心肌特異性啟動子引導(dǎo)的rNIS基因的攝碘動力學(xué)研究

劉 影 于 濤 林 偉 鄔恒夫

心肌梗死發(fā)生率和病死率呈逐年上升的趨勢，盡管各種治療方法在不斷發(fā)展，由心肌梗死導(dǎo)致的難以治療的心力衰竭及死亡仍然是全球面臨的難題。近年出現(xiàn)的干細(xì)胞治療心肌梗死成為研究的熱點(diǎn)，各種監(jiān)測干細(xì)胞轉(zhuǎn)歸的方法中又以核素的報(bào)告基因顯像最有發(fā)展前途。

鈉/碘轉(zhuǎn)運(yùn)體(sodium/iodide symporter，NIS)是正常甲狀腺細(xì)胞的一種跨膜糖蛋白，介導(dǎo)碘的主動攝取，成為目前報(bào)告基因顯像研究中最有發(fā)展前景的報(bào)告基因。已有大量研究以NIS作為報(bào)告基因的心臟干細(xì)胞顯像研究，其存在的主要問題是轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后表達(dá)量較低，應(yīng)用于臨床實(shí)踐受到限制，其中改善的主要方法包括應(yīng)用組織特異性啟動子來增加心肌組織靶向調(diào)控NIS基因的表達(dá)。肌凝蛋白輕鏈蛋白-2(myosin light chain-2，MLC-2p)為心肌特異性啟動子。本研究構(gòu)建了MLC-2p啟動子調(diào)控的rNIS基因重組腺相關(guān)病毒(recombinant adenoassociated virus，rAAV)并感染心肌細(xì)胞，通過細(xì)胞水平的碘攝取實(shí)驗(yàn)，在體外證實(shí)NIS作為報(bào)告基因的可行性，為下一步的MLC-2p啟動子調(diào)控的rNIS基因介導(dǎo)干細(xì)胞治療心肌梗死的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

1．材料:載體質(zhì)粒 pAAV-IRES-ZsGreen，JM109 感受態(tài)及HET kit(深圳百恩維生物科技有限公司)，乳腺癌細(xì)胞株MCF-7由本實(shí)驗(yàn)室保存，小量質(zhì)粒抽提試劑盒及Trans2K PlusⅡ DNA Marker(北京全式金生物公司)，瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Omega公司)，DNA引物合成及測序，DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清FBS，胰蛋白酶Trypsin 0．25%EDTA(美國Invitrogen公司)，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ，MluⅠ，SpeⅠ及T4 DNA Ligase(美國NEB公司)，大規(guī)模質(zhì)粒抽提試劑盒(德國Qiagen公司)，Bio-Rad DNA電泳系統(tǒng)，Sub-Cell GT Cell電泳槽，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，超低溫冰箱(-80℃)，UTL2186-6V(美國Thermo公司)，超凈工作臺BCM-1600A(蘇州蘇凈安泰公司)，落地式培養(yǎng)搖床(美國Thermo公司)，超微量高精度分光光度計(jì)Nanodrop ND-2000(美國Thermo公司)，METTLER PH 計(jì) SevenMulti，S40(德國 METTLER TOLEDO公司)，Na125I為北京原子高科股份有限公司產(chǎn)品。SN-697型全自動雙探頭放射免疫γ計(jì)數(shù)器(105103)為上海核所日環(huán)光電儀器有限公司產(chǎn)品。正常SD大鼠乳鼠(1～3天齡)，雌雄不拘，由廣東省動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

