電噴霧質(zhì)譜脫溶劑過程的改進(jìn)和應(yīng)用

楊美成　張文　趙蕓　楊鵬翔

摘 要 電噴霧電離（ESI）技術(shù)由于脫溶劑過程中產(chǎn)生的電解作用及溶劑蒸發(fā)作用，使得酸性溶液噴霧液滴中質(zhì)子殘留，pH值降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)在液滴中的空間構(gòu)象受到破壞，所得質(zhì)譜圖無法正確反映蛋白質(zhì)在溶劑中的真實(shí)構(gòu)象。本研究以兩種經(jīng)典蛋白質(zhì)（細(xì)胞色素C和肌紅蛋白）為實(shí)驗(yàn)樣本，通過在ESI源和質(zhì)譜儀進(jìn)樣端中間加入自行設(shè)計(jì)的空氣放大器，產(chǎn)生高流速大流量氣流，改善ESI脫溶劑過程。 結(jié)果表明，電噴霧電離的初始液滴在高流速大流量氣流引發(fā)的激烈碰撞中，被切割為粒徑極小的噴霧液滴，同時(shí)液滴所帶電荷被均分，從而使液滴pH值保持穩(wěn)定，避免因ESI脫溶劑作用而破壞蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象?；诟吡魉俅罅髁繗饬髟贓SI脫溶劑過程的新機(jī)理，在使用商業(yè)化的ESI源時(shí)，著重于鞘氣等脫溶劑輔助氣體的使用和調(diào)節(jié)。通過增大鞘氣的氣流量保持蛋白質(zhì)的生物構(gòu)象。

關(guān)鍵詞 電噴霧電離； 脫溶劑作用； 蛋白質(zhì)空間構(gòu)象； 噴霧液滴

1 引 言

電噴霧電離（Electronspray ionization， ESI）質(zhì)譜已被廣泛應(yīng)用于溶液中蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象研究， 包括肌紅蛋白（Myoglobin）[1]、細(xì)胞色素C（Cytochrome C）[2，3]等為人們所熟知的蛋白。雖然蛋白質(zhì)電荷分布在ESI質(zhì)譜圖上極具特色，但相應(yīng)信息并不能直接反映蛋白質(zhì)在溶液中的構(gòu)象。眾所周知，pH值和溫度對蛋白質(zhì)大分子的構(gòu)象具有重大影響。由于ESI產(chǎn)生的電解作用[4]和脫溶劑作用[5]，在ESI正離子模式下噴出液滴的pH值比溶液實(shí)際pH值低得多[6]。在適用于大分子（包括蛋白質(zhì)）的ESI帶電殘?jiān)Ｐ椭衃5]，液滴的pH值會不斷降低， 直至達(dá)到雷利極限，從而影響液滴中蛋白質(zhì)的構(gòu)象。此外，質(zhì)譜儀的真空度[7]、霧簾氣（Curtain gas） [8，9]、毛細(xì)管溫度[10]以及錐電壓[11]等因素都對蛋白質(zhì)的構(gòu)象具有一定的影響。ESI正離子模式下， 電荷價(jià)態(tài)的高低和電荷分布（Charge state distribution， CSD）的寬窄常被用于表征蛋白質(zhì)在溶液中是緊密折疊還是去折疊的構(gòu)象[11]。蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象常有一個(gè)狹窄的低電荷價(jià)態(tài)的CSD。 在特定條件下（如酸性溶液，高溫和有機(jī)溶劑）， 蛋白質(zhì)天然構(gòu)象因被破壞而導(dǎo)致變性，ESI質(zhì)譜圖中會呈現(xiàn)更寬且更高電荷價(jià)態(tài)的CSD[2，12]。目前，針對在ESI過程中如何保持蛋白質(zhì)構(gòu)象的研究已有大量新方法報(bào)道，包括開發(fā)穩(wěn)定試劑[13]和改進(jìn)ESI源[14～16]等。

本研究對ESI脫溶劑過程進(jìn)行了改進(jìn)，在ESI源和質(zhì)譜儀進(jìn)樣端中間加入自行設(shè)計(jì)的空氣放大器（AA），利用空氣放大器產(chǎn)生的高流速大流量氣流，引發(fā)噴霧液滴的激烈碰撞，在大液滴被均分為若干小液滴的同時(shí)，均分液滴中殘留質(zhì)子，從而使蛋白質(zhì)構(gòu)象得以保持。探討了脫溶劑方法改進(jìn)后的相應(yīng)機(jī)理以及如何利用商品ESI源的輔助氣體盡量保持蛋白質(zhì)等大分子在電噴離子化過程中的生物性狀。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器設(shè)備

