有機(jī)溶劑輔助封閉式電噴霧離子源的設(shè)計(jì)及其在痕量蛋白質(zhì)組樣品分析中的應(yīng)用

朱旭東等

摘 要 將康達(dá)效應(yīng)應(yīng)用于電噴霧離子源，設(shè)計(jì)了氣氛可調(diào)康達(dá)效應(yīng)電噴霧離子源（Coanda effect electrospray ionization source， CEESI）。考察了不同飽和蒸氣壓、不同極性的有機(jī)溶劑對(duì)標(biāo)準(zhǔn)肽段在質(zhì)譜上信號(hào)響應(yīng)的影響。結(jié)果表明，輔助氣中添加乙醇后，標(biāo)準(zhǔn)肽段質(zhì)譜信號(hào)提高約1000倍，而且對(duì)于1 ng BSA酶解產(chǎn)物，蛋白序列覆蓋率提高約10%。在最佳條件下，采用nano-HPLC-CEESI-LTQ XL MS系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了6， 10， 20和50 ng HeLa細(xì)胞全提蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的定性分析，與常用的開(kāi)放式nano-ESI相比，肽段和蛋白質(zhì)的可鑒定數(shù)目分別提高20%～360%和20%～200%。本研究表明，采用CEESI源有利于痕量蛋白質(zhì)組樣品的高靈敏度分析。

關(guān)鍵詞 康達(dá)效應(yīng)； 電噴霧離子源； 蛋白質(zhì)組； 痕量分析

1 引 言

高效液相色譜-電噴霧離子化質(zhì)譜（HPLC-ESI MS）技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組樣品分析[1，2]。由于蛋白質(zhì)組樣品具有組成復(fù)雜、蛋白含量動(dòng)態(tài)范圍寬、物理化學(xué)性質(zhì)各異等特點(diǎn)，因此對(duì)分析方法的靈敏度提出了越來(lái)越高的要求。提高ESI過(guò)程的離子化效率、降低離子間相互抑制作用已成為一種有效途徑[3]。眾所周知，當(dāng)HPLC的流速降低至納升級(jí)時(shí)，電噴霧可產(chǎn)生更小的霧滴，離子化效率得到明顯改善[4]，同時(shí)離子抑制和基質(zhì)效應(yīng)也會(huì)被顯著抑制[5，6]。因此，納噴離子源已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)樣品分析[1，2]。

在改善檢測(cè)靈敏度的前提下，提高ESI源的噴霧穩(wěn)定性也至關(guān)重要。目前，最常用的開(kāi)放式納噴離子源容易受到外界環(huán)境的影響，會(huì)出現(xiàn)噴霧不穩(wěn)定的情況[7]。然而，封閉式電噴霧離子源[8]在噴針和質(zhì)譜采樣錐之間的空腔形成低壓，可獲得穩(wěn)定噴霧； 同時(shí)通過(guò)增加輔助氣，如空氣或氮?dú)?，可改善離子傳輸效率。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[9～12]，輔助氣中添加氣化的有機(jī)溶劑可以顯著改變肽段電荷分布，并提高肽段離子化效率。Li等[9]在輔助氣中添加醇類或羧酸類蒸汽，可將肽段的MS信號(hào)增強(qiáng)3～4倍，鑒定的大腸桿菌蛋白質(zhì)數(shù)目增加14%。Asperger等[12]發(fā)現(xiàn)，輔助氣中添加乙腈可提高糖肽電荷數(shù)，使其在電子轉(zhuǎn)移解離（Electrontransfer dissociation，ETD）中獲得更高的碎裂效率。此外，有機(jī)溶劑添加的輔助氣還可以降低基質(zhì)干擾。de Muth等[13]發(fā)現(xiàn)，有機(jī)溶劑添加的輔助氣，尤其是乙腈，可以有效降低金屬離子干擾。上述研究表明，氣氛輔助封閉式納噴離子源在獲得穩(wěn)定噴霧、高效離子化的同時(shí)，還可以提高質(zhì)譜響應(yīng)，因此有望用于痕量蛋白質(zhì)組樣品的高靈敏度分析。

康達(dá)效應(yīng)亦稱附壁作用，即流體（水流或氣流）有離開(kāi)本來(lái)的流動(dòng)方向，改為隨著凸出物體流動(dòng)的傾向。結(jié)合康達(dá)效應(yīng)，本研究設(shè)計(jì)了新型CEESI源，評(píng)價(jià)了不同輔助氣氣氛對(duì)標(biāo)準(zhǔn)肽段的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度的影響； 在最佳輔助氣類型和分壓條件下，實(shí)現(xiàn)了痕量HeLa細(xì)胞蛋白質(zhì)組的定性分析。同時(shí)與開(kāi)放式nano-ESI源進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，采用新型CEESI可將肽段和蛋白質(zhì)鑒定數(shù)目分別提高20%～360%和20%～200%。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

