氟代苯硼酸與單糖間結(jié)合規(guī)律探究

呂辰晨　劉震

摘 要 取代硼酸與順式二羥基化合物間的相互作用是設計親和配基、功能材料和傳感元件以分離、富集和識別順式二羥基化合物的重要基礎。氟代苯硼酸在較低pH條件下具有較高的硼親和力，但其與單糖間的相互作用規(guī)律目前尚未得到闡明。本研究以親和毛細管電泳為相互作用表征手段，研究了9種不同結(jié)構(gòu)的氟代苯硼酸與3種典型單糖（甘露糖、果糖和葡萄糖）在不同pH條件下的結(jié)合常數(shù)。同時，利用紫外分光光度法測量了這9種氟代苯硼酸的酸度系數(shù)。經(jīng)過結(jié)構(gòu)-性能關聯(lián)，對氟代苯硼酸與甘露糖、果糖和葡萄糖的結(jié)合規(guī)律以及對葡萄糖的選擇性進行了探討。

關鍵詞 氟代苯硼酸； 單糖； 相互作用； 親和毛細管電泳

1 引 言

取代硼酸分子對順式二羥基結(jié)構(gòu)具有特異性識別作用，被廣泛應用于糖、糖蛋白、修飾核苷、RNA等生物分子傳感[1～4]和分離富集[5～8]研究中，近年來在親和分離[9～14]、蛋白質(zhì)組學[15～19]、代謝組學[20～23]、疾病診斷[24～27]以及固相標記[28]方面得到了越來越多的重要應用。生物樣品多為酸性到偏堿性，而且其中含有的順式二羥基生物分子的豐度低，因硼酸酚基的適用pH范圍寬、親和力高， 在生物學研究中應用廣泛。研究取代硼酸與單糖分子間相互作用規(guī)律，對于選擇合適配基具有重要指導意義。

由于氟原子的特殊結(jié)構(gòu)和電子效應，氟取代被廣泛用于藥物設計、功能材料等領域中的分子改性，起到增強分子代謝穩(wěn)定性、改變官能團理化性質(zhì)和穩(wěn)定分子構(gòu)象等作用[29，30]。Yan等[31]考察了鹵素取代對硼親和力的影響，結(jié)果表明，氟取代的苯硼酸的親和力比氯取代和溴取代的高得多。本研究組在前期工作中發(fā)現(xiàn)，氟取代能增強苯硼酸在低pH條件下的親和力[32]。然而，氟取代的位置和數(shù)目對苯硼酸的親和力影響，目前未見文獻報道。因此，深入研究氟取代苯硼酸的性質(zhì)及其與順式二羥基分子間的相互作用規(guī)律具有重要意義。

親和毛細管電泳（Affinity capillary electrophoresis，ACE）是一種基于被分析物結(jié)合前后電泳淌度的變化，表征分子間相互作用的毛細管電泳方法，具有準確度高、重現(xiàn)性好、快速、高通量及操作簡便等優(yōu)點[33]。ACE已被證明是表征取代硼酸與含順式二羥基生物分子間相互作用的可靠手段[32]。本研究選擇3種典型單糖（甘露糖、果糖和葡萄糖）及9種氟代苯硼酸為研究對象，利用ACE考察它們間的相互作用，通過結(jié)構(gòu)-性能關系，分析了氟代苯硼酸與單糖間相互作用與分子結(jié)構(gòu)間的關系規(guī)律。硼酸探針分子檢測血液中葡萄糖時，果糖為主要干擾物，本研究考察了氟取代苯硼酸對葡萄糖/果糖的選擇性。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

2-氟苯硼酸（2-FPBA）、3-氟苯硼酸（3-FPBA）、4-氟苯硼酸（4-FPBA）、2，3-二氟苯硼酸（2，3-DFPBA）、2，4-二氟苯硼酸（2，4-DFPBA）、2，5-二氟苯硼酸（2，5-DFPBA）、2，6-二氟苯硼酸（2，6-DFPBA）、3，5-二氟苯硼酸（3，5-DFPBA）、2-（三氟甲基）苯硼酸（2-TFPBA），均購自百靈威公司，純度大于97%； 苯硼酸和二甲亞砜（DMSO，分析純，上海國藥集團）； D-甘露糖（純度為99%，Alfa Aesar公司）； D-果糖（上?；菖d試劑公司）。以上試劑均未經(jīng)處理直接使用。實驗用水為Milli Q超純水（Millipore公司），所有溶液使用前用0.45 μm濾膜過濾。

