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    基于流動(dòng)注射光度法的吸光度/留存時(shí)間比自動(dòng)測(cè)定過氧化物酶活性方法

    2015-11-03 07:48李永生鄭巍高秀峰
    分析化學(xué) 2015年10期
    關(guān)鍵詞:過氧化氫

    李永生 鄭巍 高秀峰

    摘 要 本研究給出了流動(dòng)注射分光光度系統(tǒng)(FI-SP)測(cè)定酶活性濃度(Ec)的通用公式Ec=kΔA/Δt; Δt是在酶促反應(yīng)線性響應(yīng)區(qū)域內(nèi)試樣塞的平均留存時(shí)間;ΔA為平均留存時(shí)間處對(duì)應(yīng)的吸光度; k=nV/(εvL),V為樣品注入點(diǎn)到流通池入口之間的管路總?cè)莘e,n為酶底物與產(chǎn)物的反應(yīng)摩爾比,ε為產(chǎn)物的摩爾吸收系數(shù),v為注入的酶液體積,L為流通池光程;FI-SP系統(tǒng)確定后k為常數(shù)。在此基礎(chǔ)上,將H2O2/過氧化物酶(POD)/愈創(chuàng)木酚(GA)反應(yīng)體系導(dǎo)入FI-SP系統(tǒng),建立了一種無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線的POD活性快速準(zhǔn)確測(cè)定的新方法。此方法優(yōu)化后的條件:載流磷酸鹽緩沖液濃度為0.05 mol/L(pH 5.5),進(jìn)樣體積為40 μL,反應(yīng)盤管長(zhǎng)度200 cm, 1.5 mmol/L H2O2,3.5 mmol/L GA,0.4 mol/L HCl(清洗液),檢測(cè)波長(zhǎng)470 nm,產(chǎn)物的摩爾吸光系數(shù)為0.0125 L(μmol ·cm)。本方法的重現(xiàn)性RSD<0.38%(n=11),分析速度為40樣/h,測(cè)定范圍為450~7260 U/L,檢出限為89 U/L。在優(yōu)化條件及60℃下,用本方法測(cè)定了多種白蘿卜中POD活性,結(jié)果與動(dòng)力學(xué)曲線法完全相同。

    關(guān)鍵詞 流動(dòng)注射分析;過氧化物酶;蘿卜提取液;愈創(chuàng)木酚;過氧化氫

    1 引 言

    過氧化物酶(POD, EC 1.11.1.7)是一種廣泛存在于植物和動(dòng)物體內(nèi)的酶,被應(yīng)用在臨床檢驗(yàn)[1]、環(huán)境監(jiān)測(cè)[2]、有機(jī)合成[3]和食品分析[4]等領(lǐng)域,大多數(shù)生化試劑盒都含有POD,其最重要的指標(biāo)就是酶活性。因此,POD活性的快速準(zhǔn)確定量尤為重要。POD能催化酚類或胺類顯色試劑與H2O2的反應(yīng);常用的顯色試劑有鄰苯二胺[5]、季胺[6]、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)[7]、鄰苯三酚[8]、愈創(chuàng)木酚(GA)[9]、以及胺和酚類的耦合物[1,10]。這些顯色劑在POD催化下與H2O2反應(yīng)生成的產(chǎn)物都可通過比色法進(jìn)行定量,但最常用的顯色劑是低毒性、廉價(jià)的GA。早先認(rèn)為H2O2/POD/GA體系的產(chǎn)物是愈創(chuàng)木酚四聚體(4-GA)[9],但新的研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物是愈創(chuàng)木酚二聚體(2-GA)[11~13]。我們驗(yàn)證了此結(jié)果并發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)物不穩(wěn)定,會(huì)很快分解成其它物質(zhì)而褪色[14], 這導(dǎo)致采用手工比色法定量POD活性時(shí)得到的結(jié)果重現(xiàn)性很差。此外,由于該產(chǎn)物不穩(wěn)定,難以提純,所以只能通過反應(yīng)物GA的濃度間接地求得反應(yīng)體系中產(chǎn)物2-GA的摩爾吸光系數(shù)(ε)[15],并用此ε值去計(jì)算POD活性;但這又會(huì)由于ε差異導(dǎo)致得到的POD活性值產(chǎn)生較大的誤差。

