重復提取1次，合并上清液，待凈化。HLB固相萃取小柱預先活化，將全部提取液上樣，控制流速約1mL/min；收集液體于雞心瓶并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，甲醇溶液轉(zhuǎn)移并定容至5mL，過0.22μm微孔濾膜，濾液待上機測定。

1.4 色譜條件 色譜柱：Varian ODS C18（4.6mm×250mm×5μm）；柱溫：30℃；流速：1.0mL/min；進樣量：10μL；樣品室溫度：15℃；流動相：A為0.2%磷酸水，B為甲醇；流動相梯度見表1。

表1 色譜分離梯度條件

[時間（min）＼&流動相＼&梯度變化曲線＼&A（%）＼&B（%）＼&0＼&65＼&35＼&6＼&5＼&65＼&35＼&6＼&10＼&52＼&48＼&6＼&28＼&52＼&48＼&6＼&30＼&65＼&35＼&6＼&35＼&65＼&35＼&1＼&]

2 結(jié)果與分析

2.1 波長的選擇 有文獻報道，黃酮類化合物因苯甲?；凸鹌；拇嬖?，主要有2個吸收峰，波長范圍分別為220～280nm和300～400nm[5-6]。采用二極管陣列檢測器對標準使用液經(jīng)過適當稀釋后在200～400nm進行全波長掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在360nm基線平穩(wěn)，色譜特征性強、峰型較好，且峰的分離度較高。故本實驗選擇360nm作為檢測波長。

2.2 色譜條件的優(yōu)化 分別選擇甲醇、乙腈、磷酸、甲酸、乙酸溶液配合作為流動相進行試驗，本文比較了甲醇、乙腈、甲醇+水、乙腈+水、0.1%甲酸水+乙腈、0.1%甲酸水+甲醇、0.1%乙酸水+甲醇、0.1%磷酸水+甲醇、0.2%磷酸水+甲醇、0.3%磷酸水+甲醇、0.5%磷酸水+甲醇作為流動相時的色譜圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動相采用甲醇、乙腈、甲醇+水、乙腈+水時、0.1%甲酸水+乙腈，未出峰；而采用0.1%甲酸水+甲醇、0.1%乙酸水+甲醇、0.1%磷酸水+甲醇時，峰形差、保留時間長且達不到完全分離的目的；而使用0.2%磷酸水+甲醇、0.3%磷酸水+甲醇、0.5%磷酸水+甲醇，色譜圖基線穩(wěn)定，響應值較高、峰的分離度與峰形均較好且無干擾峰；這可能是因為磷酸為無機酸，與乙酸和甲酸相比，能更好的改善峰形和分離度，而0.2%～0.5%磷酸水溶液的pH值為2～3，更有利于減少黃酮類目標物因在色譜柱中吸附而導致的峰難分離與拖尾現(xiàn)象；但是采用磷酸水溶液作為流動性，儀器的系統(tǒng)壓力會高些，因此在保證出峰和分離度的情況下，低濃度的磷酸水溶液是首選。從實際結(jié)果和經(jīng)濟角度考慮，本文采用0.2%磷酸水+甲醇作為流動相。

2.3 樣品前處理方法的選擇

2.3.1 提取液和提取方式的選擇 目前提取三葉青中槲皮素、山奈酚等黃酮類化合物的方法主要是加熱回流和超聲提取[7-10]，本次實驗結(jié)果表明，空白樣品通過超聲提取，槲皮素和山奈酚均有檢出，而采用加熱回流方式提取的平行樣品在同樣檢出條件下卻無檢出，說明針對三葉青中槲皮素和山奈酚的提取，超聲提取方式優(yōu)于加熱回流方式。故本實驗選擇超聲提取作為提取方式。浦錦寶[11]等研究表明，指出在提取液中加入2%鹽酸，對提取槲皮素和山奈酚效果佳。鑒于在強酸條件下三葉青中蘆丁易水解生成槲皮素[12]，從而影響三葉青中槲皮素定量的準確性，本文選擇了70%甲醇水、90%甲醇水、甲醇作為提取液。結(jié)果表明，采用70%甲醇水提取加標樣品，2種目標物均未檢出；90%甲醇水提取加標樣品，槲皮素和山奈酚均未檢測，只有甲醇提取，2種目標物均檢出，且加標回收率大于90%。因此，本實驗選擇甲醇作為提取液。

