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    高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定紫蘇籽油中11種酚類(lèi)化合物

    2015-11-03 07:54吳嬈等
    分析化學(xué) 2015年10期
    關(guān)鍵詞:串聯(lián)質(zhì)譜高效液相色譜

    吳嬈等

    摘 要 基于新型富集材料磁性羧基化多壁碳納米管與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜,建立了紫蘇籽油中11種酚類(lèi)化合物同時(shí)分離與檢測(cè)的方法。對(duì)影響富集分離效果的重要因素,如流動(dòng)相、流動(dòng)相中酸的添加量、流速、進(jìn)樣量及碰撞能量等條件進(jìn)行了詳細(xì)優(yōu)化。在優(yōu)化條件下,11種酚類(lèi)化合物線(xiàn)性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)為0.993~0.999,檢出限(LOD, S/N=3)和定量限(LOQ,S/N=10)分別在0.02~0.70 ng/mL,0.06~2.0 ng/mL范圍內(nèi),以50和500 ng/mL添加濃度水平進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,回收率為79.6%~121.5%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.06%~13.2%。將本方法應(yīng)用于紫蘇籽油樣品的分析,其含量在7.32~68.6 ng/g之間。結(jié)果表明,本方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確可靠,適用于紫蘇籽油等植物油中酚類(lèi)化合物定量分析。

    關(guān)鍵詞 紫蘇籽油; 酚類(lèi)化合物; 磁固相萃取法; 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

    1 引 言

    紫蘇(Perillafrutescen(L)Brit.)又名赤蘇、香蘇等,為唇形科一年生草本植物,是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用植物。紫蘇籽油是由紫蘇籽經(jīng)烘焙、壓榨和精煉獲得食用油[1],具有防止動(dòng)脈粥樣硬化、降血脂、抗氧化、抗衰老、抑菌、抗腫瘤、平喘等作用[2~7]。然而,其作用的分子機(jī)理尚不清楚[7]。目前紫蘇籽油化學(xué)成分認(rèn)識(shí)僅限于脂肪酸(主要α-亞麻酸[8]),揮發(fā)物[6],紫蘇籽和果渣中迷迭香酸、芹黃素和木犀草素等[9]。酚類(lèi)化合物具有抗氧化作用,預(yù)防心血管疾病,抑菌、抗癌和解毒護(hù)肝[10~13]。因此,建立一種靈敏的紫蘇籽油中酚類(lèi)成分同時(shí)測(cè)定方法對(duì)紫蘇籽油功能解析與評(píng)價(jià)具有重要意義。

    目前,關(guān)于多酚類(lèi)化合物的檢測(cè)已有很多報(bào)道,陳磊等[14]采用高效液相色譜法檢測(cè)黃酒中多酚類(lèi)成分;呂海濤等[15]以乙酸乙酯為提取劑,建立了蘋(píng)果中酚類(lèi)成分定量分析方法;張?zhí)鸬萚16]采用固相萃取-高效液相色譜測(cè)定煙草樣品中多酚;胡秋芬等[17]采用微柱液相色譜法測(cè)定金銀花中的多酚類(lèi)化合物。由于植物油中多酚類(lèi)物質(zhì)含量底,樣品基質(zhì)復(fù)雜,酚類(lèi)化合物分析需對(duì)樣品進(jìn)行富集和純化[18],因此建立有效的前處理技術(shù)尤為重要。目前多采用液液萃取、固相萃取等技術(shù),存在費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、有機(jī)溶劑量大等缺點(diǎn)[19],多壁碳納米管因其獨(dú)特的物理結(jié)構(gòu),巨大的比表面積而備受關(guān)注[20~22]。作為固相萃取吸附劑,多壁碳納米管具有優(yōu)異的富集性能,并且通過(guò)對(duì)其表面進(jìn)行羧基化修飾和磁性化,使得材料更加穩(wěn)定,不易聚集,能夠均勻分散在基質(zhì)樣品中,實(shí)現(xiàn)酚類(lèi)物質(zhì)的高選擇性純化富集,操作過(guò)程快速簡(jiǎn)單,僅需外加磁場(chǎng)即可分離[23]。

    本研究以磁性羧基化多壁碳納米管材料為基礎(chǔ),建立了植物油中天然酚類(lèi)組分富集-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法,優(yōu)化了如流動(dòng)相、流動(dòng)相中酸的添加量、流速、進(jìn)樣量及碰撞能量等條件,并應(yīng)用于紫蘇籽油中多酚成分的測(cè)定,為全面認(rèn)識(shí)紫蘇籽油中酚類(lèi)組分,開(kāi)展紫蘇籽油的品質(zhì)與營(yíng)養(yǎng)功能評(píng)價(jià)提供了必要基礎(chǔ)。