2．方法:(1)pAAV-rMLC-2p-rNIS-ZsGreen載體質(zhì)粒構(gòu)建:載體質(zhì)粒pAAV-IRES-ZsGreen及目的基因rMLC-2p的EcoRⅠ+MluⅠ雙酶切，分別回收質(zhì)粒pAAV-IRESZsGreen酶切大片段和目的基因酶切產(chǎn)物并連接，連接產(chǎn)物與100μl JM109感受態(tài)細(xì)菌混勻轉(zhuǎn)化，用小量質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，并分別用EcoRⅠ+MluⅠ做酶切鑒定，可得到pAAV-rMLC-2p-ZsGreen載體質(zhì)粒。同法，載體質(zhì)粒pAAV-rMLC-2p-IRES-ZsGreen及目的基因rNIS的EcoRⅠ+SpeⅠ雙酶切，分別回收質(zhì)粒pAAV-IRES-ZsGreen酶切大片段和目的基因酶切產(chǎn)物并連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，用小量質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，并分別用MluⅠ+SpeⅠ做酶切鑒定，可得到pAAV-rMLC-2p-rNIS-ZsGreen載體質(zhì)粒。同法構(gòu)建pAAV-CMV-rNIS-ZsGreen載體質(zhì)粒。(2)重組腺相關(guān)病毒包裝及效價(jià)測定:用胰酶消化收集293AAV細(xì)胞，以適當(dāng)完全培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至2×106/ml。接種2．5ml細(xì)胞稀釋液至10cm培養(yǎng)皿，添加培養(yǎng)基至10ml。將細(xì)胞置于含5%，CO2的37℃培養(yǎng)箱中孵育8～24h，當(dāng)細(xì)胞貼壁后即可開始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2h換液。用HET轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒到細(xì)胞，按試劑盒說明書操作。獲得rAAV9-rMLC-2p-rNIS及對照病毒rAAV9-CMV-rNIS。(3)乳鼠原代心肌細(xì)胞及MCF-7細(xì)胞培養(yǎng):無菌條件下取SD大鼠乳鼠心室肌，PBS中漂洗3次，剪成約1mm3的小塊，加入膠原酶溶液(每克心肌組織約10ml)，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育消化，5h后將細(xì)胞懸液離心(800r/min，7min)，并用含10%新生牛血清的DMEM-F12漂洗兩次，收集心肌細(xì)胞，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中，1h后經(jīng)差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞，再接種入合適培養(yǎng)板?？色@得心肌細(xì)胞純度為(93．12±1．38)%。MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清的DMEM-F12中，加入濃度100U/ml青鏈霉素雙抗，于37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(4)重組腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞及MCF-7細(xì)胞:心肌細(xì)胞及MCF-7細(xì)胞均勻接種于24孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞數(shù)為5×105/孔時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。rAAV9-rMLC-2p-rNIS及rAAV9-CMV-rNIS以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI=50)分別轉(zhuǎn)染兩種細(xì)胞并孵育，6h后將病毒液替換為含10%新生牛血清的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至24h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)?？瞻讓φ战M以等體積PBS代替病毒液，其他實(shí)驗(yàn)條件與實(shí)驗(yàn)組相同。(5)Na125I的動態(tài)攝取實(shí)驗(yàn):已轉(zhuǎn)染病毒的心肌細(xì)胞及MCF-7細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，冰 PBS洗2次，每孔加入含Na125I18．5kBq的DMEM完全培養(yǎng)基0．5ml，在37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5、10、20、30、60、90 和 120min 時(shí)，棄培養(yǎng)液，用冰PBS洗2次，加入 0．3mol/L NaOH 裂解細(xì)胞 0．5ml(冰上操作)，收集裂解液至測量管。用SN-697型全自動雙探頭放射免疫γ計(jì)數(shù)器測量各管的每分鐘放射性計(jì)數(shù)(count per minute，CPM)值。每種病毒每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。(6)測定細(xì)胞的NaClO4抑制情況:心肌細(xì)胞接種于24孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞數(shù)為5×105/孔時(shí)，加入MOI=50的rAAV9-rMLC-2prNIS孵育，6h后將病毒液替換為含10%新生牛血清的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至24h，每孔加入含 Na125I18．5kBq的 DMEM完全培養(yǎng)基0．5ml，實(shí)驗(yàn)分兩組，一組每孔含50μmol/L的Na-ClO4，另一組不加入NaClO4。37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min。棄培養(yǎng)液，冰PBS洗2次，裂解細(xì)胞并測量放射性。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