ACE實驗在P/ACE MDQ系統(tǒng)（美國Beckman Coulter公司）上進行。實驗用毛細管（河北永年銳灃色譜器件有限公司）規(guī)格為60 cm×50 μm i.d. （50 cm 至檢測器）。若無特殊說明，ACE實驗是在25℃下進行，分離電壓為 24 kV，二極管陣列檢測器檢測。每次電泳實驗前，依次使用0.1 mol/L NaOH溶液在137.9 kPa條件下沖洗2 min，運行緩沖溶液沖洗2 min。進樣采用3.447 kPa，5 s。Nanodrop-2000C微量紫外可見分光光度計（美國Thermo公司）。

2.2 實驗方法

2.2.1 親和毛細管電泳原理 硼酸配基（T）與單糖分子（L）通常以1∶1的化學計量比反應，反應式和結(jié)合常數(shù)（Ka）如式（1）所示：

當單糖分子對于硼酸分子大大過量時，式（4）中的[Lf]可使用單糖濃度代替。（νμi-μf）是實測的氟代硼酸分子的淌度變化值，而（μb-μf）是硼酸分子與單糖完全結(jié)合后與未結(jié)合硼酸分子間的淌度差值，對于給定硼酸-糖體系為常數(shù)。通過改變運行緩沖溶液中的單糖濃度，可以獲得一系列硼酸分子淌度變化值與單糖濃度間關系的數(shù)據(jù)，根據(jù)式（4），用雙曲線方程進行數(shù)據(jù)擬合，獲得結(jié)合常數(shù)Ka的值。

2.2.2 親和毛細管電泳實驗方法 電泳運行緩沖溶液為添加不同濃度單糖分子的50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 6.0， 7.0 或 8.0），樣品使用含有0.1% DMSO的單個或多個硼酸的溶液，濃度為10～10-4 mol/L。對于糖含量大于50 mmol/L的運行緩沖溶液，均對測得的淌度數(shù)據(jù)進行粘度校正，以排除粘度變化對淌度的影響[34，35]。

2.2.3 數(shù)據(jù)分析 表觀淌度數(shù)據(jù)由與電泳儀配套的32Karat 軟件計算得到。非線性數(shù)據(jù)分析使用OriginPro8 軟件（OriginLab Corporation， USA）。結(jié)合常數(shù)數(shù)據(jù)均由3次實驗的平均值回歸得到。

2.2.4 酸度系數(shù)（pKa）的測量

取代硼酸的pKa值利用紫外吸光光度法測量。配制一系列不同pH值的取代硼酸溶液（取代硼酸濃度：3，5-DFPBA為5 mmol/L，其余10 mmol/L，不同pH值溶液硼酸濃度保持一致； 緩沖溶液： 50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4溶液），測量270 nm處的紫外吸光度，對pH值作圖，得到pKa值。

3 結(jié)果與討論

3.1 硼酸酸度的測量

通常認為取代硼酸與糖結(jié)合的最佳pH值略高于取代硼酸pKa值，因此pKa值可作為選擇結(jié)合pH值的參考依據(jù)[36]。

通過測量不同pH值下氟代苯硼酸270 nm處的紫外吸光度，得到了不同含氟取代苯硼酸的pKa值（表1）。其中，苯硼酸、4-氟苯硼酸、2，4-二氟苯硼酸和2，5-二氟苯硼酸的結(jié)果與文獻＼[32＼]一致。苯環(huán)單氟取代可使硼酸pKa值降低0.1～1.2個pH單位，二氟取代可使硼酸pKa值降低1.3～1.9個pH單位。

鄰位三氟甲基取代苯硼酸與文獻報道的酸性較強的鄰位氨基甲基取代苯硼酸[37]和鄰位羥基甲基取代苯硼酸[38]結(jié)構(gòu)類似，但卻沒有測得預期中的低pKa值，pKa值與苯硼酸相比反而升高了一個單位，可能是空間位阻效應阻礙硼酸電離，也可能是三氟甲基能夠穩(wěn)定平面三角形的硼酸結(jié)構(gòu)，具體原因有待進一步實驗證實。

3.2 氟代苯硼酸與甘露糖結(jié)合常數(shù)