    2 實(shí)驗(yàn)部分

    2.1 儀器與試劑

    液相色譜質(zhì)譜TSQ三重四級(jí)桿(美國(guó)Thermo公司);HQ-60旋渦混合器(北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司);BF-2000型氮?dú)獯蹈蓛x(北京八方世紀(jì)科技有限公司);Milli-Q超純水儀(美國(guó)Millipore公司);KQ-600B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

    紫蘇籽油:從主產(chǎn)區(qū)收集代表性紫蘇籽,采用實(shí)驗(yàn)室物理壓榨方式獲得紫蘇籽油。

    對(duì)羥基乙醇、肉桂酸、3,4-二羥基苯甲酸、對(duì)香豆酸、香草酸、咖啡酸、阿魏酸、丁香酸、芹黃素、木犀草素、槲皮素、甲酸(Sigma公司);甲醇(色譜純,Merck公司);醋酸(優(yōu)級(jí)純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、FeCl3·6H2O(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);石油醚、乙二醇、無(wú)水乙醇(分析純,西隴化工股份有限公司);乙酸鈉(分析純,天津市德恩化學(xué)試劑有限公司);正己烷(HPLC純,安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司);羧基化多壁碳納米管(南京先豐納米材料科技有限公司,長(zhǎng)度約30 μm, 直徑<8 nm, COOH含量: 3.86%);實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q 超純水,其它試劑為分析純。

    2.2 HPLC-MS/MS分析條件

    2.2.1 液相色譜條件 Hypersil Gold C18液相色譜柱(100 mm×2.1 mm i.d., 3 μm),柱溫:30℃;流速:0.2 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;流動(dòng)相: A為0.01%(V/V) 醋酸-甲醇溶液,B為0.01%(V/V)醋酸-水溶液;流動(dòng)相洗脫程序見(jiàn)表1。

    2.2.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI);多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);負(fù)離子模式掃描;毛細(xì)管電壓:3 kV;毛細(xì)管溫度:270℃;氣簾氣(N2):30 units;輔助氣(N2): 5 units;碰撞氣(Ar): 1.5 mTorr;掃描時(shí)間:0.1 s;酚類(lèi)化合物的質(zhì)譜參數(shù)條件見(jiàn)表2。

    2.3 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

    準(zhǔn)確稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)羥基乙醇、肉桂酸、3,4-二羥基苯甲酸、對(duì)香豆酸、香草酸、咖啡酸、阿魏酸、丁香酸、芹黃素、木犀草素、槲皮素各10.0 mg,分別用甲醇溶解,定容至10.0 mL,即得1.0 mg/mL單一標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液,4℃避光保存。分別移取0.1 mL單一標(biāo)準(zhǔn)品混合,制備10.0 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液,使用時(shí)用甲醇稀釋成不同濃度梯度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

    2.4 實(shí)驗(yàn)步驟

    準(zhǔn)確稱(chēng)取0.50 g紫蘇籽油樣于10 mL試管中,加入4.0 mL正己烷,增加樣品流動(dòng)性,使目標(biāo)物更快地由樣品轉(zhuǎn)移到萃取劑中。充分混勻后,加入5.0 mg磁性納米材料,渦旋提取2 min后,在試管外壁加磁鐵,靜置10 s,待液體呈透明狀,將液體倒出。 加入1.0 mL石油醚淋洗雜質(zhì),渦旋15 s,再次在試管外壁加磁鐵,靜置10s,待液體透明,將液體倒出。選擇乙醇為洗脫溶劑,加入3.0 mL 0.02%(V/V)甲酸-乙醇,超聲6 min,過(guò)0.22 μm有機(jī)膜,氮吹濃縮,200 μL初始流動(dòng)相比例定容,進(jìn)樣10 μL進(jìn)行LC-MS/MS檢測(cè)。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 流動(dòng)相的選擇

    在高效液相色譜條件中流動(dòng)相的選擇至關(guān)重要??疾炝思状?水、乙腈-水作為流動(dòng)相的分離效果。結(jié)果表明,11種酚類(lèi)化合物在甲醇-水體系獲得較好分離,通過(guò)調(diào)整梯度洗脫程序,峰形和分離度基本達(dá)到要求。因此,本研究選擇甲醇-水體系為流動(dòng)相。針對(duì)部分目標(biāo)物存在峰拖尾現(xiàn)象,加入少量酸調(diào)節(jié)溶液pH值,可使單個(gè)酚類(lèi)的電離受到抑制,以中性分子的形態(tài)存在,極性減弱,增強(qiáng)在固定相上的保留[11]。

    3.2 酸添加量?jī)?yōu)化

    反相色譜柱填料表面由于存在殘余的羥基,具有一定的酸性,而部分酚類(lèi)化合物具有弱酸性,能夠與殘余硅羥基發(fā)生強(qiáng)的靜電作用力,產(chǎn)生次級(jí)保留效應(yīng),洗脫被推遲,產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象。由于酸性環(huán)境能夠抑制硅羥基的電離,流動(dòng)相中添加少量酸,可改善峰形,為了獲得準(zhǔn)確的定量分析結(jié)果,考察了酸添加量的影響。

