LTF基因在多種腫瘤里的表達(dá)及機(jī)制研究

諸葛小菊 陳仁聘 盧光榮 黃智銘

染色體缺失在多種腫瘤發(fā)生過程中是常見的，而且往往以一種非隨機(jī)化的方式發(fā)生于某號染色體的一定區(qū)域。近來研究的熱點(diǎn)區(qū)域3p21染色體片段上就有3個高頻缺失區(qū):CER1(3p21．3，Mb:43．32～45．74)、CER2(3p22，Mb:37．83 ～ 39．06)和 FER(3p14．3 ～p21．2，Mb:50．12 ～58．03)，這些區(qū)域存在對大多數(shù)腫瘤來說可能有望成為其或者已經(jīng)是抑癌基因的缺失基因，比如 LTF、LIMD1、RASSF1A、Blu等［1］。LTF基因在多種腫瘤里的失活機(jī)制是多種多樣的。本文就LTF在腫瘤內(nèi)的作用和多種機(jī)制做一綜述。

一、LTF基因及其編碼蛋白

近來研究發(fā)現(xiàn)3p21．3染色體上存在對大多數(shù)腫瘤來說的候選抑癌，LTF亦是其中一員。LTF基因位于3p21．3的LUCA區(qū)中的CER1，這個區(qū)域在肺癌，鼻咽癌等多種腫瘤內(nèi)表現(xiàn)為高頻缺失區(qū)。

LTF的mRNA長約2．4kb，含17個外顯子，編碼乳鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，為轉(zhuǎn)鐵蛋白家族中的一員［2］。1938年Sorensen和Sorensen首次從牛乳中分離出牛乳鐵蛋白(bovine lactoferrin，BLF)，1960 年 Groves從人乳中首次分離出人乳鐵蛋白(human lactoferrin，HLF)［3］。HLF完整的氨基酸序列由703個氨基酸殘基組成，由一條多肽鏈折疊成兩個球狀小葉組成，每個小葉帶有一個鐵結(jié)合位點(diǎn)［2，4］。當(dāng)一個鐵離子結(jié)合到乳鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的同時伴隨著兩個碳酸氫根陰離子的結(jié)合［5］。HLF該蛋白為外分泌型，血漿HLF主要由中性粒細(xì)胞分泌，在人體支氣管黏液、乳汁、淚液、唾液、胃液、精液、宮頸分泌物和鼻腔分泌物等多種體液中檢測到。既往研究認(rèn)為，乳鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白僅被視為牛奶中抑菌的一種轉(zhuǎn)鐵蛋白，但近來的研究發(fā)現(xiàn)不止如此。LTF除與抗菌、抗病毒、抗真菌、抗炎和促進(jìn)免疫細(xì)胞生長相關(guān)，是人類固有免疫的重要成員之一等功能外，還與細(xì)胞增殖分化調(diào)節(jié)相關(guān)，有抗氧化、抗腫瘤作用［6］。1994年Bezault等［7］發(fā)現(xiàn) LTF 基因能抑制用甲基膽蒽誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的纖維肉瘤和體外NIH3T3細(xì)胞株的生長，也能減少黑色素肉瘤在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的轉(zhuǎn)移。自此LTF基因被視為重要的抑癌基因。有文獻(xiàn)報道LTF的抗腫瘤的作用機(jī)制是多種多樣的，可能與調(diào)節(jié)NK細(xì)胞活動，腫瘤化學(xué)預(yù)防活動，G1蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)，抑制細(xì)胞增殖，增強(qiáng)細(xì)胞凋亡相關(guān)［8］。

在動物實(shí)驗(yàn)中，LTF能抑制小鼠實(shí)體腫瘤的發(fā)展和代謝而起到抑癌作用［9］。LTF在多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，如鼻咽癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、惡性膠質(zhì)瘤、前列腺癌、口腔鱗癌等［8，10］。LTF失活的機(jī)制是多種多樣的。在腫瘤里低表達(dá)的機(jī)制大致可分為基因水平相關(guān)和表觀遺傳學(xué)相關(guān)，前者包括雜合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)和基因突變，后者包括啟動子甲基化和組蛋白去乙?；揎椣嚓P(guān)。

二、LF的抗腫瘤作用

與抗炎過程一樣，LF亦能在腫瘤內(nèi)調(diào)節(jié)各種細(xì)胞因子的產(chǎn)生和表達(dá)。Zhang等［11］研究發(fā)現(xiàn)LTF轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞株后，較多細(xì)胞停滯在G1期，而相對的S期、G2-M期細(xì)胞減少，這提示在LTF介導(dǎo)的抑制細(xì)胞周期中存在著特殊的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)機(jī)制。在動物實(shí)驗(yàn)中，用HLF重組體治療小鼠的腫瘤模型發(fā)現(xiàn)，和安慰劑對比能60%的抑制小鼠上腫瘤的生長，增加有抑癌作用的細(xì)胞因子如IL-18，激活NK細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞［12］。近來 Giuffrè等［13］通過對比觀察 LF在人腎細(xì)胞癌及癌旁組織的免疫表達(dá)發(fā)現(xiàn)LF有抗癌作用。同時，Wolf等［14］也有相同的結(jié)論，LF在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌內(nèi)能抑制T細(xì)胞依賴的腫瘤的生長。

