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    親水相互作用色譜結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜多重碎裂模式在完整糖肽研究中的應(yīng)用

    2014-03-04 21:15:25江靜應(yīng)萬濤錢小紅
    分析化學(xué) 2014年2期
    關(guān)鍵詞:串聯(lián)質(zhì)譜

    江靜 應(yīng)萬濤錢小紅

    摘要 蛋白質(zhì)的糖基化修飾在生理及病理過程中發(fā)揮著重要作用。由于技術(shù)條件的限制,傳統(tǒng)的糖蛋白分析方法中,通常分別鑒定蛋白質(zhì)和糖鏈兩者的結(jié)構(gòu),而忽略了蛋白質(zhì)與糖鏈的連接關(guān)系。本研究旨在以完整糖肽作為檢測對象,對糖肽中肽段序列和糖鏈結(jié)構(gòu)的同步解析。采用親水相互作用色譜對完整糖肽進(jìn)行分離純化,聯(lián)合生物質(zhì)譜中碰撞誘導(dǎo)解離(CID)、高能誘導(dǎo)解離(HCD)、電子轉(zhuǎn)移解離(ETD)等裂解模式,對完整糖肽的糖基化位點、糖鏈結(jié)構(gòu)、肽段序列等進(jìn)行全方面的解析。結(jié)果表明,親水相互作用色譜中樣品與填料比1∶50可有效富集糖肽,采用30% CID能量,主要產(chǎn)生糖苷鍵斷裂的碎片,為糖鏈的結(jié)構(gòu)組成分析提供了線索;采用25% HCD能量,在低分子量區(qū)域提供了糖鏈的特征離子信息,并產(chǎn)生明確的糖肽Y1特征離子;ETD保留了完整的修飾基團(tuán)而產(chǎn)生肽段骨架的斷裂,可以提供有效的肽段序列信息。本研究結(jié)合親水相互作用色譜與質(zhì)譜儀中的多種碎裂方式,為完整糖肽的結(jié)構(gòu)解析提供了一種快速、有效的研究方案。

    關(guān)鍵詞 親水作用色譜; 串聯(lián)質(zhì)譜; 完整糖肽; 碰撞誘導(dǎo)解離; 高能誘導(dǎo)解離; 電子轉(zhuǎn)移解離

    1引言

    蛋白質(zhì)的糖基化修飾是生物體內(nèi)普遍存在的一種重要翻譯后修飾方式[1,2],但其研究面臨很多挑戰(zhàn)。糖基化修飾具有多樣性。糖基化修飾沒有任何模板[3],而是由200多種糖基轉(zhuǎn)移酶調(diào)控,同一蛋白質(zhì)的不同位點的修飾水平不一,同一位點所攜帶的糖鏈也存在多種結(jié)構(gòu),這給分析技術(shù)和軟件工具帶來了巨大挑戰(zhàn);目前完整糖肽的分析手段有限,主要以質(zhì)譜分析為主,但由于糖肽修飾的微不均一性,及在質(zhì)譜中離子化困難、碎裂情況復(fù)雜等特點,嚴(yán)重制約了完整糖肽的富集和質(zhì)譜分析技術(shù)的發(fā)展。

    2012年,Doerr等[4]總結(jié)了糖蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的經(jīng)典研究手段,并指出主要的研究方法是先將糖鏈從蛋白上釋放,然后分別對兩者進(jìn)行解析,這導(dǎo)致了蛋白與糖鏈之間聯(lián)系的缺失。聚糖結(jié)構(gòu)解析[5],可以解析大量糖鏈結(jié)構(gòu),卻忽視了糖鏈的來源;蛋白部分研究[6],可以得到明確的蛋白序列及大規(guī)模糖基化位點,卻丟失了糖鏈信息。Nakano等[7]研究發(fā)現(xiàn),特異位點的糖基化修飾影響生物學(xué)功能,這表明位點特異性水平的糖基化修飾研究對進(jìn)一步闡釋糖蛋白質(zhì)的生理功能及其在病理過程中的變化具有重要意義。因此,開發(fā)完整糖肽水平的研究方法,保留蛋白質(zhì)與聚糖之間的連接,已成為當(dāng)前的研究熱點。