LTQ離子阱質(zhì)譜儀：配備商品ESI源（HESIII）的LTQ離子阱質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific Inc.， San Jose， CA），鞘氣，0～50 arb（氣體流量單位）；輔助氣： 5～25 arb；輔助氣的加熱溫度： 20～300 ℃。

ESIAALTQ離子阱質(zhì)譜儀：在自制的ESI源和LTQ離子阱質(zhì)譜儀之間加入空氣放大器（AA）以改進(jìn)電噴霧脫溶劑過程。高流速大流量氣流由空氣放大器產(chǎn)生。如圖1所示，引入空氣放大器的少量壓縮空氣在環(huán)形孔處被加速到超音速，產(chǎn)生了一個(gè)低壓真空區(qū)。周圍大量空氣被吸進(jìn)這個(gè)低壓真空區(qū)，即可在空氣放大器的環(huán)形孔處產(chǎn)生高流速大流量氣流。利用空氣放大器，氣流量4～6 L/min的壓縮空氣可以產(chǎn)生40～70 L/min氣流。為了讓LTQ進(jìn)樣端插入空氣放大器，原加熱毛細(xì)管（內(nèi)徑0.5 mm，長10 cm）換成不銹鋼毛細(xì)管（內(nèi)徑 0.76 mm，長度33 cm）。在相同的粘性流條件下，新的毛細(xì)管提供了與原毛細(xì)管相同的氣通量[17]。自制ESI源中的石英毛細(xì)管噴嘴（內(nèi)徑100 μm，外徑160 μm）直接與樣品注射器相連。通過直接在樣品注射器的針尖處施加高電壓并傳遞到ESI的毛細(xì)管噴嘴，從而實(shí)現(xiàn)電噴霧電離。除在研究氣體流速與蛋白質(zhì)構(gòu)象關(guān)系實(shí)驗(yàn)時(shí)，空氣放大器的氮?dú)膺M(jìn)氣壓力有所改變，其余實(shí)驗(yàn)壓力均設(shè)定在40 psi，相當(dāng)于4.0 L/min的進(jìn)氣流量。出口處的氣體流速估計(jì)為40 L/min，比商業(yè)ESI使用的霧簾氣或鞘氣的氣流量大。優(yōu)化ESI源、空氣放大器和加熱毛細(xì)管的相對位置，以獲得最大的離子化效率。所有實(shí)驗(yàn)樣品流速均設(shè)為3 μL/min。

2.2 樣品試劑

細(xì)胞色素C和肌紅蛋白（Sigma公司），直接用于實(shí)驗(yàn)；固體蛋白質(zhì)樣品直接溶解在水中， 配成5 μmol/L的水溶液， 備用；實(shí)驗(yàn)過程中加入HCl或NH4OH調(diào)節(jié)溶液的pH值。

3 結(jié)果與討論

3.1 溶液pH值、ESI脫溶劑過程及質(zhì)譜圖CSD分布關(guān)系

細(xì)胞色素C是一種被廣泛研究的蛋白質(zhì)[2，3，18]，文獻(xiàn)報(bào)道，運(yùn)用傳統(tǒng)ESI源，當(dāng)溶液pH值在2～3時(shí)，質(zhì)譜圖上呈現(xiàn)典型的雙模雙峰電荷分布。圖2展示了ESI源改進(jìn)前后細(xì)胞色素C在溶液pH值為1.5，2.4和4.6時(shí)的ESI質(zhì)譜圖。當(dāng)空氣放大器關(guān)閉時(shí)，與文獻(xiàn)[2，3]報(bào)道結(jié)果一致： pH值=1.5時(shí)，細(xì)胞色素C的質(zhì)譜圖呈現(xiàn)較寬且高價(jià)態(tài)單模電荷分布，表明蛋白質(zhì)是完全展開的構(gòu)象；pH值=4.6時(shí)，質(zhì)譜圖呈現(xiàn)低價(jià)態(tài)較窄的單模電荷分布，表明細(xì)胞色素C為緊密折疊的構(gòu)象；pH=2.4時(shí)，呈現(xiàn)雙模雙峰電荷分布，表明細(xì)胞色素C此時(shí)處于從緊密折疊到完全展開的過渡狀態(tài)[2]?？諝夥糯笃鞔蜷_時(shí)，不同pH值溶液的細(xì)胞色素C質(zhì)譜圖電荷價(jià)態(tài)向更低價(jià)態(tài)移動；同時(shí)，雙模雙峰電荷分布消失（pH=2.4），呈現(xiàn)出低電荷數(shù)的單模分布。實(shí)驗(yàn)表明，在低pH值條件下，使用高流速大流量氣流可以保持細(xì)胞色素C緊密折疊的生物構(gòu)象。

