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    高效液相色譜法鑒別及測(cè)定中藥吳茱萸中的生物胺

    2014-03-04 21:44:53孫艷妮張寧等
    分析化學(xué) 2014年2期
    關(guān)鍵詞:高效液相色譜吳茱萸

    孫艷妮 張寧等

    摘 要 建立了高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定中藥吳茱萸中生物胺的方法。以丹磺酰氯為柱前衍生試劑,采用島津高效液相色譜儀(LC10A),色譜柱SHIMADZUC18 (150 mm × 4.6 mm× 5 μm)進(jìn)行測(cè)定, 確定了最佳色譜條件:乙腈和水為流動(dòng)相,梯度洗脫,DAD檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng)為334 nm,流速為0.8 mL/min,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量20 μL。10種常見生物胺在45 min內(nèi)得到良好的分離,在給定的濃度范圍內(nèi),各生物胺呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)(R2>0.999),精密度RSD<2%,回收率在91.87%~101.35%之間,重現(xiàn)性RSD<8%。結(jié)果表明,吳茱萸葉中含有7種生物胺,枝中含有4種,果中含有5種。這是首次發(fā)現(xiàn)在中藥吳茱萸中存在生物胺類成分。

    關(guān)鍵詞 生物胺; 吳茱萸;衍生化分析; 高效液相色譜

    1 引 言

    吳茱萸是蕓香科植物吳茱萸Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth.、石虎 Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth.var.officinalis (Dode) Huang 或疏毛吳茱萸 Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth.var.bodinieri (Dode) Huang 的干燥近成熟果實(shí)[1],始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為中品。具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽(yáng)止瀉之功效,臨床常用于治療厥陰頭痛、寒疝腹痛、寒濕腳氣、經(jīng)行腹痛、脘腹脹痛、嘔吐吞酸、五更泄瀉等?,F(xiàn)代藥理研究表明, 吳茱萸具有舒張血管、降壓、強(qiáng)心、止瀉、收縮子宮、殺蟲、抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌等活性[2,3]。吳茱萸屬植物化學(xué)成分共計(jì)約240多種,其主要分為生物堿、香豆素、黃酮、萜類、酰胺等。生物堿類成分共計(jì)有104種,其中喹諾酮類59種、吲哚類36種、異喹啉類7和其它2種[4]。從生源關(guān)系分析吲哚類36種生物堿中至少有17種是由色胺衍生的,即此類成分在植物體內(nèi)是由色胺和非色胺部分反應(yīng)生成的。因此,在吳茱萸中色胺的存在是很有可能的,可能因?yàn)楹啃《幢昏b別出來(lái)。同時(shí),其它的生物胺類成分也可能存在。生物胺根據(jù)其結(jié)構(gòu)可分為3類:脂肪族,包括腐胺、尸胺、精胺、亞精胺等,它們是生物活性細(xì)胞必不可少的組成部分,在調(diào)節(jié)核酸與蛋白質(zhì)的合成及生物膜穩(wěn)定性方面起著重要作用;芳香族,包括酪胺、苯乙胺等;雜環(huán)胺,包括組胺、色胺等[5]。也可根據(jù)胺基數(shù)目分為單胺和多胺兩類。單胺主要有酪胺、組胺、腐胺、尸胺、苯乙胺、色胺等。一定量的單胺類化合物對(duì)血管和肌肉有明顯的舒張和收縮作用,對(duì)精神活動(dòng)和大腦皮層有重要的調(diào)節(jié)作用;多胺主要包括精胺和亞精胺,其在生物體的生長(zhǎng)過(guò)程中能促進(jìn)DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成,加速生物體的生長(zhǎng)發(fā)育。微量生物胺是生物體(包括人體)內(nèi)的正?;钚猿煞郑谏锛?xì)胞中具有重要的生理功能。生物胺類成分活性很強(qiáng),它們的存在也應(yīng)該對(duì)吳茱萸的作用有貢獻(xiàn),因此很有必要搞清楚它們存在的種類和含量。

