LIMK與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展

周志剛 秦 晶 姜 浩 蘇 琦

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本特征，是導(dǎo)致癌癥患者死亡的最重要原因之一。目前大量研究證實(shí)，LIM激酶(LIM kinase，LIMK)在多種人類腫瘤尤其高侵襲性的腫瘤中高表達(dá)。LIMK通過磷酸化和失活肌動蛋白解聚因子cofilin調(diào)節(jié)actin聚合，參與調(diào)節(jié)腫瘤血管的生成、腫瘤細(xì)胞遷移和增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展等多種腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，LIMK可能是一個很有潛力的遏制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的治療靶點(diǎn)。

一、LIMK的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能

LIMK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，LIMK家族有兩個成員，即LIMK1和LIMK2。LIMK1基因位于7q11．23，含39499個堿基，包括16個外顯子;LIMK2基因位于22q12．2，含68617個堿基，包括19個潛在外顯子。兩者在結(jié)構(gòu)上都具有兩個N-末端的LIM結(jié)構(gòu)域、C-末端的激酶結(jié)構(gòu)域與兩者之間的一個PDZ結(jié)構(gòu)域。LIM激酶具有50%的整體序列同源性，而激酶結(jié)構(gòu)域的序列同源性高達(dá)70%，其中LIM結(jié)構(gòu)域由LIM1和LIM2一對鋅指結(jié)構(gòu)域組成，富含半胱氨酸/組氨酸序列，是多種蛋白與蛋白之間相互作用的結(jié)構(gòu)域，在調(diào)節(jié)激酶活性中起重要作用。PDZ結(jié)構(gòu)域包括兩個富含亮氨酸的核輸出信號，可影響LIMK的核漿穿梭，使LIMK1優(yōu)先定位在細(xì)胞質(zhì)中，而缺失PDZ結(jié)構(gòu)域的LIMK1突變體則主要定位在細(xì)胞核中。C-末端激酶部分包含一個由一段堿性氨基酸殘基所構(gòu)成的核定位序列［1］。

LIMK1和LIMK2均可磷酸化ADF/cofilin的第3位絲氨酸(Ser3)，使其不能切割F-actin形成G-actin而失活，從而調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合，LIMK整合了多種調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合的上游通路信號，對血管生成、細(xì)胞遷移、增殖、細(xì)胞周期、形態(tài)發(fā)生及癌變等多種細(xì)胞生物學(xué)功能具有重要影響。雖然LIMK1和LIMK2結(jié)構(gòu)明顯相似，但兩者亞細(xì)胞定位不同，LIMK1主要定位于黏著斑，而LIMK2主要集中在細(xì)胞質(zhì)中的斑點(diǎn)，這表明它們可能具有不同的細(xì)胞功能，LIMK1主要參與癌細(xì)胞中微管的拆卸及侵襲轉(zhuǎn)移，LIMK2則在促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展中起重要作用［2，3］。

二、LIMK的調(diào)節(jié)機(jī)制

1．LIMK活性的正調(diào)節(jié):LIMK的活性受到GTPase Rho蛋白調(diào)控。GTPase Rho蛋白家族成員包括Rho，Rac和 Cdc42，分別通過其下游效應(yīng)激酶ROCK1/2、PAK1/2/4 和 MRCK α，使 LIMK 磷酸化而激活。Rho/ROCK1-2通過磷酸化LIMK1第508位蘇氨酸(Thr-508)和LIMK2第505位蘇氨酸(Thr-505)分別激活LIMK1和LIMK2［1］。遷移的腫瘤細(xì)胞前緣突出需要對板狀偽足中的F-actin網(wǎng)絡(luò)的精密調(diào)節(jié)，而Rac1/Pak1/LIMK1信號途徑可調(diào)控層狀偽足內(nèi)的 ADF/cofilins活性，ADF/cofilins活性增加可加速F-actin倒轉(zhuǎn)和逆行流動，使層狀偽足變寬，促進(jìn)遷移侵襲［4］。PAK2可誘導(dǎo) LIMK和 cofilin磷酸化，沉默PAK2基因則使LIMK磷酸化明顯降低。肝細(xì)胞生長因子(HGF)可通過PAK4磷酸化LIMK1導(dǎo)致cofilin失活，促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞遷移侵襲［5］。PKA可通過磷酸化 Ser-323和Ser-596激活LIMK1［6］。腫瘤抑制蛋白Plexin C1通過上調(diào)LIMK2誘導(dǎo)cofilin磷酸化和失活，抑制黑色素瘤進(jìn)展［7］。