3．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:用SPSS 13．0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，所有數(shù)據(jù)用方差分析進(jìn)行比較，P＜0．05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．重組腺相關(guān)病毒鑒定:經(jīng)EcoRⅠ和MluⅠ雙酶切，并連接，轉(zhuǎn)化后小量抽提質(zhì)粒，并分別用EcoRⅠ和MluⅠ酶切鑒定，結(jié)果顯示陽性克隆可酶切到275bp的條帶，與rMLC-2p啟動子片段大小相符。經(jīng)EcoRⅠ和SpeⅠ雙酶切，并連接，轉(zhuǎn)化后小量抽提質(zhì)粒，并分別用MluⅠ和SpeⅠ酶切鑒定，結(jié)果顯示陽性克隆可酶切到2100bp的條帶，與rNIS基因的片段大小相符，提示pAAV-rMLC-2p-rNIS-IRESZsGreen載體質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖1)。

圖1 pAAV-rMLC-2p-rNIS-IRES-ZsGreen酶切鑒定結(jié)果

2．rMLC-2p及rMLC-2p-rNIS重組腺相關(guān)病毒包裝后綠色熒光信號的觀察及效價(jià)測定:rMLC-2p及rMLC-2p-rNIS轉(zhuǎn)染293AAV細(xì)胞，觀察細(xì)胞綠色熒光表達(dá)(圖2)。初次收集病毒效價(jià)低，需多次反復(fù)感染293AAV細(xì)胞，隨著病毒效價(jià)的增加，293AAV細(xì)胞出現(xiàn)病變現(xiàn)象時(shí)間縮短，一般在感染后24h即可見細(xì)胞病變現(xiàn)象，細(xì)胞腫脹、變圓、脫落、聚集成團(tuán)。48h可見大多數(shù)細(xì)胞有綠色熒光。效價(jià)測定結(jié)果為 rAAV9-rMLC-2p-rNIS 2．46 ×1012μg/ml，rAAV9-CMV-rNIS 4．21 ×1012μg/ml。

圖2 pAAV-rMLC-2p-rNIS-IRES-ZsGreen

3．Na125I的動態(tài)攝取實(shí)驗(yàn):(1)感染rAAV9-rMLC-2p-rNIS的心肌細(xì)胞組Na125I攝取的攝取隨時(shí)間逐漸增加，30min達(dá)高峰，隨后進(jìn)入平臺期。故后面的攝取實(shí)驗(yàn)均采用30min的孵育時(shí)間。(2)感染rAAV9-rMLC-2p-rNIS的心肌細(xì)胞的Na125I攝取明顯高于MCF-7細(xì)胞，感染rAAV9-rMLC-2prNIS的MCF-7細(xì)胞Na125I攝取與對照組PBS相似，證實(shí)了rMLC-2p啟動子的心肌特異性。(3)感染rAAV9-rMLC-2p-rNIS和rAAV9-CMV-rNIS的心肌細(xì)胞攝碘曲線相似，但CMV啟動子介導(dǎo)的NIS攝取峰值較rMLC-2p啟動子介導(dǎo)的低，進(jìn)一步證實(shí)了rMLC-2p啟動子的心肌特異性。(4)PBS對照組未見明顯的Na125I攝取(圖3)。

圖3 Na125I動態(tài)攝取實(shí)驗(yàn)時(shí)間-放射性曲線

4．NaClO4抑制實(shí)驗(yàn):經(jīng)轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞在18．5kBq Na125I的環(huán)境中孵育30min后，轉(zhuǎn)染組在加入NaClO4的情況下，心肌細(xì)胞攝碘明顯受抑制(F=2894．3，P ＜0．05)，抑制率約為 90．3% ～92．5%，表明心肌細(xì)胞表達(dá)的NIS蛋白具有被NaClO4抑制的特性(圖4)。