毛細(xì)管高效液相色譜-電噴霧-線性離子阱質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）； 康達(dá)效應(yīng)電噴霧離子源（浙江好創(chuàng)生物技術(shù)有限公司）； Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

磷酸化標(biāo)準(zhǔn)肽段（序列：STSSDQPSpYSLE，上海強(qiáng)耀生物科技有限公司）； 甲酸（FA）、二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT）、碘代乙酰胺（Iodoacetamide，IAA）、牛血清白蛋白（BSA）、尿素、NH4HCO3（美國(guó)Sigma公司）； 乙腈（ACN，德國(guó)Merck公司）； 乙醇、甲醇、乙酸、二甲基亞砜（DMSO）、異丙醇、丙酮、乙二醇、乙二胺、乙酸乙酯和環(huán)己烷等（天津科密歐公司）； 蛋白酶抑制劑（瑞士Roche公司）； C18反相填料（10 孔徑，5 μm粒徑， 天津博納艾杰爾科技有限公司）； 石英毛細(xì)管（美國(guó)Polymicro Technologies公司）。實(shí)驗(yàn)用水為超純水（18.2 MΩ cm）

2.2 樣品制備

2.2.1 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)及蛋白質(zhì)提取 在37℃、5% CO2條件下，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HeLa細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞的融合度達(dá)到90%時(shí)，收集并用冷的PBS洗滌3次。將HeLa細(xì)胞沉淀分散于裂解液（1%蛋白酶抑制劑的8 mol/L尿素溶液），在冰浴中超聲破碎240 s（超聲10 s，間歇10 s），在4℃， 20000 r/min高速離心10 min， 去除細(xì)胞碎片，收集上清液。最后用基于BCA法的試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

2.2.2 BSA及HeLa蛋白質(zhì)樣品處理 蛋白質(zhì)酶解：取1 mg蛋白質(zhì)（HeLa細(xì)胞提取蛋白或BSA）溶于100 μL 8 mol/L尿素中，加入8 μL 100 mmol/L DTT，56℃反應(yīng)2 h； 冷卻至室溫，加入8 μL 200 mmol/L IAA，避光反應(yīng)40 min； 用50 mmol/L NH4HCO3將溶液稀釋10倍后，加入胰蛋白酶（酶與底物的質(zhì)量比為1∶25）； 37℃酶解24 h，加入甲酸終止反應(yīng)。

除鹽：使用HPLC的流動(dòng)相A（98% H2O + 2% ACN + 0.1% FA）將酶解液上樣至C18反相色譜柱（10 mm×4.6 mm），沖洗5 min后，用80% 的流動(dòng)相B（98% ACN+2% H2O + 0.1% FA）進(jìn)行洗脫。收集洗脫液，冷凍干燥后，保存于-80℃待用。

2.3 質(zhì)譜及電噴霧離子源分析條件

2.3.1 考察不同溶劑、輔助氣對(duì)標(biāo)準(zhǔn)肽段質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)的影響 負(fù)離子模式下，使用進(jìn)樣針直接進(jìn)樣（1 μg/mL）。改變標(biāo)準(zhǔn)肽段溶劑、輔助氣中有機(jī)添加劑的種類及比例，每種條件均直接采集1 min，對(duì)比不同條件下標(biāo)準(zhǔn)肽段離子峰強(qiáng)度。

2.3.2 BSA及HeLa蛋白酶解產(chǎn)物的分離和鑒定 采用nano-HPLC-ESI-MS/MS分離分析酶解產(chǎn)物，色譜柱： C18反相色譜柱（50 μm×15 cm），末端為拉制噴針，可直接插入封閉式電噴霧離子源，如圖1所示。液相色譜分離采用梯度洗脫方式，BSA酶解產(chǎn)物：0～5 min，2%～6% B； 5～35 min，6%～35% B； HeLa細(xì)胞蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物：0～75 min，5%～25% B； 75～90 min，25%～80% B。流速均為120 nL/min。