    完整糖肽的復(fù)雜結(jié)構(gòu)對分析方法的制約,需要從富集和鑒定兩方面解決。首先是由不均一性導(dǎo)致的糖肽低化學(xué)計量水平,及其在質(zhì)譜中離子化效率不高而受非糖肽信號抑制的問題??梢酝ㄟ^完整糖肽的富集與分離,去除非糖肽的干擾而提高糖肽的相對豐度。目前應(yīng)用于富集糖蛋白/糖肽的方法主要有凝集素[8]、二氧化鈦[9]、酰肼[10]和親水相互作用色譜(Hydrophilic interaction liquid chromatography, HILIC)[11]等。其中,HILIC是基于富含多羥基的糖鏈結(jié)構(gòu)的強(qiáng)親水特性,而使糖肽與非糖基化肽段得以分離。HILIC對不同類型的糖肽沒有偏性,且能保持糖鏈結(jié)構(gòu)的完整性,適合作為完整糖肽結(jié)構(gòu)研究中的富集技術(shù)。其次,完整糖肽包含肽段和糖鏈兩部分,其結(jié)構(gòu)和連接方式的差異導(dǎo)致兩者在串聯(lián)質(zhì)譜中的碎裂行為有較大的區(qū)別,僅采用經(jīng)典的碰撞誘導(dǎo)解離(Collisioninduced dissociation, CID)碎裂不能有效得到糖肽的全面信息,Wiesner等[12]指出, 電子轉(zhuǎn)移解離(Electron transfer dissociation, ETD)碎裂模式在蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究中, 可以補充CID的不足而發(fā)揮重要作用,高能誘導(dǎo)解離(High energy collisional dissociation, HCD)可以提供更為豐富的低分子段碎片離子信息。多種碎裂方式聯(lián)合的方法在蛋白質(zhì)組學(xué)中也已經(jīng)得到有效應(yīng)用[13],多種碎裂方式聯(lián)合應(yīng)用的方式可以為完整糖肽研究提供借鑒。

    本研究以完整糖肽作為檢測對象,制作了HILIC富集裝置,并聯(lián)合CID, HCD, ETD等多種串聯(lián)質(zhì)譜碎裂方式,在解析糖鏈結(jié)構(gòu)的同時,獲取肽段序列以及糖基化位點信息,從而實現(xiàn)糖蛋白結(jié)構(gòu)的全面解析。

    2實驗部分

    2.1儀器、試劑與材料

    基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀 (UltrafleXtremeMALDITOF/TOFMS, 德國 Bruker Daltonics公司); 電噴霧電離線性離子阱靜電場軌道阱質(zhì)譜儀(ESILTQOrbitrapXL, 美國Thermo Fisher 公司);離心機(jī)、冷凍干燥離心機(jī)(美國Thermo Fisher 公司);HILIC 小柱(自制,親水相互作用填料為博納艾杰爾科技產(chǎn)品)。

    牛胎球蛋白(Fetuin)、核糖核酸酶B (RNase B)、2,5二羥基苯甲酸(DHB)、乙腈(美國Sigma公司);肽N糖苷酶F (PNGase F, NEB公司); 胰酶Trypsin(測序級, 美國Promega公司); 二硫蘇糖醇(DTT, 美國GE公司),碘乙酰胺(IAA, 比利時Acros公司),三氟乙酸(TFA)、甲酸(美國Fluka公司); 其它試劑均為國產(chǎn)分析純,實驗用水為MilliQ制備的超純水。

    2.2實驗方法

    2.2.1糖蛋白酶解取適量牛胎球蛋白或核糖核酸酶B蛋白,溶解于50 mmol/L NH4HCO3。加入適量DTT,使終濃度為10 mmol/L,56 ℃水浴1 h。加入IAA,使其終濃度為40 mmol/L,暗處反應(yīng)30 min。 加入終濃度為10 mmol/L DTT封閉過量的IAA。按質(zhì)量比1∶50加入胰酶進(jìn)行酶切,37 ℃反應(yīng)過夜。反應(yīng)溶液置于95 ℃水浴10 min,滅活胰酶,終止酶解反應(yīng)。

    2.2.2HILIC小柱富集完整糖肽本實驗使用由移液槍頭自制的HILIC小柱富集純化蛋白酶切混合物中的糖肽。首先,用80%乙腈,1%FA,沖洗活化小柱,然后,濃縮的酶切混合物,溶于50 μL 80%乙腈,1%FA溶液,上樣于HILIC小柱。再用100 μL 80%乙腈,1% FA溶液進(jìn)行脫鹽,重復(fù)3次。最后用5%乙腈,1%FA溶液100 μL洗脫,收集糖肽。洗脫溶液用冷凍干燥離心機(jī)旋干,