3.2 采用高流速大流量氣流的ESI脫溶劑過程可保持蛋白質(zhì)構(gòu)象的機(jī)理研究

由圖2Aa可見，高流速大流量氣流降低了細(xì)胞色素C單模電荷分布5個(gè)單位（最高電荷從+16降至+11），而圖2Cc的溶液中并未觀察到明顯的電荷降低。這種明顯的電荷降低不可能僅是由于氣體碰撞時(shí)電荷轉(zhuǎn)移作用[19]引起的，因?yàn)殡姾赊D(zhuǎn)移作用與樣品的pH值無關(guān)，且程度相似。

為了更好地描述高流速大流量氣流帶來的電荷分布變化，使用公式（1）計(jì)算平均電荷數(shù) ：

摘 要 電噴霧電離（ESI）技術(shù)由于脫溶劑過程中產(chǎn)生的電解作用及溶劑蒸發(fā)作用，使得酸性溶液噴霧液滴中質(zhì)子殘留，pH值降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)在液滴中的空間構(gòu)象受到破壞，所得質(zhì)譜圖無法正確反映蛋白質(zhì)在溶劑中的真實(shí)構(gòu)象。本研究以兩種經(jīng)典蛋白質(zhì)（細(xì)胞色素C和肌紅蛋白）為實(shí)驗(yàn)樣本，通過在ESI源和質(zhì)譜儀進(jìn)樣端中間加入自行設(shè)計(jì)的空氣放大器，產(chǎn)生高流速大流量氣流，改善ESI脫溶劑過程。 結(jié)果表明，電噴霧電離的初始液滴在高流速大流量氣流引發(fā)的激烈碰撞中，被切割為粒徑極小的噴霧液滴，同時(shí)液滴所帶電荷被均分，從而使液滴pH值保持穩(wěn)定，避免因ESI脫溶劑作用而破壞蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象?；诟吡魉俅罅髁繗饬髟贓SI脫溶劑過程的新機(jī)理，在使用商業(yè)化的ESI源時(shí)，著重于鞘氣等脫溶劑輔助氣體的使用和調(diào)節(jié)。通過增大鞘氣的氣流量保持蛋白質(zhì)的生物構(gòu)象。

關(guān)鍵詞 電噴霧電離； 脫溶劑作用； 蛋白質(zhì)空間構(gòu)象； 噴霧液滴

1 引 言

電噴霧電離（Electronspray ionization， ESI）質(zhì)譜已被廣泛應(yīng)用于溶液中蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象研究， 包括肌紅蛋白（Myoglobin）[1]、細(xì)胞色素C（Cytochrome C）[2，3]等為人們所熟知的蛋白。雖然蛋白質(zhì)電荷分布在ESI質(zhì)譜圖上極具特色，但相應(yīng)信息并不能直接反映蛋白質(zhì)在溶液中的構(gòu)象。眾所周知，pH值和溫度對蛋白質(zhì)大分子的構(gòu)象具有重大影響。由于ESI產(chǎn)生的電解作用[4]和脫溶劑作用[5]，在ESI正離子模式下噴出液滴的pH值比溶液實(shí)際pH值低得多[6]。在適用于大分子（包括蛋白質(zhì)）的ESI帶電殘?jiān)Ｐ椭衃5]，液滴的pH值會不斷降低， 直至達(dá)到雷利極限，從而影響液滴中蛋白質(zhì)的構(gòu)象。此外，質(zhì)譜儀的真空度[7]、霧簾氣（Curtain gas） [8，9]、毛細(xì)管溫度[10]以及錐電壓[11]等因素都對蛋白質(zhì)的構(gòu)象具有一定的影響。ESI正離子模式下， 電荷價(jià)態(tài)的高低和電荷分布（Charge state distribution， CSD）的寬窄常被用于表征蛋白質(zhì)在溶液中是緊密折疊還是去折疊的構(gòu)象[11]。蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象常有一個(gè)狹窄的低電荷價(jià)態(tài)的CSD。 在特定條件下（如酸性溶液，高溫和有機(jī)溶劑）， 蛋白質(zhì)天然構(gòu)象因被破壞而導(dǎo)致變性，ESI質(zhì)譜圖中會呈現(xiàn)更寬且更高電荷價(jià)態(tài)的CSD[2，12]。目前，針對在ESI過程中如何保持蛋白質(zhì)構(gòu)象的研究已有大量新方法報(bào)道，包括開發(fā)穩(wěn)定試劑[13]和改進(jìn)ESI源[14～16]等。