三、LTF基因和鼻咽癌

Zhou等［15～17］在鼻咽癌組織，癌旁組織和鼻咽慢性炎癥組織差異表達(dá)譜和組織芯片分析中發(fā)現(xiàn)，LTF在鼻咽癌里表達(dá)顯著下降，而在鼻咽癌旁和鼻咽慢性炎癥組織中存在高表達(dá)，幾乎所有的鼻咽部腺體均能檢測到LTF蛋白的存在，證實(shí)LTF蛋白在腺體中高表達(dá)、為一細(xì)胞分泌性蛋白。而且，相對早期的TⅠ期和TⅡ期鼻咽癌LTF表達(dá)陽性率為61．25%，而相對晚期的TⅢ和TⅣ期鼻咽癌組織中LTF陽性率為40．82%，并且與淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)。提示其可能與鼻咽癌的侵襲轉(zhuǎn)移和臨床進(jìn)展有關(guān)，為鼻咽癌候選易感基因，可作為鼻咽癌侵襲、轉(zhuǎn)移和臨床進(jìn)展預(yù)測的分子靶標(biāo)。亦有其他文獻(xiàn)報道的LTF低表達(dá)現(xiàn)象，其用RT-PCR和real-time PCR方法研究發(fā)現(xiàn)LTF基因在76%的鼻咽癌組織中表達(dá)缺失或下調(diào)，同樣支持LTF基因的低表達(dá)和淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，并提出LTF失活機(jī)制主要與啟動子甲基化、突變和LOH有關(guān)。Zhang等［18］報道LTF基因在鼻咽癌組織和7種鼻咽癌細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)，而且在其6種細(xì)胞株下調(diào)與甲基化相關(guān)，另一種與LOH和基因突變相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，用去甲基化劑逆轉(zhuǎn)細(xì)胞株甲基化情況后，LTF可以重新表達(dá)上調(diào)，結(jié)果提示在鼻咽癌里L(fēng)TF的抑癌機(jī)制和啟動子甲基化高度相關(guān)，且可被逆轉(zhuǎn)，由此推測LTF基因可能在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，是一個鼻咽癌的候選抑癌基因。另有文獻(xiàn)報道LTF在鼻咽癌細(xì)胞株CNEI、5-SF以及HNEI細(xì)胞中L能夠延緩體外細(xì)胞株生長、抑制腫瘤形成［19］。

四、LTF和肺癌

Iijima等［10］系統(tǒng)的研究LTF在數(shù)種肺癌細(xì)胞株和原發(fā)非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)LTF在16/27(59%)的小細(xì)胞肺癌(SCLC)細(xì)胞株內(nèi)表達(dá)缺失;在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)亞型內(nèi)表達(dá)缺失比例分別是，腺癌23/29(79%)，鱗癌4/5(80%)，大細(xì)胞癌3/5(60%)，惡性間皮瘤2/3(67%)。這一點(diǎn)與之前Finkbeiner等研究的結(jié)果LTF基因在NSCLC細(xì)胞株9/12中表達(dá)缺失一致。并且，使用去甲基化劑5氮雜胞苷處理其中的4中肺癌細(xì)胞系(NCI-H1299，-H1437，-H1666和-H2009)后，其LTF基因能恢復(fù)表達(dá)。這證明在肺癌內(nèi)LTF也極有可能是抑癌基因，其表達(dá)失活機(jī)制與啟動子甲基化相關(guān)，而且有被逆轉(zhuǎn)修復(fù)的可能。Iijima等［10］的實(shí)驗(yàn)中選取其中被5氮雜胞苷處理后LTF能恢復(fù)表達(dá)的兩個細(xì)胞系(NCI-H1299，NCI-H2009)和5氮雜胞苷處理后LTF未能恢復(fù)表達(dá)的一個細(xì)胞系NCI-H1264，分別用亞硫酸鹽修飾DNA測序方法分析LTF 5'端14個CpG位點(diǎn)的甲基化情況，發(fā)現(xiàn)這前兩個細(xì)胞系大多數(shù)位點(diǎn)都是高度甲基化，而NCI-H1264沒有一個位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)甲基化。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)5'端的14個CpG位點(diǎn)中3、4、5、6、11是與LTF基因表達(dá)相關(guān)的常甲基化位點(diǎn)。做過同類研究的 Yang報道4、5、9、11、12這5個CpG位點(diǎn)可能和和LTF基因表達(dá)相關(guān)的常甲基化位點(diǎn)。綜合兩人的意見，4、5、11這3個CpG位點(diǎn)有可能和LTF基因表達(dá)相關(guān)的常見甲基化位點(diǎn)。在肺癌中除啟動子位點(diǎn)甲基化和LTF基因表達(dá)沉默相關(guān)外，還有一個重要的因素——組蛋白去乙?；揎?。至于兩者是否有協(xié)同作用，Maass等報道聯(lián)合使用去甲基化劑和組蛋白去乙?；种苿┡c單用其中一種治療并沒有提高LTF基因的mRNA表達(dá)，這提示啟動子甲基化和組蛋白的去乙?；揎梼烧咴诜伟┘?xì)胞株內(nèi)影響LTF表達(dá)沉默的機(jī)制是獨(dú)立的。此外，肺癌內(nèi)LTF基因表達(dá)沉默從基因水平上說，也與基因突變相關(guān)。表觀遺傳學(xué)特別是DNA甲基化的改變是各種抑癌基因異常失活的重要機(jī)制，而相關(guān)甲基化位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)將為去甲基化靶點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