2．LIMK活性的負(fù)調(diào)節(jié):抑制PAK調(diào)控細(xì)胞遷移的蛋白Nischarin的N-末端結(jié)構(gòu)域與LIMK1的PDZ和激酶結(jié)構(gòu)域的相互作用，可導(dǎo)致LIMK1的Thr-508磷酸化減少及其活性降低［8］。泛素連接酶Rnf6可結(jié)合并催化LIMK1多聚泛素化，導(dǎo)致其被蛋白酶體降解加快，半衰期從20h減少至4h［9］。研究發(fā)現(xiàn)，腦特異性miR-134可與LIMK1 mRNA的3'UTR結(jié)合而阻止mRNA的翻譯過程，下調(diào)LIMK1蛋白表達(dá)［10］。還有報道LATS1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體Ⅱ及Par-3也參與了LIMK的負(fù)性調(diào)節(jié)。

三、LIMK與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移

腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是涉及到腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)之間的一個多步驟、多基因、多因素參與的極其復(fù)雜的過程，包括腫瘤血管生成、腫瘤遷移和增殖能力增強(qiáng)、細(xì)胞周期進(jìn)展等多種腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的改變。LIMK通過多種作用機(jī)制調(diào)節(jié)其下游蛋白在促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中扮演著重要角色。

1．LIMK與腫瘤血管生成:新生血管形成是腫瘤進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移多步驟過程中的一個重要環(huán)節(jié)，是一個涉及腫瘤發(fā)生、增殖及生長的多條通路的復(fù)雜動態(tài)的過程。腫瘤新生血管一般不夠成熟，管壁薄弱，基膜不完整，細(xì)胞間常有裂隙，因此通透性高，是腫瘤細(xì)胞血行轉(zhuǎn)移的最主要途徑。研究證實(shí)，血管生成在前列腺癌的進(jìn)展過程中具有重要作用［11］。LIMK1在人乳腺癌組織中高表達(dá)，并且通過上調(diào)uPA表達(dá)，誘導(dǎo)裸鼠移植瘤血管的生成，高表達(dá)LIMK1的人乳腺癌細(xì)胞形成的移植瘤中血管數(shù)目是對照組移植瘤的3～4倍，在肺部和肝臟出現(xiàn)多個微小轉(zhuǎn)移灶的比率為38%，而對照組中未出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［12］。沉默LIMK1或LIMK2基因均能減少胰腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤新生血管形成，雙重敲除LIMK1和LIMK2則可完全阻遏其侵襲及微小轉(zhuǎn)移灶的形成，證明LIMK1和LIMK在胰腺癌的進(jìn)展與轉(zhuǎn)移起著重要作用［3］。VEGF可通過激活p38/MPKAP kinase-2/LIMK1通路觸發(fā)annexin 1的磷酸化，有助于內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和血管形成，而敲除LIMK1可遏制VEGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的能力［13］。LIMK可能通過多種分子機(jī)制參與腫瘤血管的生成，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。