    Symbolm@@ 20 ℃保存待用。

    2.2.3MALDITOF/TOFMS分析條件肽段或富集后的糖肽與DHB(2,5二羥基苯甲酸)基質(zhì)1∶1混合點靶。采用正離子反射模式,離子源電壓20 kV,脈沖離子提取電壓18.8 kV,離子提取延時時間110 ns,激光頻率2000 Hz,激光能量50%,每張譜圖共采集1500個激光點,校準(zhǔn)相對誤差≤5 ppm。分析質(zhì)譜圖譜的軟件為FlexAnalysis 3.4。

    2.2.4ESILTQOrbitrapXL分析條件HILIC小柱富集純化得到的完整糖肽樣品,溶解于50%乙腈0.1%甲酸溶液中,用納升級電噴霧離子源直接進(jìn)樣,采用LTQOrbitrapXL質(zhì)譜儀,正離子模式下掃描。采用碰撞誘導(dǎo)解離(CID);高能誘導(dǎo)解離(HCD);電子轉(zhuǎn)移解離(ETD)等不同的碎裂方式進(jìn)行碎裂,然后由Orbitrap進(jìn)行檢測。

    3結(jié)果與討論

    3.1親水相互作用色譜富集完整糖肽

    3.1.1HILIC富集糖肽方法考察本研究采用牛胎球蛋白優(yōu)化HILIC小柱富集步驟。牛胎球蛋白由Trypsin酶切后,經(jīng)PNGase F處理去除糖肽上的糖鏈,未經(jīng)富集的Fetuin蛋白酶切產(chǎn)物如圖1a所示。PNGase F去除糖鏈后,消除了糖鏈不均一性對質(zhì)譜的影響,但由于樣品體系的復(fù)雜性和肽段性質(zhì)的差異,去糖后的糖肽在蛋白的總酶切肽段中的相對信號依然較弱。非糖基化肽段形成的分子離子峰1474.84對其它肽段產(chǎn)生了明顯抑制(圖1a)。例如,去糖后N99位的肽段[M+H]+ m/z 3672.7519,及N156位的肽段[M+H]+ m/z 1741.8247,在譜圖中僅為依稀可見的兩個小峰,而N176位的肽段[M+H]+ m/z 3017.5538甚至難以在譜圖中顯現(xiàn)。

    基于糖肽中糖鏈部分的親水性,以HILIC填料制作的富集小柱可以用于富集并分離樣品中的完整糖肽。蛋白質(zhì)酶切混合物在高有機(jī)相溶液中上樣,糖肽借助其糖鏈部分富含的羥基等親水基團(tuán)而保留在填料表面的水化層中,而疏水性較強(qiáng)的非糖基化肽段在流動相中分配系數(shù)更大而不在小柱上保留。繼續(xù)用高有機(jī)相溶液充分清洗材料上的非特異性吸附后,由高水相溶液洗脫并收集糖肽。這種基于分配機(jī)制分離的色譜方法,選擇合適有機(jī)溶劑含量的流動相,可以減少材料的非特異性吸附,提高富集效率。圖1b 采用20%乙腈1%甲酸溶液洗脫糖肽,圖1c 采用5%乙腈1%甲酸溶液洗脫糖肽,由PNGase F處理富集后產(chǎn)物,經(jīng)MALDITOF質(zhì)譜檢測。圖中可見,兩者都可以有效的富集Fetuin的3個N糖基化肽段。但在20%乙腈洗脫時, m/z 1500~2500區(qū)域內(nèi)有較多非糖肽的雜峰,而在5%乙腈洗脫時,該區(qū)域中非特異性吸附引入的干擾明顯減少。結(jié)果表明,采用5%乙腈1%甲酸溶液洗脫糖肽可以進(jìn)一步去除非糖肽的干擾,獲得更好的糖肽富集效果。

    采用移液器槍頭作為HILIC填料的載體,可以根據(jù)目標(biāo)樣品的多少自由選擇合適量的HILIC填料。合適的填料與樣品比例,可以保證較好的富集效果,減少吸附損失的影響,也可以防止樣品過載。固定填料的用量,依次提高蛋白質(zhì)的上樣量,即選取樣品與填料質(zhì)量比為1∶1000,1∶500,1∶50,1∶10時對Fetuin蛋白的酶切產(chǎn)物進(jìn)行富集。對在洗脫組分和上樣流出組分的糖肽信號進(jìn)行分析,以3個糖肽中信號強(qiáng)度最高的N156位糖肽的去除糖鏈后肽段[M+H]+ m/z 1741.8247(序列為LCPDCPLLAPLNDSR)的相對強(qiáng)度作為參照,結(jié)果如圖2所示。在樣品與填料質(zhì)量比為1∶10,結(jié)合組分和流出組分中的糖肽信號都最高,[TS(][HT5”SS]圖2不同HILIC填料與糖蛋白樣品的比例對富集效果的影響