本研究對ESI脫溶劑過程進(jìn)行了改進(jìn)，在ESI源和質(zhì)譜儀進(jìn)樣端中間加入自行設(shè)計(jì)的空氣放大器（AA），利用空氣放大器產(chǎn)生的高流速大流量氣流，引發(fā)噴霧液滴的激烈碰撞，在大液滴被均分為若干小液滴的同時(shí)，均分液滴中殘留質(zhì)子，從而使蛋白質(zhì)構(gòu)象得以保持。探討了脫溶劑方法改進(jìn)后的相應(yīng)機(jī)理以及如何利用商品ESI源的輔助氣體盡量保持蛋白質(zhì)等大分子在電噴離子化過程中的生物性狀。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器設(shè)備

LTQ離子阱質(zhì)譜儀：配備商品ESI源（HESIII）的LTQ離子阱質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific Inc.， San Jose， CA），鞘氣，0～50 arb（氣體流量單位）；輔助氣： 5～25 arb；輔助氣的加熱溫度： 20～300 ℃。

ESIAALTQ離子阱質(zhì)譜儀：在自制的ESI源和LTQ離子阱質(zhì)譜儀之間加入空氣放大器（AA）以改進(jìn)電噴霧脫溶劑過程。高流速大流量氣流由空氣放大器產(chǎn)生。如圖1所示，引入空氣放大器的少量壓縮空氣在環(huán)形孔處被加速到超音速，產(chǎn)生了一個(gè)低壓真空區(qū)。周圍大量空氣被吸進(jìn)這個(gè)低壓真空區(qū)，即可在空氣放大器的環(huán)形孔處產(chǎn)生高流速大流量氣流。利用空氣放大器，氣流量4～6 L/min的壓縮空氣可以產(chǎn)生40～70 L/min氣流。為了讓LTQ進(jìn)樣端插入空氣放大器，原加熱毛細(xì)管（內(nèi)徑0.5 mm，長10 cm）換成不銹鋼毛細(xì)管（內(nèi)徑 0.76 mm，長度33 cm）。在相同的粘性流條件下，新的毛細(xì)管提供了與原毛細(xì)管相同的氣通量[17]。自制ESI源中的石英毛細(xì)管噴嘴（內(nèi)徑100 μm，外徑160 μm）直接與樣品注射器相連。通過直接在樣品注射器的針尖處施加高電壓并傳遞到ESI的毛細(xì)管噴嘴，從而實(shí)現(xiàn)電噴霧電離。除在研究氣體流速與蛋白質(zhì)構(gòu)象關(guān)系實(shí)驗(yàn)時(shí)，空氣放大器的氮?dú)膺M(jìn)氣壓力有所改變，其余實(shí)驗(yàn)壓力均設(shè)定在40 psi，相當(dāng)于4.0 L/min的進(jìn)氣流量。出口處的氣體流速估計(jì)為40 L/min，比商業(yè)ESI使用的霧簾氣或鞘氣的氣流量大。優(yōu)化ESI源、空氣放大器和加熱毛細(xì)管的相對位置，以獲得最大的離子化效率。所有實(shí)驗(yàn)樣品流速均設(shè)為3 μL/min。