分別考察空氣和乙醇兩種氣氛下的質(zhì)譜鑒定信號(hào)。質(zhì)譜掃描范圍為m/z 300～1800，正離子模式采集，歸一化碰撞能量為35%。質(zhì)譜采集產(chǎn)生的原始文件通過(guò)pXtract[14]轉(zhuǎn)換為.mgf文件后，使用Mascot（2.4.0版本，英國(guó)MatrixScience）搜索引擎對(duì)Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行檢索。參數(shù)設(shè)置為：母離子質(zhì)量容差2 Da； 碎片離子質(zhì)量容差1 Da； 蛋白水解酶：Trypsin； 最多允許2個(gè)漏切位點(diǎn)； 固定修飾： carbamidomethyl （C）； 可變修飾：oxidation （M）和acetyl （protein N-term）。

3 結(jié)果與討論

3.1 離子源設(shè)計(jì)

結(jié)合康達(dá)效應(yīng)，設(shè)計(jì)了CEESI源（圖1）。特殊設(shè)計(jì)的離子傳輸管的內(nèi)表面具有康達(dá)效應(yīng)功能，氣流會(huì)沿著管壁旋轉(zhuǎn)向質(zhì)譜方向流動(dòng)，旋轉(zhuǎn)的氣流將帶電液滴在離子傳輸管的中心流向質(zhì)譜儀，降低了液滴與管壁的碰撞幾率，從而提高離子傳輸效率。

輔助氣流進(jìn)入低壓空腔后，繞軸線旋轉(zhuǎn)，形成以發(fā)射針為軸的三維軸對(duì)稱回轉(zhuǎn)體。此結(jié)構(gòu)可以簡(jiǎn)化為二維流動(dòng)進(jìn)行模擬（圖2）。在回轉(zhuǎn)體內(nèi)可形成氣流穩(wěn)定均勻的區(qū)域，即流場(chǎng)駐點(diǎn)。

將色譜柱末端的噴針直接插入電噴霧離子源內(nèi)的駐點(diǎn)位置，在電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)下，即可形成特別穩(wěn)定泰勒錐，進(jìn)而獲得穩(wěn)定噴霧。此外，由于質(zhì)譜內(nèi)的高真空，噴針與質(zhì)譜采樣錐之間的空腔處于低壓，流動(dòng)的輔助氣可帶走泰勒錐形成的霧滴，清潔噴針表面，有效防止結(jié)碳，有助于延長(zhǎng)噴針使用壽命。霧滴在密閉腔內(nèi)不斷蒸發(fā)，當(dāng)達(dá)到瑞利極限時(shí)，即發(fā)生庫(kù)侖爆炸。分析物基于荷電殘余模型、離子蒸發(fā)模型及鏈彈射模型等機(jī)理[15]實(shí)現(xiàn)離子化。進(jìn)入腔體的輔助氣，即被有機(jī)溶劑飽和的空氣，可有效避免空氣中污染物的進(jìn)入，降低干擾離子的信號(hào)。在輔助氣和霧滴的作用下，分析物離子化效率顯著提高，有助于實(shí)現(xiàn)肽段的高靈敏度檢測(cè)。

3.2 輔助氣氣氛對(duì)標(biāo)準(zhǔn)肽段質(zhì)譜檢測(cè)信號(hào)的影響

輔助氣作為CEESI源的重要組成部分，可以促進(jìn)噴霧穩(wěn)定性、改善離子傳輸效率，而且輔助氣中添加氣化的有機(jī)溶劑可以顯著改變肽段電荷分布，提高肽段離子化效率[9，10]。因而首先考察了不同輔助氣對(duì)肽段的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度及電荷分布的影響（圖3）。

在負(fù)離子模式下，酸可明顯抑制負(fù)離子生成。蒸氣壓較低的有機(jī)試劑（如DMSO、乙二醇）由于進(jìn)入離子化室較少，對(duì)信號(hào)強(qiáng)度基本無(wú)影響。而飽和蒸氣壓較大的乙腈、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯等極性分子可明顯提高多肽離子化效率。此結(jié)果與冷卻焓理論一致[16，17]，即高濃度的極性分子冷凝在霧滴表面的同時(shí)，釋放一定的能量； 此能量被霧滴表面的分析物分子吸收，最終激發(fā)分析物離子化[15]。但在研究的輔助氣氣氛中，乙醇、丙酮、乙酸乙酯及乙二胺等都能顯著提高標(biāo)準(zhǔn)肽段的信號(hào)強(qiáng)度； 與空氣為輔助氣相比，信號(hào)強(qiáng)度可以提高1000倍。相比之下，乙醇可更明顯提高多價(jià)離子響應(yīng)，有利于多肽質(zhì)譜鑒定，因此，采用乙醇作為輔助氣進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.3 痕量BSA酶解產(chǎn)物分析