圖4 NaClO4抑制碘攝取實(shí)驗(yàn)

討 論

自從1996年大鼠和人類的NIS基因被克隆后［1］，其分子特征得到了廣泛的研究，更成為近年來基因和干細(xì)胞治療人類各種難治性疾病中報(bào)告基因監(jiān)測中最有發(fā)展前途的報(bào)告基因［2］。已有大量研究證實(shí)NIS報(bào)告基因在心臟疾病的可行性［3～5］。Terrovitis等［3］的研究結(jié)果沒有對細(xì)胞的存活、增殖、心臟原性的動作電位和血管生成能力產(chǎn)生不利的影響。另外，體外分析也證實(shí)Ad-NIS基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后無任何心肌的損傷或無功能［4］。

在心臟干細(xì)胞治療中，高的轉(zhuǎn)染效率及安全的載體是非常必要的，目前應(yīng)用的載體主要有病毒載體和非病毒載體。應(yīng)用病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)法是迄今在轉(zhuǎn)干細(xì)胞入心臟中應(yīng)用得最多的轉(zhuǎn)導(dǎo)載體。rAAV的優(yōu)點(diǎn)在于:可持續(xù)性，可確保長期穩(wěn)定指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達(dá)，不編碼病毒蛋白，為非免疫原性及可轉(zhuǎn)導(dǎo)像心肌這樣的非分裂性細(xì)胞等，對人類相對較安全，因而更適合作為人類心梗干細(xì)胞移植治療的轉(zhuǎn)導(dǎo)載體［6］。

治療干細(xì)胞的組織特異性表達(dá)是干細(xì)胞治療中的關(guān)鍵問題之一。啟動子是報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄控制元件，能啟動和調(diào)節(jié)報(bào)告基因表達(dá)，可分為持續(xù)的啟動子、可誘導(dǎo)的啟動子及組織特異性啟動子。組織特異性啟動子的應(yīng)用能調(diào)控目的基因在特定的組織或腫瘤中表達(dá)，實(shí)現(xiàn)藥物的組織特異性毒性效應(yīng)最大化并降低不良反應(yīng)。目前應(yīng)用組織特異性啟動子如前列腺特異抗原(PSA)啟動子、Egr-1啟動子、上皮黏蛋白(MUCI)啟動子、免疫球蛋白啟動子和增強(qiáng)子、CEA啟動子、降鈣素啟動子、hTERT核心啟動子等靶向調(diào)控人 NIS基因的表達(dá)介導(dǎo)131I治療腫瘤［7～13］。心臟組織特異的啟動子MLC-2p可選擇性的在心肌組織表達(dá)，減少心臟外(包括甲狀腺和胃)的活性，從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控NIS在心臟的表達(dá)。

本研究證實(shí)了rAAV9-rMLC-2p-rNIS構(gòu)建成功，并在體外心肌細(xì)胞特異性高表達(dá)，可以介導(dǎo)NIS的攝碘特性，感染rAAV9-rMLC-2p-rNIS的心肌細(xì)胞的 Na125I攝取明顯高于 MCF-7細(xì)胞，感染rAAV9-rMLC-2p-rNIS和rAAV9-CMV-rNIS的心肌細(xì)胞攝碘曲線相似，但CMV啟動子介導(dǎo)的NIS攝取峰值較rMLC-2p啟動子介導(dǎo)的低，證實(shí)了rMLC-2p啟動子的心肌特異性，且NaClO4能特異性地抑制心肌細(xì)胞對碘的攝取，證實(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)的rNIS蛋白是有功能的。為進(jìn)一步以MLC-2p為啟動子，調(diào)控的rNIS基因的重組腺相關(guān)病毒的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。

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