    由于大部分生物胺既沒有紫外吸收又無(wú)熒光,因此目前對(duì)生物胺的研究主要是進(jìn)行衍生化后分析。生物胺的衍生試劑主要有丹磺酰氯(Dansylchloride)[6]、4二甲胺基苯基偶氮苯磺酰(Dabsyl chloride)[7]、2Chloroethylnitrosourea等[8]。丹磺酰氯應(yīng)用最為普遍,生物胺的丹磺酰氯衍生物較為穩(wěn)定, 并同時(shí)具有熒光特性和特異的紫外吸收,既可以用熒光檢測(cè),也可以用紫外檢測(cè)[9],生物胺與丹磺酰氯的反應(yīng)式如下:

    HPLC是檢測(cè)生物胺的常用方法,簡(jiǎn)單有效。為此,本研究以丹磺酰氯為衍生試劑,衍生化色譜法鑒別和測(cè)定吳茱萸中的生物胺類成分。本研究在樣品的前處理過(guò)程中采用液液萃取步驟對(duì)樣品進(jìn)行純化和富集,適用于測(cè)定成分復(fù)雜,生物胺含量更低的樣品。本方法具有通用性廣、靈敏度高、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。

    2 實(shí)驗(yàn)部分

    2.1 儀器與試劑

    島津高效液相色譜儀(LC10A),配備二級(jí)管陣列檢測(cè)器; SHIMADZUC18色譜柱(150 mm × 4.6 mm × 5μm);Milli Q Biocel超純水機(jī)(美國(guó)MilliPoreco公司);移液槍(德國(guó) Eppendorf公司);粉碎機(jī)(黃驊市中興儀器有限公司);SHAC恒溫振蕩器(國(guó)華企業(yè));Anke TDL40B離心機(jī)(Anke公司),F(xiàn)ilter Unit濾膜(0.45 μm)。

    乙腈 (色譜純);丙酮、三氯乙酸、HClO4、丹磺酰氯(分析純);甲胺,色胺,苯乙胺,腐胺,尸胺,組胺,5羥色胺,酪胺,亞精胺,精胺,均購(gòu)于Aladdin公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水,

    吳茱萸樣品:果、葉、枝采自西安植物園,經(jīng)西安植物園張瑩鑒定。

    2.2 色譜條件

    SHIMADZUC18色譜柱(150 mm × 4.6 mm× 5μm); 檢測(cè)波長(zhǎng):334 nm; 流速:0.8 mL/min; 進(jìn)樣量:20 μL; 柱溫:30 ℃。流動(dòng)相:水(A)乙腈(B),采用梯度洗脫:0~7 min,45%~50% B; 7~25 min,50%~90% B; 25~35 min,90% B; 35~40 min,90%~45% B; 40~45 min,45% B。

    2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

    生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確稱取10種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg,用0.1 mol/L HCl溶解,定容至10 mL, 制成標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液備用。取10種生物胺單標(biāo)儲(chǔ)備液各5 mL于100 mL棕色容量瓶中,用0.1 mol/L HCl定容,于4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

    衍生化試劑:精確稱取50 mg丹磺酰氯溶于丙酮,置于10 mL棕色容量瓶中,加入丙酮定容,于4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

    2.4 樣品的制備

    吳茱萸葉、枝、果在60 ℃下烘干至恒重,粉碎,過(guò)50目篩(粒徑0.36 mm)。 分別準(zhǔn)確稱取5.000 g于100 mL錐形瓶中, 加入30 mL 1 mol/L HCl,振蕩提取1 h,過(guò)濾上清液(提取3次,后兩次每次15 mL),合并濾液,4000 r/min離心8 min,上清液定容至50 mL。取20 mL提取液至50 mL離心管,用2 mol/L NaOH調(diào)至pH 12,加入正丁醇二氯甲烷(1 ∶ 1, V/V),渦旋1 min,4000 r/min離心8 min,萃取3次,每次10 mL,合并有機(jī)相,氮?dú)獯蹈?,? mL 0.1 mol/L HCl溶解,取0.5 mL至5 mL棕色容量瓶,進(jìn)行衍生化分析; 取0.4 mL至5 mL棕色容量瓶,作為空白對(duì)照。