基于nano-RPLC-ESI-MS/MS系統(tǒng)，對(duì)1 ng BSA酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離分析。輔助氣中添加乙醇后，在CEESI空腔內(nèi)，乙醇與霧滴在離子傳輸管內(nèi)相互作用，肽段譜圖匹配（PSM）、肽段數(shù)目、序列覆蓋率均提高約10%（表1）。比較肽段的峰面積發(fā)現(xiàn)，添加乙醇的輔助氣提高了大部分肽段的質(zhì)譜響應(yīng)，與文獻(xiàn)＼[16＼]結(jié)果相似。但是并未觀察到標(biāo)準(zhǔn)肽段信號(hào)的改善，這可能是因?yàn)楦邼舛纫掖驾o助氣會(huì)抑制流動(dòng)相揮發(fā)。

由于高濃度乙醇?xì)夥諘?huì)抑制霧滴中有機(jī)溶劑揮發(fā)，不同樣品溶劑對(duì)標(biāo)準(zhǔn)肽段靈敏度有較大的影響。在相同的乙醇分壓下，純水為溶劑時(shí)信號(hào)改善效果最顯著（圖4）； 溶劑中僅加入乙腈時(shí)，隨著溶劑中乙腈加入量增大，信號(hào)改善效果變差，甚至降低肽段的質(zhì)譜響應(yīng)； 加入0.1% FA，獲得更顯著的改善效果。然而，隨著有機(jī)相比例增大，會(huì)抑制乙醇對(duì)標(biāo)肽質(zhì)譜響應(yīng)的改善效果。以上結(jié)果說(shuō)明，乙醇分壓太高會(huì)抑制有機(jī)溶劑的揮發(fā)，不利于樣品離子化，因而實(shí)際應(yīng)用時(shí)，應(yīng)選擇輔助氣中的有機(jī)添加劑的最佳分壓。

采用LC-ESI-MS/MS分析痕量BSA酶解產(chǎn)物時(shí)，多肽的色譜峰主要分布于有機(jī)相為10%～35%的條件下，即僅在有機(jī)相濃度較低時(shí)，出峰的肽段信號(hào)得到改善，進(jìn)一步證實(shí)了高濃度乙醇?xì)夥諘?huì)抑制霧滴溶劑揮發(fā)。當(dāng)乙醇分壓下降時(shí)，抑制效果減弱，質(zhì)譜響應(yīng)顯著增強(qiáng)。

3.4 痕量HeLa細(xì)胞提取蛋白酶解產(chǎn)物分析

在最佳分壓的乙醇?xì)夥罩?，肽段和蛋白鑒定數(shù)目明顯增多。當(dāng)HeLa酶解產(chǎn)物的上樣量為6 ng和10 ng時(shí)，乙醇?xì)夥障码亩魏偷鞍阻b定數(shù)目較空氣氣氛約提高了20%； 當(dāng)上樣量為20 ng時(shí)，多肽和蛋白鑒定數(shù)目分別提高360%和200%（圖5）。此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)乙醇?xì)夥湛梢蕴岣叻治鑫镫x子化效率，促進(jìn)多肽質(zhì)譜響應(yīng)。當(dāng)進(jìn)樣量增大到50 ng時(shí)，乙醇?xì)夥障码亩魏偷鞍阻b定數(shù)目較空氣氣氛分別提高280%和158%； 相對(duì)20 ng進(jìn)樣量的鑒定結(jié)果提高較少。因而，氣氛輔助CEESI源更適于痕量蛋白質(zhì)組樣品的分析。

與開(kāi)放式離子源比較， CEESI特殊設(shè)計(jì)的離子傳輸管的內(nèi)表面具有康達(dá)效應(yīng)功能，可改善離子傳輸效率。同時(shí)，結(jié)合輔助氣添加劑與噴霧的相互作用，促進(jìn)肽段離子化。在考察的上樣量范圍內(nèi)，采用CEESI源可將鑒定的肽段和蛋白數(shù)目分別提高58%～320%和50%～180%。