    測(cè)定POD活性方法除比色法外[16], 還有熒光光度法[17,18]和化學(xué)發(fā)光法[19~21]等。測(cè)定POD活性的手工熒光法和化學(xué)發(fā)光法靈敏度高、線性范圍寬;但是,由于POD催化反應(yīng)的產(chǎn)物激發(fā)波長(zhǎng)在紫外區(qū),所以被測(cè)樣品中存在的雜蛋白會(huì)對(duì)熒光法產(chǎn)生干擾;手工化學(xué)發(fā)光法的靈敏度雖高但測(cè)定結(jié)果的重現(xiàn)性較差。流動(dòng)注射分析(Flow injection analysis, FIA)作為一種自動(dòng)化分析技術(shù),具有操作簡(jiǎn)便、分析速度快、精度高等優(yōu)點(diǎn)[22],它能與各種檢測(cè)器組合用于酶活性的自動(dòng)快速測(cè)定[23~25]。Holm[7]用ABTS作為供氫體,利用流動(dòng)注射光度法對(duì)發(fā)酵樣品中微生物POD活性進(jìn)行了測(cè)定;但此方法的不足之處是ABTS試劑的價(jià)格昂貴且穩(wěn)定性也較差。本研究選擇價(jià)廉、穩(wěn)定、且被廣泛應(yīng)用的GA作為供氫體,基于FIA光度法建立了一種新的測(cè)定POD活性的分析流路(Flow-injection spectrophotometry for POD, FIA-SP-POD),并對(duì)蘿卜提取液中的POD含量及活性進(jìn)行了測(cè)定。

    2 實(shí)驗(yàn)部分

    2.1 儀器與試劑

    安裝10 mm光程流通池的UV-1800PC型紫外/可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá));AUW120D型電子天平(日本島津公司);800-1型離心機(jī)(常州普天儀器制造有限公司);JYZ-E6型原汁機(jī)(九陽(yáng)股份有限公司);FIA-3100流動(dòng)注射處理儀(北京吉天儀器有限公司);ASB-200恒溫控制器(日本分光株式會(huì)社);CP224S分析天平(德國(guó)賽多利斯集團(tuán));pXJ-1C+離子活度計(jì)(成都世紀(jì)方舟科技有限公司);SHZ-D循環(huán)水式真空泵(鄭州金育科貿(mào)有限公司);800B臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

    GA (國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、HRP(≥250 U/mg, Sigma公司);實(shí)驗(yàn)用水為超純水(電導(dǎo)率0.065 μS/cm);其余試劑均為分析純。新鮮白蘿卜購(gòu)于本地超市。

    2.2 蘿卜粗酶液制備

    稱取50 g新鮮白蘿卜,切成小塊(約1 cm3),置于榨汁機(jī)中榨汁,用真空泵將濾渣進(jìn)行抽濾,合并兩次收集的濾液,然后在4000 r/min下離心10 min;最后用針式過濾器(13 mm/0.45 μm)將離心上清液進(jìn)行過濾;濾液即為粗酶液, 置于冰箱4℃下保存。