2．LIMK與細(xì)胞遷移:腫瘤細(xì)胞的遷移能力與其侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究顯示，LIMK1高表達(dá)可促進(jìn)對長春新堿耐藥的骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，而沉默LIMK1后骨肉瘤細(xì)胞遷移能力下降［14］。LIMK1可增強(qiáng)細(xì)胞的遷移而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，敲除LIMK1可抑制鼠腹腔積液肝癌細(xì)胞的遷移侵襲能力［15］。抑制LIMK可通過減少細(xì)胞遷移而有效阻遏TGF-β所誘導(dǎo)的遷移與侵襲［16］。Nischarin可通過負(fù)調(diào)控LIMK/cofilin通路抑制LIMK活性與磷酸化cofilin而抑制的乳腺癌遷移侵襲［8］。Nischarin與絲氨酸-蘇氨酸激酶LKB1可共同調(diào)節(jié)PAK-LIMK-cofilin和cyclin D1/CDK4通路，Nischarin和 LKB1缺失導(dǎo)致PAK1和LIMK1磷酸化水平升高，促進(jìn)侵襲性乳腺癌細(xì)胞的遷移與速度和腫瘤生長與肺轉(zhuǎn)移［17］。PKA可以直接磷酸化LIMK1，在細(xì)胞遷移過程中起重要作用［7］。PAK4相互作用蛋白 DGCR6L通過 PAK4/LIMK1通路可促進(jìn)人胃癌細(xì)胞的遷移，沉默DGCR6L可明顯抑制遷移［18］。Fascin-1在很多惡性腫瘤中高表達(dá)，其通過與LIMK1/2形成復(fù)合物調(diào)節(jié)絲狀偽足的穩(wěn)定性而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移［19］。PKD1可介導(dǎo)PAK4磷酸化，形成PAK4/LIMK/PKD1復(fù)合物調(diào)節(jié)cofilin活性，導(dǎo)致細(xì)胞遷移［20］。LIMK1的表達(dá)與結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的遷移侵襲能力呈正相關(guān)，二烯丙基二硫可通過下調(diào)Rac1-ROCK1/PAK1-LIMK1-ADF/cofilin通路抑制SW480細(xì)胞的遷移與侵襲［21］。抑制PKCζ能降低膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的遷移侵襲能力，其機(jī)制與損害LIMK和cofilin磷酸化有關(guān)［22］。LIMK1在乳腺癌細(xì)胞質(zhì)和胞核中均有表達(dá)，并可促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力增加與裸鼠移植瘤腫瘤生長［23］。p57kip2可增強(qiáng)LIMK1的活性磷酸化失活cofilin，而且能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中肌動蛋白應(yīng)力纖維的形成，導(dǎo)致肌動蛋白動態(tài)比減少，從而影響其在細(xì)胞中的周轉(zhuǎn)率，抑制腫瘤細(xì)胞遷移［24］。也有研究發(fā)現(xiàn)，敲除p57kip2可因LIMK1/2磷酸化水平降低而促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的遷移與侵襲。

3．LIMK與增殖:在惡性腫瘤細(xì)胞中促進(jìn)細(xì)胞增殖的信號通路通常是激活的，LIMK1作為一種關(guān)鍵的細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)劑，常參與對細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)。LIMK1可促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞增殖率增加50% ～83%，并通過增加uPA在腫瘤中的表達(dá)促進(jìn)裸鼠移植瘤的生長，而且腫瘤壞死區(qū)域減少［12］。敲除 LIMK1和LIMK2可導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞增殖下降［3］。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)在人的結(jié)直腸癌細(xì)胞系和腫瘤中LIMK2的表達(dá)是降低的，而且LIMK2表達(dá)和活性是隨著疾病進(jìn)展而逐步降低，同時證實(shí)LIMK2可抑制胃腸干細(xì)胞的增殖，LIMK2缺失的小鼠癌癥模型中結(jié)腸腫瘤的體積增加以及出現(xiàn)更嚴(yán)重的不典型增生和過度增生表型，LIMK2表達(dá)和底物磷酸化的減少均與患者的生存期短有關(guān)［25］。因此LIMK對細(xì)胞增殖的影響可能是多方面的，目前仍需進(jìn)一步研究。