    0.5 mL 樣品液以及標(biāo)準(zhǔn)胺混合液,加入1 mL NaHCO3/Na2CO3(pH 10.5),0.5 mL丹磺酰氯,在空白對(duì)照組中加入0.5 mL丙酮代替丹磺酰氯?;靹蚝?,60 ℃水浴45 min,加100 μL氨水除去多余的丹磺酰氯,停止反應(yīng)[10]。室溫放置30 min后,以乙腈定容至5 mL,過(guò)0.45 μm濾膜,待測(cè)。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 樣品的提取與衍生化

    采用三氯乙酸[11]、HClO3 [12]、HCl [10]分別提取吳茱萸葉中的生物胺,結(jié)果見表1,綜合比較,HCl提取效果最好。因此本方法選擇HCl作為生物胺的提取溶劑。衍生溫度、時(shí)間和衍生劑用量是影響丹磺酰氯衍生效果的主要因素。反復(fù)實(shí)驗(yàn)確定的優(yōu)化條件為: 0.5 mL丹磺酰氯(5 g/L),60 ℃水浴45 min。

    3.2 色譜條件的選擇

    在190~800 nm波段對(duì)生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化后進(jìn)行紫外掃描,最大吸收峰為251 nm,在334 nm處也有吸收,但是吳茱萸樣品在251 nm處干擾比較大,因此選取334 nm。

    流動(dòng)相的選擇對(duì)于生物胺的測(cè)定非常重要,本實(shí)驗(yàn)采用水(A)乙腈(B)為流動(dòng)相, 梯度洗脫:

    摘 要 建立了高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定中藥吳茱萸中生物胺的方法。以丹磺酰氯為柱前衍生試劑,采用島津高效液相色譜儀(LC10A),色譜柱SHIMADZUC18 (150 mm × 4.6 mm× 5 μm)進(jìn)行測(cè)定, 確定了最佳色譜條件:乙腈和水為流動(dòng)相,梯度洗脫,DAD檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng)為334 nm,流速為0.8 mL/min,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量20 μL。10種常見生物胺在45 min內(nèi)得到良好的分離,在給定的濃度范圍內(nèi),各生物胺呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)(R2>0.999),精密度RSD<2%,回收率在91.87%~101.35%之間,重現(xiàn)性RSD<8%。結(jié)果表明,吳茱萸葉中含有7種生物胺,枝中含有4種,果中含有5種。這是首次發(fā)現(xiàn)在中藥吳茱萸中存在生物胺類成分。

    關(guān)鍵詞 生物胺; 吳茱萸;衍生化分析; 高效液相色譜

    1 引 言

    吳茱萸是蕓香科植物吳茱萸Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth.、石虎 Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth.var.officinalis (Dode) Huang 或疏毛吳茱萸 Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth.var.bodinieri (Dode) Huang 的干燥近成熟果實(shí)[1],始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為中品。具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽(yáng)止瀉之功效,臨床常用于治療厥陰頭痛、寒疝腹痛、寒濕腳氣、經(jīng)行腹痛、脘腹脹痛、嘔吐吞酸、五更泄瀉等?,F(xiàn)代藥理研究表明, 吳茱萸具有舒張血管、降壓、強(qiáng)心、止瀉、收縮子宮、殺蟲、抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌等活性[2,3]。吳茱萸屬植物化學(xué)成分共計(jì)約240多種,其主要分為生物堿、香豆素、黃酮、萜類、酰胺等。生物堿類成分共計(jì)有104種,其中喹諾酮類59種、吲哚類36種、異喹啉類7和其它2種[4]。從生源關(guān)系分析吲哚類36種生物堿中至少有17種是由色胺衍生的,即此類成分在植物體內(nèi)是由色胺和非色胺部分反應(yīng)生成的。因此,在吳茱萸中色胺的存在是很有可能的,可能因?yàn)楹啃《幢昏b別出來(lái)。同時(shí),其它的生物胺類成分也可能存在。生物胺根據(jù)其結(jié)構(gòu)可分為3類:脂肪族,包括腐胺、尸胺、精胺、亞精胺等,它們是生物活性細(xì)胞必不可少的組成部分,在調(diào)節(jié)核酸與蛋白質(zhì)的合成及生物膜穩(wěn)定性方面起著重要作用;芳香族,包括酪胺、苯乙胺等;雜環(huán)胺,包括組胺、色胺等[5]。也可根據(jù)胺基數(shù)目分為單胺和多胺兩類。單胺主要有酪胺、組胺、腐胺、尸胺、苯乙胺、色胺等。一定量的單胺類化合物對(duì)血管和肌肉有明顯的舒張和收縮作用,對(duì)精神活動(dòng)和大腦皮層有重要的調(diào)節(jié)作用;多胺主要包括精胺和亞精胺,其在生物體的生長(zhǎng)過(guò)程中能促進(jìn)DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成,加速生物體的生長(zhǎng)發(fā)育。微量生物胺是生物體(包括人體)內(nèi)的正?;钚猿煞?,在生物細(xì)胞中具有重要的生理功能。生物胺類成分活性很強(qiáng),它們的存在也應(yīng)該對(duì)吳茱萸的作用有貢獻(xiàn),因此很有必要搞清楚它們存在的種類和含量。