    2.3 測(cè)定原理

    2.4 FIA系統(tǒng)及測(cè)定過程

    FIA-SP-POD系統(tǒng)見圖1。測(cè)定過程為:當(dāng)雙通道注入閥(V)轉(zhuǎn)至“采樣”位置時(shí),酶試樣在P1的抽吸作用下充滿樣品定量環(huán)(SL),多余的樣品從W2排出,采用P1抽吸采樣,可縮短試樣流經(jīng)途徑,達(dá)到節(jié)省試樣目的;當(dāng)此閥轉(zhuǎn)至“注入”位置時(shí),PBS緩沖液載流(C)推動(dòng)SL中“酶樣品塞”進(jìn)入反應(yīng)盤管,與反應(yīng)試劑(R1)匯合,樣品塞中的POD催化H2O2/GA反應(yīng)生成2-GA,流經(jīng)流通式檢測(cè)器,給出吸光度信號(hào)(A);試樣從注入到產(chǎn)物出現(xiàn)最大吸收峰之間的留存時(shí)間為Δt;與此同時(shí),HCl清洗液被P2吸入清洗液定量環(huán)(RL),多余的清洗液從W1排出。當(dāng)此閥再轉(zhuǎn)至“采樣”位置時(shí),PBS緩沖液載流(C)推動(dòng)RL中的HCl清洗液塞,依次進(jìn)入反應(yīng)盤管和流通池進(jìn)行自動(dòng)清洗,檢測(cè)器給出基線信號(hào)(Ao),兩者之差為ΔA(A-Ao)。將此ΔA/Δt代入公式(3)可求得Ec。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 FIA系統(tǒng)參數(shù)的優(yōu)化

    基于前期手工法[27]將FIA-SP-POD系統(tǒng)的初始條件設(shè)定如下:1.5 mmol/L GA,0.5 mmol/L H2O2,兩者等體積混合作為R1; POD樣品的注入體積60 μL;0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 5.5)作為載流;0.4 mol/L HCl作為清洗液;P1轉(zhuǎn)速20 r/min (1.73 mL/min),P2轉(zhuǎn)速20 r/min;反應(yīng)盤管(Φ 0.8 mm)長(zhǎng)度為200 cm;背壓管(Φ 0.3 mm)長(zhǎng)度為50 cm。采用單因素優(yōu)選法考察了FIA法測(cè)定POD活性時(shí)的影響因素。

    3.1.1 反應(yīng)盤管最適長(zhǎng)度的考察 在FIA-SP-POD系統(tǒng)中,反應(yīng)盤管長(zhǎng)度影響反應(yīng)進(jìn)程和分析速度。因此,用白蘿卜提取液作為測(cè)試樣品,考察了RC長(zhǎng)度(150, 200, 250, 300和350 cm)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物吸光度的影響。得到的結(jié)果表明,RC長(zhǎng)度增加,產(chǎn)物吸光度先增大后逐漸減小,RC長(zhǎng)度在200 cm 時(shí)ΔA最大。其原因是:RC長(zhǎng)度較短時(shí)反應(yīng)時(shí)間短,導(dǎo)致反應(yīng)不充分;RC太長(zhǎng)時(shí),反應(yīng)產(chǎn)物的生成速率小于其在管路中被稀釋的速率,導(dǎo)致吸光度值緩慢下降。所以本系統(tǒng)的RC選定為200 cm。

    3.1.2 試樣環(huán)最適體積的考察 FIA-SP-POD系統(tǒng)中采樣環(huán)(SL)的體積即為POD溶液的體積,系統(tǒng)中加入的POD量不同導(dǎo)致酶催化速率不同,進(jìn)而影響FIA系統(tǒng)的靈敏度,因此,在RC為200 cm的前體下,考察了SL(30, 40, 50, 60和70 μL)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物吸光度的影響。結(jié)果表明,SL增加基本上不影響產(chǎn)物吸光度值;

    其原因可能是H2O2與GA反應(yīng)已達(dá)到平衡,再增加SL僅僅是酶過量而沒有增加反應(yīng)產(chǎn)物的生成量??紤]到方法靈敏度及節(jié)省試樣的因素,選定SL為40 μL。

    3.1.3 FIA系統(tǒng)基線漂移的消除 研究發(fā)現(xiàn),在FIA-SP-POD系統(tǒng)中H2O2與GA反應(yīng)所生成的褐色2-GA,容易吸附在流通池中,導(dǎo)致FIA系統(tǒng)的基線漂移。所以,為了減小由于2-GA導(dǎo)致的基線漂移,在FIA系統(tǒng)導(dǎo)入清洗液。即在FIA流路中設(shè)計(jì)了一個(gè)異步注入閥,利用此閥將清洗液在“酶試樣塞”之后注入FIA系統(tǒng)(60 μL),以達(dá)到對(duì)FIA系統(tǒng)自動(dòng)清洗,減小基線漂移的效果。