4．LIMK與細(xì)胞周期:LIMK也參與細(xì)胞周期進(jìn)展，而且LIMK1和LIMK2在細(xì)胞分裂的過程中具有不同的作用。研究證實(shí)，LIMK1在前列腺腫瘤和前列腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，在轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞中磷酸化cofilin濃度更高，減少LIMK1可使細(xì)胞阻滯于G2/M期而抑制細(xì)胞增殖。在G1期LIMK1有助于保持細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶的活性，在有絲分裂的前中期和中期階段LIMK1的活性和cofilin的磷酸化水平增加，在后期、末期和胞質(zhì)分裂期恢復(fù)到基礎(chǔ)水平，在有絲分裂過程中抑制LIMK1的活性，可延遲有絲分裂進(jìn)程(中期到后期)。在3T3小鼠成纖維細(xì)胞中ROCK可活化LIMK2導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白A水平增加而促進(jìn)G1/S期細(xì)胞周期進(jìn)展。在MDA-MB-435腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)LIMK1也能使細(xì)胞周期明顯進(jìn)展［13］。

LIMK主要通過磷酸化和失活cofilin調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。然而，最新的研究卻發(fā)現(xiàn)LIMK1活性增加可通過影響肌動蛋白在細(xì)胞中的周轉(zhuǎn)率而抑制腫瘤細(xì)胞遷移［24］。LIMK2能抑制胃腸干細(xì)胞的增殖［26］。也有報道認(rèn)為LIMK2b是一種潛在的腫瘤抑制基因，LIMK2b在食管癌和甲狀腺癌中下調(diào)，LIMK2b高表達(dá)使腫瘤細(xì)胞G2/M阻滯延長并抑制腫瘤細(xì)胞遷移。亦有研究證實(shí)LIMK2參與了刺激膜雄激素受體誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的凋亡過程。另外，LIMK還可通過形成促凋亡DAPK/LIMK/cofilin多蛋白復(fù)合物而參與TNF誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，有關(guān)LIMK對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制，仍需更深入細(xì)致的研究。而且，當(dāng)前對于LIMK的相關(guān)研究大多數(shù)是建立在體外實(shí)驗或動物實(shí)驗基礎(chǔ)上，臨床研究還不多，希望以后多開展臨床方面研究，同時為開發(fā)針對LIMK的高效、特異、低毒的抑制劑找到突破點(diǎn)。

1 Manetti F．LIM kinases are attractive targets with many macromolecular partners and only a few small molecule regulators［J］．Med Res Rev，2012，32(5):968-998

2 Bernard O．Lim kinases，regulators of actin dynamics［J］．Int J Biochem Cell Biol，2007，39(6):1071-1076

3 Vlecken DH，Bagowski CP．LIMK1 and LIMK2 are important for metastatic behavior and tumor cell-induced angiogenesis of pancreatic cancer cells［J］．Zebrafish，2009，6(4):433-439

4 Delorme V，Machacek M，DerMardirossian C，et al．Cofilin activity downstream of Pak1 regulates cell protrusion efficiency by organizing lamellipodium and lamella actin networks［J］．Dev Cell，2007，13(5):646-662

5 Ahmed T，Shea K，Masters JRW，et al．A PAK4-LIMK1 pathway drives prostate cancer cell migration downstream of HGF［J］．Cell Signal，2008，20(7):1320-1328

6 Nadella KS，Saji M，Jacob NK，et al．Regulation of actin function by protein kinase A-mediated phosporylation of LIMK1［J］．EMBO Rep，2009，10:599-605

7 Scott GA，McClelland LA，F(xiàn)ricke AF，et al．Plexin C1，a receptor for semaphorin 7a，inactivates cofilin and is a potential tumor suppressor for melanoma progression［J］．J Invest Dermatol，2009，129(4):954-963