    由于大部分生物胺既沒有紫外吸收又無(wú)熒光,因此目前對(duì)生物胺的研究主要是進(jìn)行衍生化后分析。生物胺的衍生試劑主要有丹磺酰氯(Dansylchloride)[6]、4二甲胺基苯基偶氮苯磺酰(Dabsyl chloride)[7]、2Chloroethylnitrosourea等[8]。丹磺酰氯應(yīng)用最為普遍,生物胺的丹磺酰氯衍生物較為穩(wěn)定, 并同時(shí)具有熒光特性和特異的紫外吸收,既可以用熒光檢測(cè),也可以用紫外檢測(cè)[9],生物胺與丹磺酰氯的反應(yīng)式如下:

    HPLC是檢測(cè)生物胺的常用方法,簡(jiǎn)單有效。為此,本研究以丹磺酰氯為衍生試劑,衍生化色譜法鑒別和測(cè)定吳茱萸中的生物胺類成分。本研究在樣品的前處理過(guò)程中采用液液萃取步驟對(duì)樣品進(jìn)行純化和富集,適用于測(cè)定成分復(fù)雜,生物胺含量更低的樣品。本方法具有通用性廣、靈敏度高、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。

    2 實(shí)驗(yàn)部分

    2.1 儀器與試劑

    島津高效液相色譜儀(LC10A),配備二級(jí)管陣列檢測(cè)器; SHIMADZUC18色譜柱(150 mm × 4.6 mm × 5μm);Milli Q Biocel超純水機(jī)(美國(guó)MilliPoreco公司);移液槍(德國(guó) Eppendorf公司);粉碎機(jī)(黃驊市中興儀器有限公司);SHAC恒溫振蕩器(國(guó)華企業(yè));Anke TDL40B離心機(jī)(Anke公司),F(xiàn)ilter Unit濾膜(0.45 μm)。

    乙腈 (色譜純);丙酮、三氯乙酸、HClO4、丹磺酰氯(分析純);甲胺,色胺,苯乙胺,腐胺,尸胺,組胺,5羥色胺,酪胺,亞精胺,精胺,均購(gòu)于Aladdin公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水,

    吳茱萸樣品:果、葉、枝采自西安植物園,經(jīng)西安植物園張瑩鑒定。

    2.2 色譜條件

    SHIMADZUC18色譜柱(150 mm × 4.6 mm× 5μm); 檢測(cè)波長(zhǎng):334 nm; 流速:0.8 mL/min; 進(jìn)樣量:20 μL; 柱溫:30 ℃。流動(dòng)相:水(A)乙腈(B),采用梯度洗脫:0~7 min,45%~50% B; 7~25 min,50%~90% B; 25~35 min,90% B; 35~40 min,90%~45% B; 40~45 min,45% B。

    2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

    生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確稱取10種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg,用0.1 mol/L HCl溶解,定容至10 mL, 制成標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液備用。取10種生物胺單標(biāo)儲(chǔ)備液各5 mL于100 mL棕色容量瓶中,用0.1 mol/L HCl定容,于4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