    為了考察此效果,在FIA系統(tǒng)中分別用HCl和NaOH作為清洗液,蘿卜提取液作為測(cè)試樣品,得到了圖2中的兩條實(shí)測(cè)曲線。隨著清洗液濃度(HCl和NaOH)增加,基線漂移值減??;在相同濃度下,HCl的清洗效果(基線漂移值)優(yōu)于NaOH。所以,最后選取0.4 mol/L HCl溶液作為清洗劑。

    3.2 反應(yīng)體系影響因素的考察

    3.2.1 POD最適溫度 溫度是影響POD活性的因素之一。低溫使酶活性不能完全顯現(xiàn),高溫又會(huì)使酶蛋白變性,喪失活性。將FIA-SP-POD系統(tǒng)的RC置于恒溫控制器內(nèi),先用熱電偶對(duì)RC出口液的溫度進(jìn)行校正,然后用白蘿卜提取液作為測(cè)試樣品,在不同溫度下(25℃~70℃)考察了溫度與白蘿卜POD活性的相關(guān)性。結(jié)果見圖3a。在60℃時(shí), 酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的ΔA最大(此時(shí)FIA系統(tǒng)的平均留存時(shí)間Δt都相同,所以ΔA與反應(yīng)速率ΔA/Δt及Ec成正比關(guān)系),當(dāng)溫度大于60℃時(shí), ΔA開始降低,即高溫導(dǎo)致POD失活,POD的催化活力下降。由此可知白蘿卜POD最適溫度為60℃,此結(jié)果與文獻(xiàn)\[28\]一致。

    3.2.2 POD最適pH值 酸度對(duì)酶活性的影響,不是酸、堿對(duì)酶分子解離狀態(tài)的影響,而是對(duì)酶活性中心或相關(guān)基團(tuán)解離狀態(tài)的影響。因此本實(shí)驗(yàn)用白蘿卜提取液作為測(cè)試樣品,考察了磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L)的酸度(pH 3.0~9.0)對(duì)反應(yīng)體系中POD活性的影響。除溫度控制在60℃外,其它條件同上。由圖3b所示的結(jié)果可知,當(dāng)pH 在3~5.5范圍時(shí),pH 增加,ΔA增大,即POD催化生成的產(chǎn)物增多;在pH 5.5~9.0范圍時(shí),pH 增加,ΔA反而降低,即POD催化生成的產(chǎn)物減少;在pH 5.5時(shí)產(chǎn)物最多即POD活性最強(qiáng)。由此可知蘿卜中所含的POD的最適pH 為5.5。

    3.2.3 H2O2濃度的考察 在上述優(yōu)選條件下,考察反應(yīng)體系中H2O2濃度(0~2.0 mmol/L)對(duì)POD催化反應(yīng)的影響。得到的結(jié)果見圖3c??梢钥闯觯涸诮o定的Δt值下,H2O2濃度增加,產(chǎn)物ΔA逐漸增大,當(dāng)此濃度大于1.5 mmol/L時(shí),產(chǎn)物ΔA不再變化,即POD催化產(chǎn)物的生成速率趨于穩(wěn)定。因此, 將H2O2濃度設(shè)定為1.5 mmol/L。在此基礎(chǔ)上,以H2O2為底物作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖,根據(jù)雙倒數(shù)圖的截距,計(jì)算得到以H2O2為底物的米氏常數(shù)(Km)為0.21 mmol/L,酶促反應(yīng)最大速度(Vmax)為1.155 mmol/(L·min)。