    Fig.2Relative intensity of glycopeptides under different reaction ratio between glycoprotein and HILIC material

    1. 洗脫組分(Elution); 2. 流出組分(Flow through)。[HT5][TS)]因此以該條件下的糖肽信號為100%,分別計算其它條件下結(jié)合組分和流出組分中的糖肽相對強(qiáng)度。當(dāng)選取樣品與填料質(zhì)量比為1∶1000和1∶500時,雖然流出組分中未結(jié)合的糖肽比例低于20%,但洗脫組分中的糖肽信號也小于40%。當(dāng)樣品與填料質(zhì)量比為1∶50時,結(jié)合組分中糖肽得到有效的富集,而流出組分中糖肽信號仍低于20%。樣品與填料比例為1∶10時,上樣流出組分中的糖肽相對信號大幅增加,表明此時糖肽已經(jīng)過載。因此,在制作HILIC小柱時,采用樣品與填料質(zhì)量比為1∶50時富集效果顯著,并能得到較好的回收率。

    3.1.2RNase B完整糖肽制備與純化RNase B經(jīng)過Trypsin酶切,在DHB基質(zhì)輔助下,得到糖肽和肽段混合物的一級質(zhì)譜圖,如圖3a所示。由于糖基化的微不均一性,核糖核苷酶B的同一糖基化位點含有5個不同糖鏈長度的高甘露糖(Mannose, Man),即在化學(xué)計量水平,一個肽段的豐度被分散到5個糖肽上。對于相對含量較低的糖型,受到其它肽段的干擾更為嚴(yán)重,而不利于質(zhì)譜的選擇與檢測。經(jīng)過HILIC小柱富集后,酶切產(chǎn)物中的非糖基化肽段被有效的去除,僅留下5個清晰的糖肽(圖3b),為肽段序列SRNLTK上分別連接Man5,Man6,Man7,Man8,Man9等不同長度的高甘露糖糖鏈。

    3.2多重碎裂方式互補,全面解析完整糖肽

    3.2.1完整糖肽在經(jīng)典CID模式下的碎裂碰撞誘導(dǎo)解離(CID)是生物質(zhì)譜中肽段序列分析最為常用的碎裂模式,肽段活化碰撞后主要產(chǎn)生b、y系碎片離子而得以解析序列。但糖基化修飾的糖鏈結(jié)構(gòu)分子量較大,在CID的能量碰撞下,糖肽不能充分碎裂。以肽段序列SRNLTK上連接Man5的糖肽為例,其在電噴霧離子源中雙電荷離子為[M+2H]2+ m/z 967.93。由于糖苷鍵穩(wěn)定性比酰胺鍵弱,在CID條件下優(yōu)先斷裂,而形成糖肽上逐一丟失單糖的二級碎裂圖譜。改變CID的碎裂能量,從10%至50%。當(dāng)CID 能量為20%,糖肽母離子開始碎裂,其最強(qiáng)的子離子占母離子相對豐度的70%,當(dāng)CID能量為30%時, 母離子全部碎裂(圖4)。繼續(xù)提高能量至35%,40%,45%和50%, 其碎裂情況基本不變。因此,CID的碎裂譜圖上難以得到肽段序列的信息,不能全面闡明完整糖肽的結(jié)構(gòu)。

    [TS(][HT5”SS]圖4母離子為[M+2H]2+ m/z 967.93糖肽的CID碎裂二級質(zhì)譜圖(方塊為N乙酰葡萄糖胺,圓圈為甘露糖)

    Fig.4MS/MS spectrum of glycopeptide by collisioninduced dissociation (CID) fragmentation, the precursor ion [M+2H]2+ m/z 967.93 (squares, Nacetylhexoseamine, HexNAc; circles, Hexose, Hex)[HT5][TS)]