    衍生化試劑:精確稱取50 mg丹磺酰氯溶于丙酮,置于10 mL棕色容量瓶中,加入丙酮定容,于4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

    2.4 樣品的制備

    吳茱萸葉、枝、果在60 ℃下烘干至恒重,粉碎,過(guò)50目篩(粒徑0.36 mm)。 分別準(zhǔn)確稱取5.000 g于100 mL錐形瓶中, 加入30 mL 1 mol/L HCl,振蕩提取1 h,過(guò)濾上清液(提取3次,后兩次每次15 mL),合并濾液,4000 r/min離心8 min,上清液定容至50 mL。取20 mL提取液至50 mL離心管,用2 mol/L NaOH調(diào)至pH 12,加入正丁醇二氯甲烷(1 ∶ 1, V/V),渦旋1 min,4000 r/min離心8 min,萃取3次,每次10 mL,合并有機(jī)相,氮?dú)獯蹈?,? mL 0.1 mol/L HCl溶解,取0.5 mL至5 mL棕色容量瓶,進(jìn)行衍生化分析; 取0.4 mL至5 mL棕色容量瓶,作為空白對(duì)照。

    0.5 mL 樣品液以及標(biāo)準(zhǔn)胺混合液,加入1 mL NaHCO3/Na2CO3(pH 10.5),0.5 mL丹磺酰氯,在空白對(duì)照組中加入0.5 mL丙酮代替丹磺酰氯?;靹蚝螅?0 ℃水浴45 min,加100 μL氨水除去多余的丹磺酰氯,停止反應(yīng)[10]。室溫放置30 min后,以乙腈定容至5 mL,過(guò)0.45 μm濾膜,待測(cè)。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 樣品的提取與衍生化

    采用三氯乙酸[11]、HClO3 [12]、HCl [10]分別提取吳茱萸葉中的生物胺,結(jié)果見表1,綜合比較,HCl提取效果最好。因此本方法選擇HCl作為生物胺的提取溶劑。衍生溫度、時(shí)間和衍生劑用量是影響丹磺酰氯衍生效果的主要因素。反復(fù)實(shí)驗(yàn)確定的優(yōu)化條件為: 0.5 mL丹磺酰氯(5 g/L),60 ℃水浴45 min。

    3.2 色譜條件的選擇

    在190~800 nm波段對(duì)生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化后進(jìn)行紫外掃描,最大吸收峰為251 nm,在334 nm處也有吸收,但是吳茱萸樣品在251 nm處干擾比較大,因此選取334 nm。

    流動(dòng)相的選擇對(duì)于生物胺的測(cè)定非常重要,本實(shí)驗(yàn)采用水(A)乙腈(B)為流動(dòng)相, 梯度洗脫:

    摘 要 建立了高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定中藥吳茱萸中生物胺的方法。以丹磺酰氯為柱前衍生試劑,采用島津高效液相色譜儀(LC10A),色譜柱SHIMADZUC18 (150 mm × 4.6 mm× 5 μm)進(jìn)行測(cè)定, 確定了最佳色譜條件:乙腈和水為流動(dòng)相,梯度洗脫,DAD檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng)為334 nm,流速為0.8 mL/min,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量20 μL。10種常見生物胺在45 min內(nèi)得到良好的分離,在給定的濃度范圍內(nèi),各生物胺呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)(R2>0.999),精密度RSD<2%,回收率在91.87%~101.35%之間,重現(xiàn)性RSD<8%。結(jié)果表明,吳茱萸葉中含有7種生物胺,枝中含有4種,果中含有5種。這是首次發(fā)現(xiàn)在中藥吳茱萸中存在生物胺類成分。