    3.2.4 GA濃度的考察 在上述優(yōu)選條件下,也考察了GA濃度(0~4.0 mmol/L)對(duì)POD酶催化反應(yīng)的影響。得到的結(jié)果見圖3d。在給定的Δt值下,曲線的變化趨勢(shì)與H2O2底物相似,即隨著GA/POD/H2O2反應(yīng)體系中GA濃度增大,ΔA先迅速增大后不再變化;當(dāng)濃度大于3.5 mmol/L時(shí),反應(yīng)速率(ΔA/Δt)趨于穩(wěn)定。故本系統(tǒng)選定GA濃度為3.5 mmol/L。同樣以GA為底物作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖,再根據(jù)此圖計(jì)算出以GA為底物的Km′和Vmax′值分別為0.20 mmol/L和0.539 mmol L1·min1。結(jié)果表明:白蘿卜POD與GA之間的親和力與H2O2相差不大。

    3.3 干擾離子對(duì)POD活性測(cè)定影響

    金屬離子可能與POD形成絡(luò)合物進(jìn)而影響POD活性,本實(shí)驗(yàn)考察了4種鹽溶液(FeCl3, CuSO4, ZnSO4, CoSO4)對(duì)POD活性測(cè)定的影響。實(shí)驗(yàn)時(shí),白蘿卜POD作為測(cè)試樣品,在0~0.8 mmol/L范圍內(nèi)改變FIA-SP-POD系統(tǒng)載流中的金屬離子濃度,得到的結(jié)果見圖4。從圖4a可知,隨著Fe3+, Cu2+, Zn2+, Co2+濃度的增加,在給定的Δt值下,相關(guān)的ΔA都有增大的趨勢(shì),即Fe3+, Cu2+, Zn2+, Co2+對(duì)POD均有一定程度的激活作用;POD激活順序?yàn)镕e3+ > Cu2+ > Zn2+ > Co2+。所以,在提取白蘿卜POD時(shí),要避免接觸這些金屬離子,防止發(fā)生酶促褐變。

    此外,在載流中分別添加檸檬酸(0~20 mmol/L)、抗壞血酸(0~0.2 mmol/L)和L-半胱氨酸(0~2.0 mmol/L),考察了這些有機(jī)酸類對(duì)POD活性的影響。從得到的圖4b~d 3條曲線可以看出:添加的有機(jī)酸濃度增大,在給定的Δt值下吸光度都逐漸降低。這表明這3種有機(jī)酸對(duì)POD活性有明顯的抑制作用,其抑制作用順序?yàn)榭箟难?L-半胱氨酸>檸檬酸。由于L-半胱氨酸和檸檬酸都與POD活性中心的Fe3+發(fā)生螯合反應(yīng),使酶活性中心失去催化功能,因而抑制了POD的活性或減弱了POD與底物的親和力。

    3.4 摩爾吸收系數(shù)測(cè)定

    常規(guī)比色法測(cè)定POD活性時(shí),是利用H2O2/POD/GA體系反應(yīng)產(chǎn)物在470 nm處的ΔA值,帶入公式(2)計(jì)算得到。但本研究發(fā)現(xiàn):ε值是準(zhǔn)確定量POD酶活性的最關(guān)鍵因素;當(dāng)所用儀器(波長(zhǎng)分辨率、靈敏度)及方法的測(cè)試條件(溫度、pH 及溶劑)不同時(shí)得到的ε不同。所以,計(jì)算POD活性時(shí)不能直接將文獻(xiàn)或商家給出的ε值代入公式(2)進(jìn)行計(jì)算,須在選定條件下用所選儀器進(jìn)行測(cè)定。

    因此,本實(shí)驗(yàn)對(duì)準(zhǔn)確測(cè)定ε2-GA方法進(jìn)行了研究。由于2-GA不穩(wěn)定、無(wú)法提純,不能通過直接測(cè)定其吸光度值得到ε2-GA值,只能利用GA濃度間接求出2-GA的濃度(2H2O+2GA(POD)2-GA+4H2O)。理論上,當(dāng)H2O2/POD/GA體系中POD過量, 且H2O2濃度遠(yuǎn)大于GA時(shí),可認(rèn)為GA完全轉(zhuǎn)化為2-GA。所以, 對(duì)所需的POD活性濃度、H2O2/GA濃度比進(jìn)行了考察。