8 Ding Y，Milosavljevic T，Alahari SK．Nischarin inhibits LIM kinase to regulate cofilin phosphorylation and cell invasion［J］．Mol Cell Biol，2008，28:3742-3756

9 Tursun B，Schluter A，Peters MA，et al．The ubiquitin ligase Rnf6 regulates local LIM kinase 1 levels in axonal growth cones［J］．Genes Dev，2005，19(19):2307-2319

10 Schratt GM，Tuebing F，Nish EA，et al．A brain-specific microRNA regulates dendritic spine development［J］．Nature，2006，439(7074):283-289

11 Aragon-Ching JB，Madan RA，Dahut WL．Angiogenesis inhibition in prostate cancer:current uses and future promises［J］．Oncol，2010:361836

12 Bagheri-Yarmand R，Mazumdar A，Sahin AA，et al．LIM kinase 1 increases tumor metastasis of human breast cancer cells via regulation of the urokinase-type plasminogen activator system［J］．Int J Cancer，2006，118(11):2703-2710

13 C^oté MC，Lavoie JR，Houle F，et al．Regulation of vascular endothelial growth factor-induced endothelial cell migration by LIM kinase 1-mediated phosphorylation of annexin 1［J］．J Biol Chem，2010，285(11):8013-8021

14 Zhang H，Wang Y，Xing F，et al．Overexpression of LIMK1 promotes migration ability of multidrug-resistant osteosarcoma cells［J］．Oncol Res，2011，19(10-11):501-509

15 Horita Y，Ohashi K，Mukai M，et al．Suppression of the invasive capacity of rat ascites hepatoma cells by knockdown of Slingshot or LIM kinase［J］．J Biol Chem，2008，283(10):6013-6021

16 Morin P，Wickman G，Munro J，et al．Differing contributions of LIMK and ROCK to TGFβ -induced transcription，motility and invasion［J］．Eur J Cell Biol，2011，90(1):13-25

17 Jain P，Baranwal S，Dong S，et al．Integrin-binding protein nischarin interacts with tumor suppressor liver kinase B1(LKB1)to regulate cell migration of breast epithelial cells［J］．J Biol Chem，2013，288(22):15495-15509

18 Li X，Ke Q，Li Y，et al．DGCR6L，a novel PAK4 interaction protein，regulates PAK4-mediated migration of human gastric cancer cell via LIMK1［J］．Int J Biochem Cell Biol，2010，42(1):70-79

19 Jayo A，Parsons M，Adams JC．A novel Rho-dependent pathway that drives interaction of fascin-1 with p-Lin-11/Isl-1/Mec-3 kinase(LIMK)1/2 to promote fascin-1/actin binding and filopodia stability［J］．BMC Biol，2012，10:72

20 Bastea LI，Difppler H，Pearce SE，et al．Protein kinase D-mediated phosphorylation at Ser99 regulates localization of p21-activated kinase 4［J］．Biochem J，2013，455(2):251-260

21 Zhou Y，Su J，Shi L，et al．DADS downregulates the Rac1-ROCK1/PAK1-LIMK1-ADF/cofilin signaling pathway，inhibiting cell migration and invasion［J］．Oncol Rep，2013，29(2):605-612 22 Guo H，Gu F，Li W，et al．Reduction of protein kinase C zeta inhibits migration and invasion of human glioblastoma cells［J］．J Neurochem，2009，109(1):203-213

23 McConnell BV，Koto K，Gutierrez-Hartmann A．Nuclear and cytoplasmic LIMK1 enhances human breast cancer progression［J］．Mol Cancer，2011，10:75

24 Vlachos P，Joseph B．The Cdk inhibitor p57(Kip2)controls LIM-kinase 1 activity and regulates actin cytoskeleton dynamics［J］．Gene Expr Patterns，2011，11(3-4):221-232

25 Lourenfio FC，Munro J，Brown J，et al．Reduced LIMK2 expression in colorectal cancer reflects its role in limiting stem cell proliferation［J］．Gut，2014，63(3):480-493