人體不同解剖部位表皮基底層中CD34蛋白表達(dá)及意義

胡明華 袁憲宇 吳長(zhǎng)初 朱 喜

（1長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)和組織胚胎學(xué)教研室，長(zhǎng)沙410219；2中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院健康管理科，長(zhǎng)沙410013）

CD34是人體內(nèi)一種常見(jiàn)的高糖基化分子，其分子表面存在許多糖修飾表位，根據(jù)糖修飾表位的不同［1］，CD34被分成I型、Ⅱ型、Ⅲ型。CD34在臨床上已經(jīng)被證實(shí)為造血干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，同時(shí)，CD34還在許多成體干細(xì)胞中表達(dá)。CD34可參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的粘連，具有不同的生物學(xué)功能及生物學(xué)結(jié)構(gòu)活性，可廣泛分布在大多數(shù)白細(xì)胞、紅細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中。表皮組織具有強(qiáng)大的修復(fù)能力，主要是由于表皮干細(xì)胞的作用，但由于表皮干細(xì)胞缺乏特異性的CD分子標(biāo)志物［2］，因此，尋找一種與表皮干細(xì)胞密切相關(guān)的標(biāo)志物則十分重要。本研究采用組織學(xué)觀察法、雙免疫標(biāo)記法、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人包皮、頭皮和軀干皮膚來(lái)源的組織標(biāo)本中CD34蛋白表達(dá)，探討CD34蛋白作為表皮干細(xì)胞的標(biāo)志物的可行性。

材料和方法

1.材料

分別選取2013年1月至2014年1月在我院泌尿外科進(jìn)行包皮環(huán)切術(shù)患者包皮組織標(biāo)本60份，其中20份供者年齡＜20歲，20份供者年齡20－40歲，20份供者年齡40歲以上。選取同時(shí)期健康者頭皮和軀干皮膚來(lái)源的組織標(biāo)本各60份，頭皮組織和軀干皮膚均來(lái)源于自愿者，均簽署知情同意書(shū)。

2.方法

2.1 CD34免疫組織化學(xué)

組織標(biāo)本均制成1 cm×0.5 cm的皮片，在4%多聚甲醛中進(jìn)行固定，過(guò)夜后對(duì)組織進(jìn)行梯度脫水，再用石蠟包埋，切片，厚度為5μm。首先將石蠟切片浸于一抗（CD34∶1∶50）中孵育，4℃過(guò)夜，使用PBS進(jìn)行漂洗，室溫平衡20 min，加入酶標(biāo)抗兔／鼠聚合物孵育，室溫30 min，DAB顯色，蘇木素進(jìn)行復(fù)染，乙醇進(jìn)行梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，在普通光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。采用SP法測(cè)定組織細(xì)胞中CD34，兔抗人CD33單克隆抗體有北京金橋生物公司提供?？瞻讓?duì)照：使用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，結(jié)果提示陰性；使用己知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果提示陽(yáng)性，其他步驟與實(shí)驗(yàn)標(biāo)本相同。結(jié)果觀察：CD34組織著色棕色為陽(yáng)性。

2.2 免疫雙標(biāo)記

體外分離培養(yǎng)包皮基底層細(xì)胞，分別在原代，3代，6代時(shí)，進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)記染色檢測(cè)。細(xì)胞經(jīng)PBS漂洗，將培養(yǎng)基成分充分去除，加入4%中性多聚甲醛固定20 min；PBS充分漂洗，10%正常山羊血清進(jìn)行封閉，后加入一抗（CD34各表位BI.3C5，QBend，581，B，整合素，p63），4℃孵育過(guò)夜，PBS漂洗，加入anti.Mouse IgG／Dy Light488（1：200），anti.Rabbit IgG／Dy Light594，室溫下孵育2 d；PBS漂洗，熒光顯微鏡下觀察各蛋白的表達(dá)情況。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)

皮膚組織修整為l cm×0.5 cm大小的皮片。并按照上述分離富集表皮基底層細(xì)胞的方法獲取表皮基底層細(xì)胞。獲得細(xì)胞分別與CD34的三種表型p63或者β1整合素進(jìn)行孵育，含BSA的PBS漂洗后，加入FITC.conjugated goat anti.mouseIgG（BD Pharmingen）作為二抗。用PBS溶液代替一抗，其他步驟相同作為空白對(duì)照。經(jīng)流氏檢測(cè)，記錄各表位的陽(yáng)性率。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均用SPSS19.0軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.CD34蛋白的表達(dá)