2.2 樣品試劑

細(xì)胞色素C和肌紅蛋白（Sigma公司），直接用于實(shí)驗(yàn)；固體蛋白質(zhì)樣品直接溶解在水中， 配成5 μmol/L的水溶液， 備用；實(shí)驗(yàn)過程中加入HCl或NH4OH調(diào)節(jié)溶液的pH值。

3 結(jié)果與討論

3.1 溶液pH值、ESI脫溶劑過程及質(zhì)譜圖CSD分布關(guān)系

細(xì)胞色素C是一種被廣泛研究的蛋白質(zhì)[2，3，18]，文獻(xiàn)報(bào)道，運(yùn)用傳統(tǒng)ESI源，當(dāng)溶液pH值在2～3時(shí)，質(zhì)譜圖上呈現(xiàn)典型的雙模雙峰電荷分布。圖2展示了ESI源改進(jìn)前后細(xì)胞色素C在溶液pH值為1.5，2.4和4.6時(shí)的ESI質(zhì)譜圖。當(dāng)空氣放大器關(guān)閉時(shí)，與文獻(xiàn)[2，3]報(bào)道結(jié)果一致： pH值=1.5時(shí)，細(xì)胞色素C的質(zhì)譜圖呈現(xiàn)較寬且高價(jià)態(tài)單模電荷分布，表明蛋白質(zhì)是完全展開的構(gòu)象；pH值=4.6時(shí)，質(zhì)譜圖呈現(xiàn)低價(jià)態(tài)較窄的單模電荷分布，表明細(xì)胞色素C為緊密折疊的構(gòu)象；pH=2.4時(shí)，呈現(xiàn)雙模雙峰電荷分布，表明細(xì)胞色素C此時(shí)處于從緊密折疊到完全展開的過渡狀態(tài)[2]?？諝夥糯笃鞔蜷_時(shí)，不同pH值溶液的細(xì)胞色素C質(zhì)譜圖電荷價(jià)態(tài)向更低價(jià)態(tài)移動；同時(shí)，雙模雙峰電荷分布消失（pH=2.4），呈現(xiàn)出低電荷數(shù)的單模分布。實(shí)驗(yàn)表明，在低pH值條件下，使用高流速大流量氣流可以保持細(xì)胞色素C緊密折疊的生物構(gòu)象。

3.2 采用高流速大流量氣流的ESI脫溶劑過程可保持蛋白質(zhì)構(gòu)象的機(jī)理研究

由圖2Aa可見，高流速大流量氣流降低了細(xì)胞色素C單模電荷分布5個(gè)單位（最高電荷從+16降至+11），而圖2Cc的溶液中并未觀察到明顯的電荷降低。這種明顯的電荷降低不可能僅是由于氣體碰撞時(shí)電荷轉(zhuǎn)移作用[19]引起的，因?yàn)殡姾赊D(zhuǎn)移作用與樣品的pH值無關(guān)，且程度相似。

為了更好地描述高流速大流量氣流帶來的電荷分布變化，使用公式（1）計(jì)算平均電荷數(shù) ：

摘 要 電噴霧電離（ESI）技術(shù)由于脫溶劑過程中產(chǎn)生的電解作用及溶劑蒸發(fā)作用，使得酸性溶液噴霧液滴中質(zhì)子殘留，pH值降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)在液滴中的空間構(gòu)象受到破壞，所得質(zhì)譜圖無法正確反映蛋白質(zhì)在溶劑中的真實(shí)構(gòu)象。本研究以兩種經(jīng)典蛋白質(zhì)（細(xì)胞色素C和肌紅蛋白）為實(shí)驗(yàn)樣本，通過在ESI源和質(zhì)譜儀進(jìn)樣端中間加入自行設(shè)計(jì)的空氣放大器，產(chǎn)生高流速大流量氣流，改善ESI脫溶劑過程。 結(jié)果表明，電噴霧電離的初始液滴在高流速大流量氣流引發(fā)的激烈碰撞中，被切割為粒徑極小的噴霧液滴，同時(shí)液滴所帶電荷被均分，從而使液滴pH值保持穩(wěn)定，避免因ESI脫溶劑作用而破壞蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象?；诟吡魉俅罅髁繗饬髟贓SI脫溶劑過程的新機(jī)理，在使用商業(yè)化的ESI源時(shí)，著重于鞘氣等脫溶劑輔助氣體的使用和調(diào)節(jié)。通過增大鞘氣的氣流量保持蛋白質(zhì)的生物構(gòu)象。