    3.2.2完整糖肽在HCD模式下碎裂能量的優(yōu)化在HCD碰撞模式下,累積后的母離子將被注入HCD碰撞池中與中性氮氣分子碰撞,碎裂后經(jīng)CTrap送入Orbitrap檢測。此處仍然采用肽段序列SRNLTK上連接Man5的糖肽,m/z 967.93為檢測對象。依次提高HCD的碰撞能量,在20%能量下,糖肽的碎裂基本與CID 30%能量碎裂時一致。當(dāng)HCD能量為25%時,糖肽的譜圖如圖5所示。在低分子量區(qū)域,產(chǎn)生系列糖的特征離子,如m/z 204(HexNAc+H)+,m/z 366(HexNAc+Hex+H)+,以及氧鎓離子m/z 204(HexNAc+H)+繼續(xù)碎裂而產(chǎn)生的碎片離子,例如m/z 126, 138, 168和186等。由于HCD模式下不存在離子阱質(zhì)譜儀CID模式下的低質(zhì)量端1/3質(zhì)量丟失,使得上述糖碎片離子得以檢測。在中高分子量區(qū)域,HCD譜圖得到一系列的逐一丟失單糖的Y系列碎片離子,各離子有1電荷與雙電荷兩種狀態(tài),故形成兩組m/z不同的離子峰。其中Y1(肽段+HexNAc+H)+離子峰m/z 921.45強(qiáng)度高,因此Y1離子和糖碎片氧鎓離子是顯著的糖肽離子特征峰。

    [TS(][HT5”SS]圖5母離子為[M+2H]2+ m/z 967.93糖肽的HCD碎裂二級質(zhì)譜圖(方塊為N乙酰葡萄,圓圈為甘露糖)。插圖顯示低質(zhì)量端糖碎片離子

    Fig.5MS/MS spectrum of glycopeptide by high energy collisional dissociation (HCD) fragmentation, the precursor ion [M+2H]2+ m/z 967.93 ( squares, Nacetylhexoseamine, HexNAc; circles, Hexose, Hex). Insert view showed the fragment ions of glycans in the low mass region[HT5][TS)]

    由圖6可見,不同的HCD碰撞能量下,糖肽的特征離子相對豐度各有不同。隨著HCD能量的增加,糖的特征碎片離子信號不斷升高,其中可以繼續(xù)碎裂的m/z 204與366離子在能量大于25%時開始降低。同時,雙電荷狀態(tài)下的Y系列離子主要在20%~25%的中高能量下信號較高,隨著能量的進(jìn)一步加強(qiáng),雙電荷離子完全碎裂。1電荷的Y碎片離子系列,在HCD能量25%時達(dá)到高峰,但并不隨能量的提高而繼續(xù)增強(qiáng)。故采用HCD能量為25%,對糖肽進(jìn)行碰撞解離,其二級譜圖可以得到最為充分的信息。 [TS(][HT5”SS]圖6不同HCD碎裂能量下,糖肽二級譜圖中碎片離子的相對豐度: (a) 糖的特征離子;(b)雙電荷的Y系列離子;(c)1電荷的Y系列離子

    Fig.6Relative intensity of glycopeptides′ fragment ions in different HCD energy (a) carbohydratespecific ions; (b) a series of Y ions doublelycharged; (c) a series of Y ions singlelycharged[HT5][TS)]

    3.2.3完整糖肽在ETD碎裂中肽段序列分析ETD碎裂方式是將電子從一個活潑的陰離子基團(tuán)轉(zhuǎn)移到帶正電荷的肽段上,從而誘發(fā)肽段序列碎裂產(chǎn)生c、z離子。由于ETD的軟碎裂模式,翻譯后修飾的基團(tuán)常得以保留,因此有利于準(zhǔn)確識別修飾位點。如圖7所示,m/z 967.93的Man5糖肽在ETD譜圖中,產(chǎn)生肽段骨架結(jié)構(gòu)的碎片離子,從C3~C5及Z4~Z6兩組離子中,得到該糖肽的肽段序列為SRNLTK。從C2~C3及Z3~Z4之間,有大范圍的質(zhì)量跳躍,可以清晰指示糖基化位點。

    綜上所述,CID主要產(chǎn)生糖苷鍵斷裂的碎片,為糖鏈的結(jié)構(gòu)組成分析提供了線索;HCD在低分子量區(qū)域提供了糖鏈的特征離子信息,并產(chǎn)生明確的糖肽Y1特征離子,同時也產(chǎn)生部分糖苷鍵斷裂的碎片,為糖鏈結(jié)構(gòu)信息提供參考;ETD保留了完整的修飾基團(tuán)而產(chǎn)生肽段骨架的斷裂,可以提供有效的肽段序列信息。因此,聯(lián)合CID、HCD、ETD等多種碎裂方式,即可得到糖鏈結(jié)構(gòu)、糖基化位點和肽段序列等糖蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的全面信息。