    采用醋酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相的酸性。對(duì)比了在水相中加入0.5%, 0.2%, 0.1%, 0.05%和0.01%(V/V)醋酸的出峰情況發(fā)現(xiàn),在水相中加入0.01%(V/V)醋酸,效果最好,響應(yīng)值最高; 利用同樣的濃度梯度優(yōu)化了甲醇相中醋酸添加量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),同樣在0.01%(V/V)的效果最好。可能的原因是:有機(jī)相和水相中加入相同濃度的醋酸,保證了在梯度洗脫過(guò)程中,兩種流動(dòng)相混合時(shí),保持恒定的醋酸濃度,pH值不發(fā)生變化,同時(shí),這樣可使基線(xiàn)更加平穩(wěn),容易平衡梯度,降低目標(biāo)物在分離過(guò)程中受干擾因素。因此,流動(dòng)相為0.01% (V/V)醋酸-甲醇和0.01%(V/V)醋酸。

    3.3 流速和進(jìn)樣量選擇

    流速和進(jìn)樣量對(duì)提高目標(biāo)化合物的分離效果非常重要。當(dāng)流速為200 μL/min的效果優(yōu)于250 μL/min; 考察了進(jìn)樣量分別為5, 10和20 μL的分離效果。當(dāng)進(jìn)樣量為10 μL,目標(biāo)物出峰情況良好,未出現(xiàn)前沿峰和拖尾峰。因此,本研究的流速選定200 μL/min,進(jìn)樣量為10 μL。

    3.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

    選取負(fù)離子模式監(jiān)測(cè),以\[M-H\]為母離子,選取離子豐度最強(qiáng)的碎片為子離子,通過(guò)優(yōu)化錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù),信號(hào)強(qiáng)度明顯改善。質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。采用C18色譜柱,以0.01%醋酸-甲醇和0.01% 醋酸溶液進(jìn)行梯度洗脫(梯度洗脫程序見(jiàn)表1),11種酚類(lèi)化合物在30 min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)良好分離,保留時(shí)間見(jiàn)表2,目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的SRM色譜圖見(jiàn)圖1。

    3.5 方法評(píng)價(jià)

    配制10,50,100,200,500和1000 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在優(yōu)化的HPLC-MS/MS條件下進(jìn)樣檢測(cè),每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣3次,以目標(biāo)物平均峰面積(Y)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(x, ng/mL)進(jìn)行線(xiàn)性回歸。根據(jù)信噪比(S/N)3倍和10倍分別確定目標(biāo)物的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),結(jié)果見(jiàn)表3。11種酚類(lèi)化合物都有較寬的線(xiàn)性范圍,在各相應(yīng)的線(xiàn)性范圍內(nèi),線(xiàn)性關(guān)系良好(R2≥0.993);LOD為0.02~0.70 ng/mL,LOQ為0.07~2.00 ng/mL;準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果見(jiàn)表4,2個(gè)加標(biāo)水平的回收率為79.61%~121.52%,RSD<15%,可以滿(mǎn)足實(shí)際樣品的測(cè)定需要。

    將本方法與前期報(bào)道中食用油中酚類(lèi)化合物定量分析方法相比,從表5可見(jiàn),本方法分析時(shí)間短,線(xiàn)性范圍寬,檢出限低,能滿(mǎn)足實(shí)際樣品測(cè)定的需要。

    3.6 實(shí)際樣品分析

    采用本方法對(duì)紫蘇籽油實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè),每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次,檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2,11種酚類(lèi)化合物含量分別為:對(duì)羥基乙醇8.00 ng/g、肉桂酸19.0 ng/g、3,4-二羥基苯甲酸7.32 ng/g、對(duì)香豆酸46.5 ng/g、香草酸68.6 ng/g、咖啡酸32.8 ng/g、阿魏酸55.7 ng/g、丁香酸22.4 ng/g、芹黃素43.3 ng/g、木犀草素7.96 ng/g和槲皮素13.4 ng/g;其中,香草酸、阿魏酸、對(duì)香豆酸、芹黃素、咖啡酸等含量較高,是紫蘇籽油主要的潛在營(yíng)養(yǎng)成分。

    4 結(jié) 論

    通過(guò)對(duì)流動(dòng)相、流動(dòng)相中酸的添加量、流速、進(jìn)樣量及質(zhì)譜條件的優(yōu)化和考察,建立了基于磁固相萃取技術(shù)LC-MS/MS檢測(cè)紫蘇籽油種11種酚類(lèi)化合物的分析方法。本方法前處理操作簡(jiǎn)單,環(huán)境友好,實(shí)現(xiàn)了高靈敏度、高分析速度、低成本的目標(biāo),結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確,為全面認(rèn)識(shí)紫蘇籽油中酚類(lèi)組成,開(kāi)展紫蘇籽油的品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)功能評(píng)價(jià)提供了必要基礎(chǔ)。

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