    3.4.1 GA完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的HRP活性濃度 用商品化的HRP作為測(cè)試樣品,分別取20 μL的50, 100, 250, 500, 1000和2500 U/L HRP,加入0.5 mmol/L H2O2+1.5 mmol/L GA混合液中[26]測(cè)定2-GA的吸光度,結(jié)果見圖5a。當(dāng)HRP濃度小于1.0 kU/L時(shí),2-GA的吸光度隨HRP活性濃度增加而增大,當(dāng)HRP濃度大于1.0 kU/L時(shí),2-GA的吸光度不再變化,即此時(shí)HRP活性濃度能使GA完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。

    3.4.2 GA完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的H2O2的濃度 選定HRP為1.0 kU/L、GA濃度為0.2 mmol/L,使其與不同濃度的H2O2(0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0和2.0 mmol/L)按1+1混合,測(cè)定其產(chǎn)物2-GA的吸光度,結(jié)果見圖5b,產(chǎn)物吸光度隨H2O2濃度增加呈線性增加趨勢(shì),當(dāng)H2O2濃度大于GA濃度的5倍時(shí),產(chǎn)物吸光度不再隨H2O2濃度而變化。由此得出結(jié)論:當(dāng)HRP為1.0 kU/L、H2O2/GA濃度比大于5時(shí),GA能完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物2-GA。因此,此時(shí)可根據(jù)已知的GA濃度換算出反應(yīng)系統(tǒng)中的2-GA濃度,再將其帶入朗伯-比爾定律,就求得ε2-GA。在室溫(~20℃)下,用手工比色和5點(diǎn)平均數(shù)據(jù)得到的ε2-GA值為0.0122±0.0031 L/(μmol·cm)。

    3.4.3 產(chǎn)物摩爾吸收系數(shù)的平均值 為了得到FIA法測(cè)定白蘿卜POD的ε2-GA,用稀釋一倍后的白蘿卜粗酶液作為樣品(Ec>1.0 kU/L),F(xiàn)IA系統(tǒng)中載流為PBS緩沖液(pH 5.5),R1(H2O2/GA)按1+1混合、且濃度比大于5 (H2O2/GA: 1.5/0.01, 1.5/0.04, 1.5/0.08, 1.5/0.12, 1.5/0.16, 1.5/0.20和1.5/0.24 mmol/L),在60℃下測(cè)定了FIA-SP-POD系統(tǒng)中H2O2/POD/GA反應(yīng)體系形成的產(chǎn)物吸光度,并將換算出的2-GA濃度(1.25, 5, 10, 15, 20, 25和30 μmol/L,c2-GA= 1000×(cGA/4)/2)與其吸光度值進(jìn)行數(shù)學(xué)回歸,最后得到相關(guān)的線性方程:ΔA=0.0125c2-GA+0.050 (r=0.9995);此斜率值0.0125 L (μmol cm)1即為本系統(tǒng)的ε2-GA平均值。

    3.5 蘿卜POD活性測(cè)定

    考察了POD的線性響應(yīng)范圍和精密度以及檢出限。在優(yōu)選條件下,一系列HRP標(biāo)液作為樣品,用FIA-SP-POD系統(tǒng)檢出它們?cè)讦下的ΔA值,然后代入公式3,求出對(duì)應(yīng)的POD活性值。結(jié)果表明:在給定的Δt(0.53 min)下,在450~7260 U/L范圍內(nèi)HRP活性濃度與ΔA值呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)(ΔA=0.00013Ec+ 0.0012,r=0.9985)。隨后,分別用500 U/L、2500 U/L HRP標(biāo)液進(jìn)行11次測(cè)定,得到兩組標(biāo)液的RSD分別為0.62%(c=501±3 U/L)、0.31%(c=2530±8 U/L);此結(jié)果表明本方法測(cè)定POD活性濃度的精度很好;用 500 U/L HRP為樣品,計(jì)算得到本方法的檢出限為7.0 U/L (cL=3SD/K, SD=0.000326, K=0.00013)。