甘露糖是糖基化蛋白末端最常見的單糖，研究氟代苯硼酸與甘露糖的結(jié)合規(guī)律具有重要意義。苯硼酸與甘露糖的結(jié)合常數(shù)較小[32]，實驗測得氟取代能使苯硼酸與甘露糖的結(jié)合能力最大提高20倍（表2），但結(jié)合作用依然較弱，僅勉強達到中等結(jié)合強度[36]。結(jié)合氟代苯硼酸的pKa值，pH 8.0時，二氟取代苯硼酸的硼酸根主要以四面體結(jié)構(gòu)存在，提高溶液的堿性無法再明顯提高硼酸親和能力。親和毛細管電泳測量硼酸親和作用具有高通量、高準確度、適用于不同取代硼酸分子之間親和能力強弱比較的優(yōu)勢[32]，利用該技術對5種二氟取代苯硼酸的結(jié)合能力進行了進一步區(qū)分。2，3-二氟苯硼酸、2，4-二氟苯硼酸、2，5-二氟苯硼酸與甘露糖的結(jié)合強弱與氟取代對其pKa值影響基本一致，而2，6-二氟苯硼酸和3，5-二氟苯硼酸與甘露糖的親和能力強弱與酸度不一致，說明位阻對硼酸與甘露糖的結(jié)合有明顯影響。

鄰位三氟取代甲基苯硼酸，具有與Wulff型苯硼酸[36]和改進Wulff型苯硼酸[37]相似的結(jié)構(gòu)，如果與硼酸官能團之間存在電子效應，可能會對硼酸的親和作用有較大影響。從結(jié)合常數(shù)的數(shù)值可知，pH 7.0時，鄰位三氟取代甲基苯硼酸與甘露糖的結(jié)合常數(shù)是苯硼酸的兩倍； 而pH 8.0時，鄰位三氟取代甲基苯硼酸與甘露糖的結(jié)合常數(shù)不升反降，說明在pH 7.0 和pH 8.0時鄰位三氟取代甲基苯硼酸與甘露糖的結(jié)合作用機理可能發(fā)生了變化。

3.3 氟代苯硼酸與果糖結(jié)合常數(shù)

果糖是單糖中與硼酸結(jié)合力最強的分子，可用于比較不同取代硼酸親和能力。測量了氟代苯硼酸與果糖在弱酸性（pH 6.0）＼，中性（pH 7.0）和弱堿性（pH 8.0）條件下的結(jié)合常數(shù)。

對于單氟取代硼酸，在弱酸性和中性條件下，鄰、間、對位取代苯硼酸結(jié)合能力與其酸度一致； 弱堿性（pH 8.0）條件下，間位氟取代苯硼酸與果糖的結(jié)合能力超過了鄰位氟取代苯硼酸。對于二氟取代苯硼酸，在中性和弱酸性條件下，2，3-二氟苯硼酸、2，5-二氟苯硼酸、3，5-二氟苯硼酸與果糖的結(jié)合能力基本相當，2，4-二氟苯硼酸、2，6-二氟苯硼酸與果糖的結(jié)合常數(shù)僅為另外3種氟代硼酸結(jié)合常數(shù)的1/2，與硼酸酸度強弱不完全一致。在弱堿性條件下，鄰位氟取代的優(yōu)勢逐漸喪失，3，5-二氟苯硼酸具有最強的親和能力，說明二氟取代苯硼酸與果糖結(jié)合強弱是電子效應和空間位阻共同作用的結(jié)果。

鄰位三氟取代甲基苯硼酸，在中性和弱酸性條件下，與果糖的結(jié)合作用十分弱（中性條件下結(jié)合常數(shù)不到苯硼酸的1/10）。而在弱堿性條件下，鄰位三氟取代甲基苯硼酸與果糖結(jié)合能力迅速增強，與苯硼酸接近。關于果糖與苯硼酸的強結(jié)合能力，多數(shù)文獻認為源自其占主導地位的含順式鄰位二羥基結(jié)構(gòu)的呋喃糖形式，使二羥基間角度更適合與硼酸形成硼酸酯五元環(huán)[39，40]； 但也有研究認為，果糖的順式鄰二羥基結(jié)構(gòu)與硼酸成酯的同時，環(huán)外羥基與硼原子配位增強硼酸酯穩(wěn)定性，使結(jié)合能力強于其它單糖[40]，同時受鄰位基團的影響更加明顯 ＼[41]。鄰位三氟甲基苯硼酸與果糖間相互作用的異?，F(xiàn)象佐證了第二種觀點，在中性和弱酸性條件下，苯硼酸與果糖的結(jié)合受益于果糖環(huán)外羥基與硼原子配位，三氟甲基巨大的位阻效應阻止了配位鍵的形成； 而在弱堿性條件下，硼酸酯穩(wěn)定性增強，受配位作用影響減弱，鄰位三氟甲基苯硼酸與果糖結(jié)合能力增強。