五、LTF和前列腺癌等其他腫瘤

Shaheduzzaman報道在前列腺癌腫瘤細(xì)胞內(nèi)LTF mRNA表達(dá)下降和患者體內(nèi)的PSA表達(dá)降低相關(guān)。在前列腺癌組織和前列腺癌4種細(xì)胞系內(nèi)均發(fā)現(xiàn)LTF啟動子下游CpG島甲基化現(xiàn)象。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，LTF蛋白的補(bǔ)給治療可以減慢腫瘤細(xì)胞生長，細(xì)胞周期分析提示使用LTF蛋白治療增加細(xì)胞凋亡。提示LTF有潛能運(yùn)用于前列腺癌的化學(xué)預(yù)防，及成為其預(yù)后的生物相關(guān)分子標(biāo)志物。

Sousa通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究正常胃黏膜，化生胃黏膜到胃癌這個過程中的蛋白表達(dá)的特征，LTF的蛋白在胃癌降低表達(dá)，這個差異在胃癌演化過程中是有意義的。研究認(rèn)為，LTF和DMBT1可以分別作為SPEM和IM(腸型化生)的強(qiáng)分子標(biāo)志物，且LTF的低表達(dá)和胃癌的預(yù)后差相關(guān)，與分期無關(guān)。但是LTF基因在胃癌的研究中缺乏較大樣本(Sousa實(shí)驗(yàn)中針對胃癌僅進(jìn)行3個樣本量的研究)的檢驗(yàn)，其失活機(jī)制有待進(jìn)一步研究。筆者通過細(xì)胞水平的驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)LTF基因在胃癌細(xì)胞株SGC-7901、MGC-803、BGC-823中其啟動子區(qū)域是高甲基化的，且這種狀態(tài)與LTF mRNA在胃癌細(xì)胞株中的低表達(dá)顯著相關(guān)。LTF能通過體內(nèi)某些信號通路如NF-κB來激活基因的表達(dá)。目前數(shù)據(jù)顯示，大多數(shù)的腫瘤中LTF越低的表達(dá)和越差的預(yù)后相關(guān)，這也支持LTF在胃癌腫瘤中起一個保護(hù)角色的觀點(diǎn)。人類大多數(shù)腫瘤是多基因遺傳性的腫瘤，這表示腫瘤的發(fā)生不是單個基因決定的，是有多個基因多個步驟不同時間空間協(xié)同發(fā)生的，是個動態(tài)的過程。利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)方法檢測到對鼻咽癌來說的重要功能基因SPLUNC1、LTF、NOR1、BRD7、NAG7 和 LPLUNC1 等參與 Wnt/β -catenin、ras/MEK/ERK、JNK、Rb/E2F、AKT、細(xì)胞周期、p53通路、細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用、免疫反應(yīng)相關(guān)通路以及酶活性通路。這表明包括LTF在內(nèi)的抑癌基因等可能都是處于這個連鎖反應(yīng)的關(guān)鍵部位，個別基因的失活是有其他因素的誘導(dǎo)調(diào)控(這些因素可能是理化因素、生物因素環(huán)境因素等，也有可能是抑癌基因的時候或者癌基因的激活)，也有可能成為下一步腫瘤演變中的推動力量。這提示如果控制腫瘤形成的關(guān)鍵靶點(diǎn)，可以切斷其演變的進(jìn)程。