    用pH 5.5磷酸鹽緩沖液將蘿卜提取液按10%, 15%, 20%, 25%, 30%和35%比例稀釋成6個(gè)樣品(Ec10~Ec35),分別注入FIA-SP-POD系統(tǒng),在給定的Δt下,檢測(cè)其催化產(chǎn)物的ΔA(0.067, 0.105, 0.135, 0.170, 0.193, 0.220),得到了一條蘿卜提取液與ΔA呈良好線性關(guān)系的相關(guān)曲線(ΔA=0.638c+0.004, r=0.9965), 表明本方法基于平均留存時(shí)間(Δt)處的ΔA能快速準(zhǔn)確地定量POD活性濃度。

    另外,模擬手工酶動(dòng)力學(xué)曲線法在本系統(tǒng)上采用流動(dòng)注射停留法,對(duì)上述稀釋的蘿卜POD活性進(jìn)行了測(cè)定。操作過程是:注入酶樣品32s后停泵(在響應(yīng)峰的最大值之后停泵),連續(xù)記錄H2O2/POD/GA體系在后30s期間內(nèi)的催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線(ΔA vs Δt),根據(jù)此區(qū)間曲線的斜率,求得POD活性濃度。得到的數(shù)據(jù)表明,停留法的結(jié)果(Ec10:777±3 U/L,Ec15:1211±13 U/L,Ec20:1470±14 U/L,Ec25:1760±30 U/L, Ec30:2075±20 U/L,Ec35:2268±23 U/L)與上述FIA-SP-POD系統(tǒng)的結(jié)果(Ec10:706±8 U/L,Ec15:1105±6 U/L,Ec20:1425±22 U/L,Ec25:1802±6 U/L,Ec30:2034±27 U/L,Ec35:2323±32 U/L)是一致的。

    選取4種蘿卜的提取液作為酶樣品,用FIA-SP-POD系統(tǒng)測(cè)定其產(chǎn)物的吸光度,然后代入公式3,得到POD活性值。得到結(jié)果為:紅皮蘿卜(14673 U/L)>青蘿卜(14365 U/L)>圓蘿卜(13076 U/L)>白蘿卜(8309 U/L)。為了考察本方法的可靠性,用HRP標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)(表1)??紤]到HRP自然失活的影響,每次加標(biāo)實(shí)驗(yàn)前先對(duì)HRP活性進(jìn)行了校正。本方法的回收率在95.2%~107.1%之間,結(jié)果滿意。

    4 結(jié) 論

    本研究基于H2O2/POD/GA反應(yīng)體系,利用流動(dòng)注射吸光度/留存時(shí)間比值法,建立了一種無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線的POD活性快速準(zhǔn)確測(cè)定新方法,分析速度可達(dá)40樣/h。用本方法測(cè)定POD活性,不但減少了手工操作帶來的誤差,而且具有準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好、分析速度快、自動(dòng)化程度高的優(yōu)點(diǎn)。

    References

    1 Padmarajaiah N, Honnur K, Anantharaman S, Ashwinee K S. Clin. Biochem., 2012, 45: 139-143

    2 Azevodo A M, Martins V C, Prazeres D M. Biotech. Annual Review, 2003, 9: 199-247

    3 Lopes G R, Pinto D C G A , Silva A M S. RSC Adv., 2014, 4(70): 37244-37265

    4 Shekhovtsova T N, Muginova S V, Luchinina J A, Galimova A Z. Anal. Chim. Acta, 2006, 573: 125-132

    5 WEI Ran-Fei, GAO Xiu-Feng, LI Yong-Sheng, WANG Heng, FANG Yuan. Chinese J. Anal. Chem., 2009, 37(6): 897-901

    魏然飛, 高秀峰, 李永生, 王 恒, 方 園. 分析化學(xué), 2009, 37(6): 897-901

    6 LI Jian-Guo, LIU Yin, JU Huang-Xian. Acta Chim. Sin., 2007, 65(15): 1499-1503

    李建國(guó), 劉 穎, 鞠熀先. 化學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 65(15): 1499-1503