關(guān)鍵詞 電噴霧電離； 脫溶劑作用； 蛋白質(zhì)空間構(gòu)象； 噴霧液滴

1 引 言

電噴霧電離（Electronspray ionization， ESI）質(zhì)譜已被廣泛應(yīng)用于溶液中蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象研究， 包括肌紅蛋白（Myoglobin）[1]、細(xì)胞色素C（Cytochrome C）[2，3]等為人們所熟知的蛋白。雖然蛋白質(zhì)電荷分布在ESI質(zhì)譜圖上極具特色，但相應(yīng)信息并不能直接反映蛋白質(zhì)在溶液中的構(gòu)象。眾所周知，pH值和溫度對蛋白質(zhì)大分子的構(gòu)象具有重大影響。由于ESI產(chǎn)生的電解作用[4]和脫溶劑作用[5]，在ESI正離子模式下噴出液滴的pH值比溶液實(shí)際pH值低得多[6]。在適用于大分子（包括蛋白質(zhì)）的ESI帶電殘?jiān)Ｐ椭衃5]，液滴的pH值會不斷降低， 直至達(dá)到雷利極限，從而影響液滴中蛋白質(zhì)的構(gòu)象。此外，質(zhì)譜儀的真空度[7]、霧簾氣（Curtain gas） [8，9]、毛細(xì)管溫度[10]以及錐電壓[11]等因素都對蛋白質(zhì)的構(gòu)象具有一定的影響。ESI正離子模式下， 電荷價(jià)態(tài)的高低和電荷分布（Charge state distribution， CSD）的寬窄常被用于表征蛋白質(zhì)在溶液中是緊密折疊還是去折疊的構(gòu)象[11]。蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象常有一個(gè)狹窄的低電荷價(jià)態(tài)的CSD。 在特定條件下（如酸性溶液，高溫和有機(jī)溶劑）， 蛋白質(zhì)天然構(gòu)象因被破壞而導(dǎo)致變性，ESI質(zhì)譜圖中會呈現(xiàn)更寬且更高電荷價(jià)態(tài)的CSD[2，12]。目前，針對在ESI過程中如何保持蛋白質(zhì)構(gòu)象的研究已有大量新方法報(bào)道，包括開發(fā)穩(wěn)定試劑[13]和改進(jìn)ESI源[14～16]等。

本研究對ESI脫溶劑過程進(jìn)行了改進(jìn)，在ESI源和質(zhì)譜儀進(jìn)樣端中間加入自行設(shè)計(jì)的空氣放大器（AA），利用空氣放大器產(chǎn)生的高流速大流量氣流，引發(fā)噴霧液滴的激烈碰撞，在大液滴被均分為若干小液滴的同時(shí)，均分液滴中殘留質(zhì)子，從而使蛋白質(zhì)構(gòu)象得以保持。探討了脫溶劑方法改進(jìn)后的相應(yīng)機(jī)理以及如何利用商品ESI源的輔助氣體盡量保持蛋白質(zhì)等大分子在電噴離子化過程中的生物性狀。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器設(shè)備

LTQ離子阱質(zhì)譜儀：配備商品ESI源（HESIII）的LTQ離子阱質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific Inc.， San Jose， CA），鞘氣，0～50 arb（氣體流量單位）；輔助氣： 5～25 arb；輔助氣的加熱溫度： 20～300 ℃。