    關(guān)鍵詞 生物胺; 吳茱萸;衍生化分析; 高效液相色譜

    1 引 言

    吳茱萸是蕓香科植物吳茱萸Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth.、石虎 Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth.var.officinalis (Dode) Huang 或疏毛吳茱萸 Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth.var.bodinieri (Dode) Huang 的干燥近成熟果實(shí)[1],始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為中品。具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽(yáng)止瀉之功效,臨床常用于治療厥陰頭痛、寒疝腹痛、寒濕腳氣、經(jīng)行腹痛、脘腹脹痛、嘔吐吞酸、五更泄瀉等?,F(xiàn)代藥理研究表明, 吳茱萸具有舒張血管、降壓、強(qiáng)心、止瀉、收縮子宮、殺蟲、抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌等活性[2,3]。吳茱萸屬植物化學(xué)成分共計(jì)約240多種,其主要分為生物堿、香豆素、黃酮、萜類、酰胺等。生物堿類成分共計(jì)有104種,其中喹諾酮類59種、吲哚類36種、異喹啉類7和其它2種[4]。從生源關(guān)系分析吲哚類36種生物堿中至少有17種是由色胺衍生的,即此類成分在植物體內(nèi)是由色胺和非色胺部分反應(yīng)生成的。因此,在吳茱萸中色胺的存在是很有可能的,可能因?yàn)楹啃《幢昏b別出來(lái)。同時(shí),其它的生物胺類成分也可能存在。生物胺根據(jù)其結(jié)構(gòu)可分為3類:脂肪族,包括腐胺、尸胺、精胺、亞精胺等,它們是生物活性細(xì)胞必不可少的組成部分,在調(diào)節(jié)核酸與蛋白質(zhì)的合成及生物膜穩(wěn)定性方面起著重要作用;芳香族,包括酪胺、苯乙胺等;雜環(huán)胺,包括組胺、色胺等[5]。也可根據(jù)胺基數(shù)目分為單胺和多胺兩類。單胺主要有酪胺、組胺、腐胺、尸胺、苯乙胺、色胺等。一定量的單胺類化合物對(duì)血管和肌肉有明顯的舒張和收縮作用,對(duì)精神活動(dòng)和大腦皮層有重要的調(diào)節(jié)作用;多胺主要包括精胺和亞精胺,其在生物體的生長(zhǎng)過(guò)程中能促進(jìn)DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成,加速生物體的生長(zhǎng)發(fā)育。微量生物胺是生物體(包括人體)內(nèi)的正常活性成分,在生物細(xì)胞中具有重要的生理功能。生物胺類成分活性很強(qiáng),它們的存在也應(yīng)該對(duì)吳茱萸的作用有貢獻(xiàn),因此很有必要搞清楚它們存在的種類和含量。

    由于大部分生物胺既沒有紫外吸收又無(wú)熒光,因此目前對(duì)生物胺的研究主要是進(jìn)行衍生化后分析。生物胺的衍生試劑主要有丹磺酰氯(Dansylchloride)[6]、4二甲胺基苯基偶氮苯磺酰(Dabsyl chloride)[7]、2Chloroethylnitrosourea等[8]。丹磺酰氯應(yīng)用最為普遍,生物胺的丹磺酰氯衍生物較為穩(wěn)定, 并同時(shí)具有熒光特性和特異的紫外吸收,既可以用熒光檢測(cè),也可以用紫外檢測(cè)[9],生物胺與丹磺酰氯的反應(yīng)式如下:

    HPLC是檢測(cè)生物胺的常用方法,簡(jiǎn)單有效。為此,本研究以丹磺酰氯為衍生試劑,衍生化色譜法鑒別和測(cè)定吳茱萸中的生物胺類成分。本研究在樣品的前處理過(guò)程中采用液液萃取步驟對(duì)樣品進(jìn)行純化和富集,適用于測(cè)定成分復(fù)雜,生物胺含量更低的樣品。本方法具有通用性廣、靈敏度高、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。

    2 實(shí)驗(yàn)部分

    2.1 儀器與試劑

    島津高效液相色譜儀(LC10A),配備二級(jí)管陣列檢測(cè)器; SHIMADZUC18色譜柱(150 mm × 4.6 mm × 5μm);Milli Q Biocel超純水機(jī)(美國(guó)MilliPoreco公司);移液槍(德國(guó) Eppendorf公司);粉碎機(jī)(黃驊市中興儀器有限公司);SHAC恒溫振蕩器(國(guó)華企業(yè));Anke TDL40B離心機(jī)(Anke公司),F(xiàn)ilter Unit濾膜(0.45 μm)。