    7 Holm K A. Analyst, 1995, 120(8): 2101-2105

    8 Ghadiri M, Kariminia H R, Azad R R. Ecotox. Environ. Safe., 2013, 91: 117-121

    9 Vieira I d C, Fatibello-Filho O. Analyst, 1998, 123: 1809-1812.

    10 Molaei R A, Ghourchian H, Moosavi-Movahedi A A, Hong J, Nazari K. Anal. Biochem., 2007, 362: 38-43

    11 Doerge D R, Divi R L, Mona I. Anal. Biochem., 1997, 250(1): 10-17

    12 Tonami H, Uyama H, Nagahata R, Kobayashi S. Chem. Letters, 2004, 33(7): 796-797

    13 HwangS P, Lee C H, Ahn I S. J. Ind. Eng. Chem., 2008, 14: 487-492

    14 CHENG Ting-Mei, LI Yong-Sheng, GAO Xiu-Feng. Chinese J. Anal. Lab., 2011, 30(8): 6-10

    陳婷梅, 李永生, 高秀峰. 分析試驗(yàn)室, 2011, 30(8): 6-10

    15 Robert B M, Lawrence W B, Robert W B,Rlchard C K, George N B. Clin. Chem., 1976, 22(2): 141-150

    16 WEI Yong-Feng, YAN Hong-Tao. Spectro. Spect. Anal., 2001, 21(5): 704-706

    魏永鋒, 閆宏濤. 光譜學(xué)與光譜分析, 2001, 21(5): 704-706

    17 CI Yun-Xiang, CHEN Lie, WEI Shan. Chem. J. Chinese Universities, 1990, 11(1): 81-83

    慈云祥, 陳 列, 魏 珊. 高等學(xué)?;瘜W(xué)學(xué)報(bào), 1990, 11(1): 81-83

    18 WEI Yong-Feng, YAN Hong-Tao. Chinese J. Anal. Chem., 2000, 28(1): 99-101

    魏永鋒, 閆宏濤. 分析化學(xué), 2000, 28(1): 99-101

    19 Sherman D H. Trends Biotechnology, 1984, 2(1): 1-2

    20 YANG Xiu-Cen,WU Li-Ping, CHEN Da-Jin, ZENG Yao. J. West China University of Medical Sci., 1990, 21(3): 293-297

    楊秀岑, 伍莉萍, 陳達(dá)進(jìn), 曾 瑤. 華西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 1990, 21(3): 293-297

    21 JI Zheng-Ping, WANG Jun, HAN Jing, HU Xiao-Ya. Chinese J. Anal. Chem, 2011, 39(7): 1100-1103

    嵇正平, 王 俊, 韓 靜, 胡效亞. 分析化學(xué), 2011, 39(7): 1100-1103

    22 Li Y S, Gao X F. Flow Injection Analysis and Application for Chemistry Analysis. The Jilin People′s Publisher, 2002: 1-14

    23 Recktenwald A, Kroner K H, Kula M R. Enzyme and Microbial Technology, 1985, 7(12): 607-612

    24 Huang H P, Cai R X, Du Y M, Lin Z X, Zeng Y E. Anal. Chim. Acta, 1995, 318: 63-69

    25 Van Staden J. F., Mulaudzi L. V. Anal. Chim. Acta, 2000, 421(1): 19-25

    26 NC-ICB. Eur. J. Biochem., 1979, 97: 319-320

    27 ZHANG Zhao, LI Yong-Sheng, GAO Xiu-Feng. Sci. Tech. Food Industry, 2013, 34(12): 187-191

    張 朝, 李永生, 高秀峰. 食品工業(yè)科技, 2013, 34(12): 187-191

    28 WANG Lin, WANG Lin-Song, MA Jian-Min. J. Henan Normol University (Natural Science), 2004, 32(3): 81-83

    王 琳, 王林嵩, 馬劍敏. 河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2004, 32(3): 81-83

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