采用空氣作為輔助氣，當(dāng)樣品量較小（小于20ng）時(shí)，CEESI鑒定的肽段和蛋白數(shù)目較開(kāi)放式nano-ESI分別提高30%和12%。但是隨著樣品量增加，采用開(kāi)放式nano-ESI可以獲得更多的肽段和蛋白鑒定數(shù)目。這可能是因?yàn)樯蠘恿枯^小時(shí)，空氣氣氛下的封閉式離子源具有更高的離子傳輸效率，因而可以比開(kāi)放源鑒定更多的肽段和蛋白數(shù)目。當(dāng)樣品量增大時(shí)，高效離子化產(chǎn)生更多的離子，但是受離子傳輸管離子傳輸效率的限制，進(jìn)入質(zhì)量分析器的肽段離子受限，因此開(kāi)放源具有更顯著的優(yōu)勢(shì)。

乙醇?xì)夥詹粌H改善離子傳輸效率、促進(jìn)多肽離子化，而且可以改善噴霧穩(wěn)定性。以上樣量20 ng為例（圖5C），空氣氣氛封閉式離子源、乙醇?xì)夥辗忾]式離子源和開(kāi)放式離子源三針共同鑒定到的蛋白質(zhì)比例分別是25.0%， 30.6%和19.5%，證實(shí)CEESI源比開(kāi)放納噴源具有更好的噴霧穩(wěn)定性。

4 結(jié) 論

針對(duì)開(kāi)放式電噴霧離子源噴霧穩(wěn)定性差、離子化效率低及噴針壽命短等問(wèn)題，設(shè)計(jì)了氣氛可調(diào)CEESI源。通過(guò)考察具有不同飽和蒸氣壓的有機(jī)小分子作為輔助氣對(duì)電噴霧效果的影響，發(fā)現(xiàn)乙醇能夠顯著提高標(biāo)準(zhǔn)肽段信號(hào)強(qiáng)度。在最佳的乙醇分壓下，不僅HeLa細(xì)胞提取蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的肽段和蛋白鑒定數(shù)目顯著提高，而且噴霧穩(wěn)定性得到了改善。上述結(jié)果初步說(shuō)明，CEESI源在痕量蛋白質(zhì)組樣品分析方面具有很大的應(yīng)用潛力。

References

1 WANG Chun-Min， LIU Qiang， LI Jian， XU Bo， MI Kai， CHENG Juan. Chinese J. Anal. Chem.， 2014， 42（9）： 1326-1331

王春民， 劉 強(qiáng)， 李 建， 徐 波， 米 凱， 程 娟. 分析化學(xué)， 2014， 42（9）： 1326-1331

2 WANG Gui-Ming， SHI Dong-Dong， PENG Zhang-Xiao， LU Yang-Fang， GU Xue， WANG Yan， YAN Chao. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（5）： 682-688

王桂明， 史棟棟， 彭章曉， 魯陽(yáng)芳， 谷 雪， 王 彥， 閆 超. 分析化學(xué)， 2015， 43（5）： 682-688

3 Luo Q， Rejtar T， Wu S L， Karger B L. J. Chromatogr. A， 2009， 1216（8）： 1223-1231

4 Wilm M， Mann M. Anal. Chem.， 1996， 68（1）： 1-8

5 Okudaira M， Inoue A， Shuto A， Nakanaga K， Kano K， Makide K， Saigusa D， Tomioka Y， Aoki J. J. Lipid Res.， 2014， 55（10）： 2178-2192

6 El-Faramawy A， Siu K W M， Thomson B A. J. Am. Soc. Mass Spectrom.， 2005， 16（10）： 1702-1707

7 Nirmala R R， Nilgun C S， Griff H W. 58th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics， Salt Lake City， UT， 2010

8 Ramanathan R N R， Comezoglu S N， Humphreys W G. Int. J. Mass Spectrom.， 2011， 301（3）： 127-135

9 Li Z， Li L. Anal. Chem.， 2014， 86（1）： 331-335

10 Kharlamova A， McLuckey S A. Anal. Chem.， 2011， 83（1）： 431-437

11 Kharlamova A， Prentice B M， Huang T Y， McLuckey S A. Anal. Chem.， 2010， 82（17）： 7422-7429

12 Asperger A， Marx K， Albers C， Molin L， Pinato O. J. Proteome Res.， 2015， 14（6）： 2633-2641

13 de Muth J C， McLuckey S A. Anal. Chem.， 2015， 87（2）： 1210-1218

14 Wang L H， Li D Q， Fu Y. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2007， 21（18）： 2985-2991

15 Konermann L， Ahadi E， Rodriguez A D， Vahidi S. Anal. Chem.， 2013， 85（1）： 2-9

16 Samalikova M， Grandori R. J. Am. Chem. Soc.， 2003， 125（44）： 13352-13353

17 Iavarone A. T， Williams E R. J. Am. Chem. Soc.， 2003， 125（8）： 2319-2327