    乙腈 (色譜純);丙酮、三氯乙酸、HClO4、丹磺酰氯(分析純);甲胺,色胺,苯乙胺,腐胺,尸胺,組胺,5羥色胺,酪胺,亞精胺,精胺,均購(gòu)于Aladdin公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水,

    吳茱萸樣品:果、葉、枝采自西安植物園,經(jīng)西安植物園張瑩鑒定。

    2.2 色譜條件

    SHIMADZUC18色譜柱(150 mm × 4.6 mm× 5μm); 檢測(cè)波長(zhǎng):334 nm; 流速:0.8 mL/min; 進(jìn)樣量:20 μL; 柱溫:30 ℃。流動(dòng)相:水(A)乙腈(B),采用梯度洗脫:0~7 min,45%~50% B; 7~25 min,50%~90% B; 25~35 min,90% B; 35~40 min,90%~45% B; 40~45 min,45% B。

    2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

    生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確稱取10種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg,用0.1 mol/L HCl溶解,定容至10 mL, 制成標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液備用。取10種生物胺單標(biāo)儲(chǔ)備液各5 mL于100 mL棕色容量瓶中,用0.1 mol/L HCl定容,于4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

    衍生化試劑:精確稱取50 mg丹磺酰氯溶于丙酮,置于10 mL棕色容量瓶中,加入丙酮定容,于4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

    2.4 樣品的制備

    吳茱萸葉、枝、果在60 ℃下烘干至恒重,粉碎,過(guò)50目篩(粒徑0.36 mm)。 分別準(zhǔn)確稱取5.000 g于100 mL錐形瓶中, 加入30 mL 1 mol/L HCl,振蕩提取1 h,過(guò)濾上清液(提取3次,后兩次每次15 mL),合并濾液,4000 r/min離心8 min,上清液定容至50 mL。取20 mL提取液至50 mL離心管,用2 mol/L NaOH調(diào)至pH 12,加入正丁醇二氯甲烷(1 ∶ 1, V/V),渦旋1 min,4000 r/min離心8 min,萃取3次,每次10 mL,合并有機(jī)相,氮?dú)獯蹈桑? mL 0.1 mol/L HCl溶解,取0.5 mL至5 mL棕色容量瓶,進(jìn)行衍生化分析; 取0.4 mL至5 mL棕色容量瓶,作為空白對(duì)照。

    0.5 mL 樣品液以及標(biāo)準(zhǔn)胺混合液,加入1 mL NaHCO3/Na2CO3(pH 10.5),0.5 mL丹磺酰氯,在空白對(duì)照組中加入0.5 mL丙酮代替丹磺酰氯?;靹蚝?,60 ℃水浴45 min,加100 μL氨水除去多余的丹磺酰氯,停止反應(yīng)[10]。室溫放置30 min后,以乙腈定容至5 mL,過(guò)0.45 μm濾膜,待測(cè)。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 樣品的提取與衍生化

    采用三氯乙酸[11]、HClO3 [12]、HCl [10]分別提取吳茱萸葉中的生物胺,結(jié)果見表1,綜合比較,HCl提取效果最好。因此本方法選擇HCl作為生物胺的提取溶劑。衍生溫度、時(shí)間和衍生劑用量是影響丹磺酰氯衍生效果的主要因素。反復(fù)實(shí)驗(yàn)確定的優(yōu)化條件為: 0.5 mL丹磺酰氯(5 g/L),60 ℃水浴45 min。

    3.2 色譜條件的選擇

    在190~800 nm波段對(duì)生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化后進(jìn)行紫外掃描,最大吸收峰為251 nm,在334 nm處也有吸收,但是吳茱萸樣品在251 nm處干擾比較大,因此選取334 nm。

    流動(dòng)相的選擇對(duì)于生物胺的測(cè)定非常重要,本實(shí)驗(yàn)采用水(A)乙腈(B)為流動(dòng)相, 梯度洗脫:

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