2.3.2 固相萃取小柱的選擇 黃酮類化合物因分子中有酚羥基而顯酸性，而槲皮素和山奈酚均為極性分子；同時，三葉青提取物中除兩種目標物外，還含有脂類、色素等弱極性的物質(zhì)，這些物質(zhì)的存在不僅會影響目標的分離與檢測，還容易富集在色譜柱上殘留影響柱效；而采用傳統(tǒng)的正己烷、石油醚、乙酸乙酯非極性或弱極性的有機溶劑去除，不僅操作麻煩，而且還會造成目標物的損失，影響分析結(jié)果[13]。本文分別考察了C18、HLB、MAX固相萃取小柱對樣品的凈化效果。Waters Oasis HLB和Waters-Sep-Pak-C18固相萃取小柱預先用10mL甲醇活化，樣品提取液通過HLB和C18小柱后，弱極性的脂類和色素等將會保留在小柱上，收集過柱后的液體，這樣目標物隨著上樣而被收集。另外，Waters Oasis MAX用10mL甲醇、10mL水活化，上樣后目標物保留在小柱上，弱極性的脂類和色素等在小柱上不保留，依次用5%氨水淋洗，5mL2%甲酸甲醇洗脫。實驗結(jié)果表明，經(jīng)MAX凈化后的樣品加標回收率較低，而經(jīng)HLB和C18小柱凈化過的回收率高且平行性好。因此，HLB和C18小柱均能夠作為三葉青提取液凈化過程的選擇對象，鑒于C18小柱價格高，故本文采樣HLB（6cc/500mg/60μm）作為固相萃取柱。

2.4 線性范圍、相關(guān)系數(shù)、方法定量限及精密度的確定 將槲皮素和山奈酚的濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0μg/mL的混合標準系列，依次進樣，以標準溶液濃度X為橫坐標，槲皮素和山奈酚的峰面積Y為縱坐標，在適當?shù)木€性范圍下繪制標準曲線，其中線性范圍、相關(guān)系數(shù)和回歸方程見表2所示。

表2 槲皮素和山奈酚的線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)

[名稱＼&線性范圍（μg/mL）＼&回歸方程＼&相關(guān)系數(shù)（r）＼&槲皮素＼&0.05～50.0＼&Y=30400X+496＼&0.9999＼&山奈酚＼&0.05～50.0＼&Y=39700X+572＼&0.9999＼&]

以槲皮素和山奈酚5.0μg/mL的混合標準溶液重復進樣7次，驗證儀器的精密度，發(fā)現(xiàn)7次進樣的相對標準偏差為0.3%～1.4%。以2～5倍基線噪音響應對應的濃度進行空白加標，以3倍信噪比（S/N）估算方法定量限，2種目標化合物的方法檢出限均為0.05mg/kg?；旌蠘藴室汉腿~青樣品溶液色譜圖如圖1所示。

[0.008

0.006

0.004

0.002

0.000][AU][0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00][時間（min）][色譜圖][A][1][2]

[0.22

0.20

0.18

0.16

0.14

0.12

0.10

0.08

0.06

0.04

0.02

0.00][AU][0.00][2.00][4.00][8.00][6.00][10.00][12.00][14.00][16.00][20.00][18.00][22.00][26.00][24.00][28.00][30.00][32.00][34.00][時間（min）][1][2][B]

A.2種目標物；B.三葉青樣品；1.槲皮素；2.山奈酚

圖1 HPLC色譜

2.5 三葉青不同部位含量測定及加標回收試驗結(jié)果 為準確確定三葉青樣品中目標物的含量并考察了三葉青各組培物基質(zhì)對實驗結(jié)果產(chǎn)生的影響，本實驗選取了三葉青組培苗的根、莖、葉以及愈傷組織塊作為空白樣，結(jié)果列于表3。由表3可知，對不對三葉青各組培物含量的測定及加標回收率試驗，三葉青各組培物中目標物的含量順序是：根>莖>葉>愈傷組織塊，且槲皮素和山奈酚的平均加標回收率范圍為71.9%～105.8%，相對標準偏差為1.5%～3.4%，表明該方法重復性好且定量準確。

表3 樣品分析及加標回收試驗結(jié)果（n=3）

[樣品＼&指標＼&根＼&莖＼&葉＼&愈傷組織塊＼&槲皮素＼&含量（mg/kg）＼&4.66＼&1.03＼&2.23＼&＼&加標量（mg/kg）＼&1.0＼&1.0＼&1.0＼&1.0＼&平均加標回收率（%）＼&83.3＼&91.8＼&79.2＼&103.4＼&RSD（%）＼&2.1＼&1.5＼&3.4＼&＼&山奈酚＼&含量（mg/kg）＼&5.47＼&0.59＼&0.09＼&＼&加標量（mg/kg）＼&1.0＼&1.0＼&1.0＼&1.0＼&平均加標回收率（%）＼&92.3＼&87.5＼&71.9＼&105.8＼&RSD（%）＼&3.3＼&2.9＼&2.5＼&＼&]

3 結(jié)論

本次研究通過對液相條件、前處理條件的優(yōu)化，建立了以甲醇作為提取液、HLB（6cc/500mg/60μm）作為固相萃取柱、0.2%磷酸水-甲醇作為流動相，在波長360nm條件下，同時測定三葉青組培物中槲皮素和山奈酚的高效液相色譜分析法。該方法不僅是首次應用于三葉青組培物中槲皮素和山奈酚的含量測定，而且采用的固相萃取小柱凈化樣品，克服了傳統(tǒng)有機溶劑脫脂、去除色素等雜質(zhì)對目標物含量造成損失的缺點。通過對三葉青組培物中目標物含量的測定，目標物含量的順序是：根>莖>葉>愈傷組織塊，且槲皮素和山奈酚的平均加標回收率范圍為71.9%～105.8%，相對標準偏差為1.5%～3.4%，而且檢出限低、重復性好且定量準確。

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