3.4 含氟苯硼酸對葡萄糖的結(jié)合選擇性

葡萄糖為人血液中濃度最高的糖，也是糖尿病檢測的標志物。葡萄糖與取代硼酸的結(jié)合作用通常較弱，因此許多研究[2，42]以提高取代硼酸與葡萄糖的結(jié)合能力和選擇性為目標。盡管血液中果糖濃度低，但由于果糖與硼酸的結(jié)合常數(shù)通常較葡萄糖高兩個數(shù)量級，因此為血糖檢測的主要干擾物。葡萄糖主要以吡喃糖形式存在，而果糖主要以呋喃糖形式存在。早期研究葡萄糖探針分子的文獻對硼酸探針分子與葡萄糖吡喃糖結(jié)合的結(jié)構(gòu)進行了解析[43]，但后來的研究多證實葡萄糖也是以呋喃糖形式與硼酸結(jié)合[42，44]。葡萄糖探針分子多為二硼酸分子，與葡萄糖的兩組順式二羥基結(jié)構(gòu)結(jié)合[42，44]，使探針分子與葡萄糖的結(jié)合常數(shù)遠高于其它以吡喃糖為主要形式的單糖分子，如甘露糖、半乳糖，但抗果糖干擾能力差[2]。果糖與取代硼酸分子的結(jié)合受鄰位基團的影響較大，通過在苯硼酸鄰位引入取代基團，可以提高葡萄糖/果糖的相對結(jié)合能力[41]。本研究表征了不同位置氟取代苯硼酸與葡萄糖在中性條件下的結(jié)合常數(shù)。氟取代苯硼酸的結(jié)合常數(shù)如表2所示，果糖與葡萄糖在中性條件下的相對結(jié)合能力數(shù)據(jù)見表3。

由氟取代苯硼酸與葡萄糖的結(jié)合常數(shù)可知，鄰位氟取代和二氟取代均可使硼酸與葡萄糖在中性條件下的親和常數(shù)提高一個數(shù)量級及以上。由表3可見，氟取代提高了苯硼酸在中性條件下對葡萄糖的選擇性； 通常，鄰位有取代基的苯硼酸對葡萄糖的選擇性較高（2，6-二氟苯硼酸除外）； 鄰位三氟甲基苯硼酸與葡萄糖的結(jié)合能力與苯硼酸相似，但其在中性條件下與果糖的結(jié)合受到抑制，取代硼酸具有對葡萄糖最高的選擇性。

4 結(jié) 論

本研究表征了9種氟代苯硼酸與3種典型單糖在不同pH條件下的結(jié)合常數(shù)，并測量了這9種氟代苯硼酸的酸度系數(shù)，通過結(jié)構(gòu)-性質(zhì)關聯(lián)，剖析了氟取代位置與硼酸親和能力強弱之間的關系。此外，本研究還考察了鄰位三氟甲基對硼酸電離和成酯的抑制作用，以及對葡萄糖的較高選擇性。以上研究為設計和利用高親和力硼酸配基提供了重要依據(jù)。