    4結(jié)論

    本研究從解析完整糖肽水平入手,用自制HILIC親水相互作用小柱富集純化樣品中的糖肽并保持其完整性,采用LTQOrbitrap質(zhì)譜檢測,聯(lián)合CID、HCD、ETD等多種碎裂方式分析糖肽結(jié)構(gòu)。因此,本方法在有效富集糖肽的同時,獲取了肽段序列以及糖基化位點信息,并且能夠得到位點特異的糖型結(jié)構(gòu),為糖蛋白結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步解析提供了一種簡單、有效的方法。雖然不同碎裂條件下所獲得的糖肽譜圖均比較復(fù)雜,且糖鏈結(jié)構(gòu)解析缺乏有效的數(shù)據(jù)庫,規(guī)?;请臄?shù)據(jù)的解析還比較困難,但隨著計算機(jī)自動化軟件的進(jìn)一步發(fā)展,親水作用色譜聯(lián)合多重碎裂方式的串聯(lián)質(zhì)譜方法將在糖蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析中發(fā)揮更大的作用。

    [TS(][HT5”SS]圖4母離子為[M+2H]2+ m/z 967.93糖肽的CID碎裂二級質(zhì)譜圖(方塊為N乙酰葡萄糖胺,圓圈為甘露糖)

    Fig.4MS/MS spectrum of glycopeptide by collisioninduced dissociation (CID) fragmentation, the precursor ion [M+2H]2+ m/z 967.93 (squares, Nacetylhexoseamine, HexNAc; circles, Hexose, Hex)[HT5][TS)]

    3.2.2完整糖肽在HCD模式下碎裂能量的優(yōu)化在HCD碰撞模式下,累積后的母離子將被注入HCD碰撞池中與中性氮氣分子碰撞,碎裂后經(jīng)CTrap送入Orbitrap檢測。此處仍然采用肽段序列SRNLTK上連接Man5的糖肽,m/z 967.93為檢測對象。依次提高HCD的碰撞能量,在20%能量下,糖肽的碎裂基本與CID 30%能量碎裂時一致。當(dāng)HCD能量為25%時,糖肽的譜圖如圖5所示。在低分子量區(qū)域,產(chǎn)生系列糖的特征離子,如m/z 204(HexNAc+H)+,m/z 366(HexNAc+Hex+H)+,以及氧鎓離子m/z 204(HexNAc+H)+繼續(xù)碎裂而產(chǎn)生的碎片離子,例如m/z 126, 138, 168和186等。由于HCD模式下不存在離子阱質(zhì)譜儀CID模式下的低質(zhì)量端1/3質(zhì)量丟失,使得上述糖碎片離子得以檢測。在中高分子量區(qū)域,HCD譜圖得到一系列的逐一丟失單糖的Y系列碎片離子,各離子有1電荷與雙電荷兩種狀態(tài),故形成兩組m/z不同的離子峰。其中Y1(肽段+HexNAc+H)+離子峰m/z 921.45強(qiáng)度高,因此Y1離子和糖碎片氧鎓離子是顯著的糖肽離子特征峰。

    [TS(][HT5”SS]圖5母離子為[M+2H]2+ m/z 967.93糖肽的HCD碎裂二級質(zhì)譜圖(方塊為N乙酰葡萄,圓圈為甘露糖)。插圖顯示低質(zhì)量端糖碎片離子

    Fig.5MS/MS spectrum of glycopeptide by high energy collisional dissociation (HCD) fragmentation, the precursor ion [M+2H]2+ m/z 967.93 ( squares, Nacetylhexoseamine, HexNAc; circles, Hexose, Hex). Insert view showed the fragment ions of glycans in the low mass region[HT5][TS)]

    由圖6可見,不同的HCD碰撞能量下,糖肽的特征離子相對豐度各有不同。隨著HCD能量的增加,糖的特征碎片離子信號不斷升高,其中可以繼續(xù)碎裂的m/z 204與366離子在能量大于25%時開始降低。同時,雙電荷狀態(tài)下的Y系列離子主要在20%~25%的中高能量下信號較高,隨著能量的進(jìn)一步加強(qiáng),雙電荷離子完全碎裂。1電荷的Y碎片離子系列,在HCD能量25%時達(dá)到高峰,但并不隨能量的提高而繼續(xù)增強(qiáng)。故采用HCD能量為25%,對糖肽進(jìn)行碰撞解離,其二級譜圖可以得到最為充分的信息。 [TS(][HT5”SS]圖6不同HCD碎裂能量下,糖肽二級譜圖中碎片離子的相對豐度: (a) 糖的特征離子;(b)雙電荷的Y系列離子;(c)1電荷的Y系列離子

    Fig.6Relative intensity of glycopeptides′ fragment ions in different HCD energy (a) carbohydratespecific ions; (b) a series of Y ions doublelycharged; (c) a series of Y ions singlelycharged[HT5][TS)]