綜上所述，LTF在多種腫瘤里表現(xiàn)為抑癌基因性質(zhì)。LTF在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，如調(diào)節(jié)NK細(xì)胞活動，腫瘤化學(xué)預(yù)防活動，G1蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)，抑制細(xì)胞增殖，增強(qiáng)細(xì)胞凋亡。但是更多的研究發(fā)現(xiàn)，LTF在多種腫瘤中呈現(xiàn)低表達(dá)，其表達(dá)失活的原因主要涉及基因水平和表觀遺傳學(xué)水平的調(diào)節(jié)機(jī)制。如LTF基因啟動子區(qū)高甲基化，組蛋白去乙?；揎?，雜合性缺失和基因突變。在接下來的研究中，我們應(yīng)從多維度對LTF基因的抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究，同時靶向調(diào)控抑制其在腫瘤中的異常失活狀態(tài)。

1 Kost-Alimova M，Imreh S．Modeling non-random deletions in cancer［J］．Semin Cancer Biol，2007，17(1):19-30

2 Metz-Boutigue MH，Jolles J，Mazurier J，et al．Human lactotransferrin:amino acid sequence and structural comparisons with othertransferrins［J］．Eur J Biochem，1984，145(3):659-676

3 韓柱，侯小康．人乳鐵蛋白異源表達(dá)的研究進(jìn)展［J］．河北化工，2010，33(10):26-28

4 Querinjean P，Masson PL，Heremans JF．Molecular weight，singlechain structure and amino acid composition of humanlactoferrin［J］．Eur J Biochem，1971，20(3):420-425

5 Iyer S，Lonnerdal B．Lactoferrin，lactoferrin receptors and iron metabolism［J］．Eur J Clin Nutr，1993，47(4):232-241

6 Levay PF，Viljoen M．Lactoferrin:a general review［J］．Haematologica，1995，80(3):252-267

7 Bezault J，Bhimani R，Wiprovnick J，et al．Human lactoferrin inhibits growth of solid tumors and development of experimentalmetastases in mice［J］．Cancer Res，1994，54(9):2310-2312

8 Shaheduzzaman S，Vishwanath A，F(xiàn)urusato B，et al．Silencing of Lactotransferrin expression by methylation in prostate cancerprogression［J］．Cancer Biol Ther，2007，6(7):1088-1095

9 Bezault J，Bhimani R，Wiprovnick J，et al．Human lactoferrin inhibits growth of solid tumors and development of experimentalmetastases in mice［J］．Cancer Res，1994，54(9):2310-2312

10 Iijima H，Tomizawa Y，Iwasaki Y，et al．Genetic and epigenetic inactivation of LTF gene at 3p21．3 in lung cancers［J］．Int J Cancer，2006，118(4):797-801

11 Zhang H，F(xiàn)eng X，Liu W，et al．Underlying mechanisms for LTF inactivation and its functional analysis innasopharyngeal carcinoma cell lines［J］．J Cell Biochem，2011，112(7):1832-1843

12 Wang WP，Iigo M，Sato J，et al．Activation of intestinal mucosal immunity in tumor-bearing mice by lactoferrin［J］．Jpn J Cancer Res，2000，91(10):1022-1027

13 Giuffre G，Barresi V，Skliros C，et al．Immunoexpression of lactoferrin in human sporadic renal cell carcinomas［J］．Oncol Rep，2007，17(5):1021-1026

14 Wolf JS，Li G，Varadhachary A，et al．Oral lactoferrin results in T cell-dependent tumor inhibition of head and necksquamous cell carcinoma in vivo［J］．Clin Cancer Res，2007，13(5):1601-1610

15 Zhou Y，Zeng Z，Zhang W，et al．Lactotransferrin:a candidate tumor suppressor-deficient expression in humannasopharyngeal carcinoma and inhibition of NPC cell proliferation by modulatingthe mitogen-activated protein kinase pathway［J］．Int J Cancer，2008，123(9):2065-2072

16 Xiong W，Zeng ZY，Xia JH，et al．A susceptibility locus at chromosome 3p21 linked to familial nasopharyngealcarcinoma［J］．Cancer Res，2004，64(6):1972-1974

17 Zhou Y，Zeng Z，Zhang W，et al．Identification of candidate molecular markers of nasopharyngeal carcinoma bymicroarray analysis of subtracted cDNA libraries constructed by suppressionsubtractive hybridization［J］．Eur J Cancer Prev，2008，17(6):561-571

18 Zhang H，F(xiàn)eng X，Liu W，et al．Underlying mechanisms for LTF inactivation and its functional analysis innasopharyngeal carcinoma cell lines［J］．J Cell Biochem，2011，112(7):1832-1843

19 翟艷輝，李瑩，胡文，等．染色體3p21_3缺失區(qū)域11個相關(guān)基因在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)［J］．中國肺癌雜志，2009，12(8):853-858