References

1 Nishiyabu R， Kubo Y， James T D， Fossey J S. Chem. Commun.， 2011， 47： 1106-1123

2 Liu Y， Deng C， Tang L， Qin A， Hu R， Sun J Z， Tang B Z. J. Am. Chem. Soc.， 2011， 133： 660-663

3 Vlandas A， Kurkina T， Ahmad A， Kern K， Balasubramanian K. Anal. Chem.， 2010， 82： 6090-6097

4 Bi X D， Li D J， Liu Z. Anal. Chem.， 2015， 87： 4442-4447

5 Dou P， Liang L， He J G， Liu Z， Chen， H Y. J. Chromatogr. A， 2009， 1216： 7558-7563

6 Li H， Liu Z. Trends Anal. Chem.， 2012， 37： 148-161

7 Wang H Y， Lü C C， Li H Y， Chen Y， Zhou M， Ouyang J， Liu Z. Anal. Bioanal. Chem.， 2013， 405： 8579-8586

8 Wang S S， Ye J， Bie Z J， Liu Z. Chem. Sci.， 2014， 5： 1135-1140

9 Ren LB， Liu Z， Dong M M， Ye M L， Zou H F. J. Chromatogr. A， 2009， 1216： 4768-4774

10 Ren L B， Liu Z， Liu Y C， Dou， P， Chen H Y. Angew. Chem. Int. Ed.， 2009， 48： 6704-6707

11 Chen M， Lu Y， Ma Q，Guo L， FengY Q. Analyst， 2009， 134： 2158-2164

12 Sun X L， Liu R， He X W， Chen L X， Zhang Y. K. Talanta， 2010， 81： 856-864

13 Lin Z A， Pang J L， Lin Y， Huang H， Cai Z W， Zhang L， Chen G N. Analyst， 2011， 136： 3281-3288

14 Liu Y C， Lu Y， Liu Z. Chem. Sci.， 2012， 3： 1467-1471

15 Xu Y W， Wu Z X， Zhang L J， Lu H J， Yang P Y， Webley P A， Zhao D Y. Anal. Chem.， 2009， 81： 503-508

16 Tang J， Liu Y， Yin P， Yao G P， Yan G Q， Deng C H， Zhang X M. Proteomics， 2010， 10： 2000-2014

17 Wang Y L， Liu M B， Xie L Q， Fang C Y， Xiong H M， Lu H J. Anal. Chem.， 2014， 86： 2057-2064

18 Liu J X， Qu Y Y， Yang K G， Wu Q， Shan Y C， Zhang L H， Liang Z， Zhang Y K. ACS Appl. Mater. Interfaces， 2014， 6： 2059-2066

19 Bie Z J， Chen Y， Li H， Wu R， Liu Z. Anal. Chim. Acta， 2014， 834： 1-8

20 Li Q J， Lü C C， Li H Y， Liu Y C， Wang H Y， Wang X， Liu Z. J. Chromatogr. A， 2012， 1256： 114-120

21 Li D， Li Q， Wang S， Ye J， Nie H， Liu Z. J. Chromatogr. A， 2014， 1339： 103-109

22 Li H， Shan Y H， Qiao L Z， Dou A， Shi X Z，Xu G W. Anal. Chem.， 2013， 85： 11585-11592

23 Jiang H P， Qi C B， Chu J M， Yuan B F， Feng Y Q. Sci. Rep.， 2015， 5： 1-9

24 Li L， Lu Y， Bie Z J， Chen H Y， Liu Z. Angew. Chem. Int. Ed.， 2013， 52： 7451-7454

25 Ye J， Chen Y， Liu Z. Angew. Chem. Int. Ed.， 2014， 53： 10386-10389

26 Bi X D， Liu Z. Anal. Chem.， 2014， 86： 959-966

27 Bi X D， Liu Z. Anal. Chem.， 2014， 86： 12382-12389

28 Pan X H， Chen Y， Zhao P X， Li D J， Liu Z. Angew. Chem. Int. Ed.， 2015， 54： 6173-6176

29 O′Hagan D. J. Fluor. Chem.， 2010， 131： 1071-1081

30 Purser S， Moore P R， Swallow S， Gouverneur V. Chem. Soc. Rev.， 2008， 37： 320-330

31 Yan J， Springsteen G， Deeter S， Wang B H. Tetrahedron， 2004， 60： 11205-11209

32 Lü C C， Li H Y， Wang H Y， Liu Z. Anal. Chem.， 2013， 85： 2361-2369

33 Tanaka Y， Terabe S. J. Chromatogr. B， 2002， 768 （1）： 81-92

34 Britz-McKibbin P， Chen D D Y. Electrophoresis， 2002， 23 （6）： 880-888

35 Ostergaard J， Jensen H， Hoim R. J. Sep. Sci.， 2009， 32 （10）： 1712-1721

36 Springsteen G， Wang B H. Tetrahedron， 2002， 58： 5291-5300

37 Li H Y， Liu Y C， Liu J， Liu Z. Chem. Commun.， 2011， 47 （28）： 8169-8171

38 Li H Y， Wang H Y， Liu Y C， Liu Z. Chem. Commun.， 2012， 48 （34）： 4115-4117

39 Shoji E， Freund M S. J. Am. Chem. Soc.， 2002， 124 （42）： 12486-12493

40 Nicholls M P， Paul P K C. Org. Bio. Chem.， 2004， 2 （10）： 1434-1441

41 Wiskur S L， Lavigne J L， Metzger A， Tobey S L， Lynch V， Anslyn E V. Chem. Eur. J.， 2004， 10 （15）： 3792-3804

42 Eggert H， Frederiksen J， Morin C， Norrild J C. J. Org. Chem.， 1999， 64： 3846-3852

43 Tsukagoshi K， Shinkai S. J. Org. Chem.， 1991， 56（13）： 4089-4091

44 Norrild J C， Eggert H. J. Am. Chem. Soc.， 1995， 117： 1479-1484