    3.2.3完整糖肽在ETD碎裂中肽段序列分析ETD碎裂方式是將電子從一個活潑的陰離子基團(tuán)轉(zhuǎn)移到帶正電荷的肽段上,從而誘發(fā)肽段序列碎裂產(chǎn)生c、z離子。由于ETD的軟碎裂模式,翻譯后修飾的基團(tuán)常得以保留,因此有利于準(zhǔn)確識別修飾位點。如圖7所示,m/z 967.93的Man5糖肽在ETD譜圖中,產(chǎn)生肽段骨架結(jié)構(gòu)的碎片離子,從C3~C5及Z4~Z6兩組離子中,得到該糖肽的肽段序列為SRNLTK。從C2~C3及Z3~Z4之間,有大范圍的質(zhì)量跳躍,可以清晰指示糖基化位點。

    綜上所述,CID主要產(chǎn)生糖苷鍵斷裂的碎片,為糖鏈的結(jié)構(gòu)組成分析提供了線索;HCD在低分子量區(qū)域提供了糖鏈的特征離子信息,并產(chǎn)生明確的糖肽Y1特征離子,同時也產(chǎn)生部分糖苷鍵斷裂的碎片,為糖鏈結(jié)構(gòu)信息提供參考;ETD保留了完整的修飾基團(tuán)而產(chǎn)生肽段骨架的斷裂,可以提供有效的肽段序列信息。因此,聯(lián)合CID、HCD、ETD等多種碎裂方式,即可得到糖鏈結(jié)構(gòu)、糖基化位點和肽段序列等糖蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的全面信息。

    4結(jié)論

    本研究從解析完整糖肽水平入手,用自制HILIC親水相互作用小柱富集純化樣品中的糖肽并保持其完整性,采用LTQOrbitrap質(zhì)譜檢測,聯(lián)合CID、HCD、ETD等多種碎裂方式分析糖肽結(jié)構(gòu)。因此,本方法在有效富集糖肽的同時,獲取了肽段序列以及糖基化位點信息,并且能夠得到位點特異的糖型結(jié)構(gòu),為糖蛋白結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步解析提供了一種簡單、有效的方法。雖然不同碎裂條件下所獲得的糖肽譜圖均比較復(fù)雜,且糖鏈結(jié)構(gòu)解析缺乏有效的數(shù)據(jù)庫,規(guī)?;请臄?shù)據(jù)的解析還比較困難,但隨著計算機(jī)自動化軟件的進(jìn)一步發(fā)展,親水作用色譜聯(lián)合多重碎裂方式的串聯(lián)質(zhì)譜方法將在糖蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析中發(fā)揮更大的作用。

    [TS(][HT5”SS]圖4母離子為[M+2H]2+ m/z 967.93糖肽的CID碎裂二級質(zhì)譜圖(方塊為N乙酰葡萄糖胺,圓圈為甘露糖)

    Fig.4MS/MS spectrum of glycopeptide by collisioninduced dissociation (CID) fragmentation, the precursor ion [M+2H]2+ m/z 967.93 (squares, Nacetylhexoseamine, HexNAc; circles, Hexose, Hex)[HT5][TS)]

    3.2.2完整糖肽在HCD模式下碎裂能量的優(yōu)化在HCD碰撞模式下,累積后的母離子將被注入HCD碰撞池中與中性氮氣分子碰撞,碎裂后經(jīng)CTrap送入Orbitrap檢測。此處仍然采用肽段序列SRNLTK上連接Man5的糖肽,m/z 967.93為檢測對象。依次提高HCD的碰撞能量,在20%能量下,糖肽的碎裂基本與CID 30%能量碎裂時一致。當(dāng)HCD能量為25%時,糖肽的譜圖如圖5所示。在低分子量區(qū)域,產(chǎn)生系列糖的特征離子,如m/z 204(HexNAc+H)+,m/z 366(HexNAc+Hex+H)+,以及氧鎓離子m/z 204(HexNAc+H)+繼續(xù)碎裂而產(chǎn)生的碎片離子,例如m/z 126, 138, 168和186等。由于HCD模式下不存在離子阱質(zhì)譜儀CID模式下的低質(zhì)量端1/3質(zhì)量丟失,使得上述糖碎片離子得以檢測。在中高分子量區(qū)域,HCD譜圖得到一系列的逐一丟失單糖的Y系列碎片離子,各離子有1電荷與雙電荷兩種狀態(tài),故形成兩組m/z不同的離子峰。其中Y1(肽段+HexNAc+H)+離子峰m/z 921.45強(qiáng)度高,因此Y1離子和糖碎片氧鎓離子是顯著的糖肽離子特征峰。