ESIAALTQ離子阱質(zhì)譜儀：在自制的ESI源和LTQ離子阱質(zhì)譜儀之間加入空氣放大器（AA）以改進(jìn)電噴霧脫溶劑過程。高流速大流量氣流由空氣放大器產(chǎn)生。如圖1所示，引入空氣放大器的少量壓縮空氣在環(huán)形孔處被加速到超音速，產(chǎn)生了一個(gè)低壓真空區(qū)。周圍大量空氣被吸進(jìn)這個(gè)低壓真空區(qū)，即可在空氣放大器的環(huán)形孔處產(chǎn)生高流速大流量氣流。利用空氣放大器，氣流量4～6 L/min的壓縮空氣可以產(chǎn)生40～70 L/min氣流。為了讓LTQ進(jìn)樣端插入空氣放大器，原加熱毛細(xì)管（內(nèi)徑0.5 mm，長10 cm）換成不銹鋼毛細(xì)管（內(nèi)徑 0.76 mm，長度33 cm）。在相同的粘性流條件下，新的毛細(xì)管提供了與原毛細(xì)管相同的氣通量[17]。自制ESI源中的石英毛細(xì)管噴嘴（內(nèi)徑100 μm，外徑160 μm）直接與樣品注射器相連。通過直接在樣品注射器的針尖處施加高電壓并傳遞到ESI的毛細(xì)管噴嘴，從而實(shí)現(xiàn)電噴霧電離。除在研究氣體流速與蛋白質(zhì)構(gòu)象關(guān)系實(shí)驗(yàn)時(shí)，空氣放大器的氮?dú)膺M(jìn)氣壓力有所改變，其余實(shí)驗(yàn)壓力均設(shè)定在40 psi，相當(dāng)于4.0 L/min的進(jìn)氣流量。出口處的氣體流速估計(jì)為40 L/min，比商業(yè)ESI使用的霧簾氣或鞘氣的氣流量大。優(yōu)化ESI源、空氣放大器和加熱毛細(xì)管的相對位置，以獲得最大的離子化效率。所有實(shí)驗(yàn)樣品流速均設(shè)為3 μL/min。

2.2 樣品試劑

細(xì)胞色素C和肌紅蛋白（Sigma公司），直接用于實(shí)驗(yàn)；固體蛋白質(zhì)樣品直接溶解在水中， 配成5 μmol/L的水溶液， 備用；實(shí)驗(yàn)過程中加入HCl或NH4OH調(diào)節(jié)溶液的pH值。

3 結(jié)果與討論

3.1 溶液pH值、ESI脫溶劑過程及質(zhì)譜圖CSD分布關(guān)系

細(xì)胞色素C是一種被廣泛研究的蛋白質(zhì)[2，3，18]，文獻(xiàn)報(bào)道，運(yùn)用傳統(tǒng)ESI源，當(dāng)溶液pH值在2～3時(shí)，質(zhì)譜圖上呈現(xiàn)典型的雙模雙峰電荷分布。圖2展示了ESI源改進(jìn)前后細(xì)胞色素C在溶液pH值為1.5，2.4和4.6時(shí)的ESI質(zhì)譜圖。當(dāng)空氣放大器關(guān)閉時(shí)，與文獻(xiàn)[2，3]報(bào)道結(jié)果一致： pH值=1.5時(shí)，細(xì)胞色素C的質(zhì)譜圖呈現(xiàn)較寬且高價(jià)態(tài)單模電荷分布，表明蛋白質(zhì)是完全展開的構(gòu)象；pH值=4.6時(shí)，質(zhì)譜圖呈現(xiàn)低價(jià)態(tài)較窄的單模電荷分布，表明細(xì)胞色素C為緊密折疊的構(gòu)象；pH=2.4時(shí)，呈現(xiàn)雙模雙峰電荷分布，表明細(xì)胞色素C此時(shí)處于從緊密折疊到完全展開的過渡狀態(tài)[2]?？諝夥糯笃鞔蜷_時(shí)，不同pH值溶液的細(xì)胞色素C質(zhì)譜圖電荷價(jià)態(tài)向更低價(jià)態(tài)移動；同時(shí)，雙模雙峰電荷分布消失（pH=2.4），呈現(xiàn)出低電荷數(shù)的單模分布。實(shí)驗(yàn)表明，在低pH值條件下，使用高流速大流量氣流可以保持細(xì)胞色素C緊密折疊的生物構(gòu)象。

3.2 采用高流速大流量氣流的ESI脫溶劑過程可保持蛋白質(zhì)構(gòu)象的機(jī)理研究

由圖2Aa可見，高流速大流量氣流降低了細(xì)胞色素C單模電荷分布5個(gè)單位（最高電荷從+16降至+11），而圖2Cc的溶液中并未觀察到明顯的電荷降低。這種明顯的電荷降低不可能僅是由于氣體碰撞時(shí)電荷轉(zhuǎn)移作用[19]引起的，因?yàn)殡姾赊D(zhuǎn)移作用與樣品的pH值無關(guān)，且程度相似。

為了更好地描述高流速大流量氣流帶來的電荷分布變化，使用公式（1）計(jì)算平均電荷數(shù) ：