    [TS(][HT5”SS]圖5母離子為[M+2H]2+ m/z 967.93糖肽的HCD碎裂二級質(zhì)譜圖(方塊為N乙酰葡萄,圓圈為甘露糖)。插圖顯示低質(zhì)量端糖碎片離子

    Fig.5MS/MS spectrum of glycopeptide by high energy collisional dissociation (HCD) fragmentation, the precursor ion [M+2H]2+ m/z 967.93 ( squares, Nacetylhexoseamine, HexNAc; circles, Hexose, Hex). Insert view showed the fragment ions of glycans in the low mass region[HT5][TS)]

    由圖6可見,不同的HCD碰撞能量下,糖肽的特征離子相對豐度各有不同。隨著HCD能量的增加,糖的特征碎片離子信號不斷升高,其中可以繼續(xù)碎裂的m/z 204與366離子在能量大于25%時開始降低。同時,雙電荷狀態(tài)下的Y系列離子主要在20%~25%的中高能量下信號較高,隨著能量的進(jìn)一步加強(qiáng),雙電荷離子完全碎裂。1電荷的Y碎片離子系列,在HCD能量25%時達(dá)到高峰,但并不隨能量的提高而繼續(xù)增強(qiáng)。故采用HCD能量為25%,對糖肽進(jìn)行碰撞解離,其二級譜圖可以得到最為充分的信息。 [TS(][HT5”SS]圖6不同HCD碎裂能量下,糖肽二級譜圖中碎片離子的相對豐度: (a) 糖的特征離子;(b)雙電荷的Y系列離子;(c)1電荷的Y系列離子

    Fig.6Relative intensity of glycopeptides′ fragment ions in different HCD energy (a) carbohydratespecific ions; (b) a series of Y ions doublelycharged; (c) a series of Y ions singlelycharged[HT5][TS)]

    3.2.3完整糖肽在ETD碎裂中肽段序列分析ETD碎裂方式是將電子從一個活潑的陰離子基團(tuán)轉(zhuǎn)移到帶正電荷的肽段上,從而誘發(fā)肽段序列碎裂產(chǎn)生c、z離子。由于ETD的軟碎裂模式,翻譯后修飾的基團(tuán)常得以保留,因此有利于準(zhǔn)確識別修飾位點。如圖7所示,m/z 967.93的Man5糖肽在ETD譜圖中,產(chǎn)生肽段骨架結(jié)構(gòu)的碎片離子,從C3~C5及Z4~Z6兩組離子中,得到該糖肽的肽段序列為SRNLTK。從C2~C3及Z3~Z4之間,有大范圍的質(zhì)量跳躍,可以清晰指示糖基化位點。

    綜上所述,CID主要產(chǎn)生糖苷鍵斷裂的碎片,為糖鏈的結(jié)構(gòu)組成分析提供了線索;HCD在低分子量區(qū)域提供了糖鏈的特征離子信息,并產(chǎn)生明確的糖肽Y1特征離子,同時也產(chǎn)生部分糖苷鍵斷裂的碎片,為糖鏈結(jié)構(gòu)信息提供參考;ETD保留了完整的修飾基團(tuán)而產(chǎn)生肽段骨架的斷裂,可以提供有效的肽段序列信息。因此,聯(lián)合CID、HCD、ETD等多種碎裂方式,即可得到糖鏈結(jié)構(gòu)、糖基化位點和肽段序列等糖蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的全面信息。

    4結(jié)論

    本研究從解析完整糖肽水平入手,用自制HILIC親水相互作用小柱富集純化樣品中的糖肽并保持其完整性,采用LTQOrbitrap質(zhì)譜檢測,聯(lián)合CID、HCD、ETD等多種碎裂方式分析糖肽結(jié)構(gòu)。因此,本方法在有效富集糖肽的同時,獲取了肽段序列以及糖基化位點信息,并且能夠得到位點特異的糖型結(jié)構(gòu),為糖蛋白結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步解析提供了一種簡單、有效的方法。雖然不同碎裂條件下所獲得的糖肽譜圖均比較復(fù)雜,且糖鏈結(jié)構(gòu)解析缺乏有效的數(shù)據(jù)庫,規(guī)?;请臄?shù)據(jù)的解析還比較困難,但隨著計算機(jī)自動化軟件的進(jìn)一步發(fā)展,親水作用色譜聯(lián)合多重碎裂方式的串聯(lián)質(zhì)譜方法將在糖蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析中發(fā)揮更大的作用。

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