CD34蛋白在人包皮和頭皮的表皮基底層細(xì)胞中有表達(dá)，而在人軀干皮膚的表皮中無(wú)表達(dá)。并且，在同一組織內(nèi)，不同表位的CD34蛋白的表達(dá)也不均衡。Ⅰ型表位CD34蛋白的分布比Ⅱ、Ⅲ型表位CD34蛋白更加廣泛（圖1）。A1提示CD34主要表達(dá)在頭皮及包皮的表皮基底層細(xì)胞，A2提示在軀干皮表皮中未發(fā)現(xiàn)CD34各表位的表達(dá)。細(xì)胞的子細(xì)胞CD34陽(yáng)性的細(xì)胞在表皮中的分布與表皮干細(xì)胞的分布基本相同，均主要在表皮突的底部。

圖1 CD34各表位在頭皮、包皮、軀干皮的分布情況。標(biāo)尺＝50μmFig.1 CD34 epitope distribution in each scalp，foreskin，the skin of the trunk.Bar＝50μm

2.CD34陽(yáng)性細(xì)胞與ESCs特征性標(biāo)記表達(dá)情況

利用β1整合素或是p63對(duì)分離的基底層細(xì)胞進(jìn)行分選能夠獲得ESCs，CD34陽(yáng)性細(xì)胞同時(shí)表達(dá)p63或者β1整合素，并且CD34三種表位在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中的表達(dá)隨著細(xì)胞傳代而減少。CD34陽(yáng)性細(xì)胞、p63、β1整合素在原代及3代細(xì)胞中均存在表達(dá)，且與傳代陽(yáng)性數(shù)目呈負(fù)相關(guān)性。

3.不同年齡CD34的表達(dá)情況

CD34I型表位陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于II型和III型（P＜0.05），不同年齡組的CD34各表位之間比較，陽(yáng)性率無(wú)明顯差異（P＞0.05，表1）。

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同年齡CD34不同表位的表達(dá)（±s）Table 1 FCM different ages different epitopes CD34 expression（±s）

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同年齡CD34不同表位的表達(dá)（±s）Table 1 FCM different ages different epitopes CD34 expression（±s）

年齡（歲）Age（years）例數(shù)Cases CD34表位（CD34 epitope）Ⅰ型（Ⅰtype） Ⅱ型（Ⅱtype） Ⅲ型（Ⅲtype）＜20 20 35.04±2.41 8.92±0.30 20.63±1.12 20－40 20 35.49±2.67 9.27±0.90 20.48±0.81＞40 20 35.39±2.01 9.32±1.24 20.68±1.12

討 論

ESCs（胚胎干細(xì)胞）是皮膚自我修復(fù)及自我更新的關(guān)鍵，部分潛在的ESCs標(biāo)記可分離ESCs與角質(zhì)細(xì)胞。部分研究顯示，ESCs重點(diǎn)分布在表皮突的深嵴部，CD34各個(gè)表位的陽(yáng)性細(xì)胞同時(shí)也分布于表皮突的底部，分布于嵴間的略可見(jiàn)少許散在表達(dá)的CD34細(xì)胞，因此，在表皮分布區(qū)，可見(jiàn)到分布特征類(lèi)似的ESCs與CD34。選用CD34蛋白作為篩選ESCs的潛在表面標(biāo)記具有以下幾種優(yōu)點(diǎn)：一是皮膚可以不斷的進(jìn)行自我更新；二是ESCs的數(shù)量不會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而減少；三是ESCs在環(huán)境刺激又到下發(fā)生轉(zhuǎn)分化的能力不會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而變?nèi)酢?/p>

表皮干細(xì)胞主要存在于表皮細(xì)胞的表皮突底部，在皮膚受到損傷時(shí)，能夠起到重要的自我修復(fù)作用［4］。而在研究中發(fā)現(xiàn)［5］，表皮干細(xì)胞的表面無(wú)特異性的CD分子標(biāo)志物，傳統(tǒng)的研究中，主要使用β1整合素以及p63作為表皮干細(xì)胞的分選標(biāo)記［7］。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，表皮細(xì)胞中的CD34陽(yáng)性細(xì)胞存在于表皮的表皮突底部，與表皮干細(xì)胞的分布十分相似。研究發(fā)現(xiàn)［8］，CD34陽(yáng)性細(xì)胞同時(shí)存在β1整合素和p63的表達(dá)，因此，CD34陽(yáng)性細(xì)胞有可能作為表皮干細(xì)胞分選的標(biāo)志物。但CD34陽(yáng)性細(xì)胞僅存在在于頭皮和包皮的基底層細(xì)胞中，而在軀干皮的基底層細(xì)胞中無(wú)表達(dá)，因此，其僅可能用于分選頭皮和包皮的表皮干細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CD34蛋白在表皮內(nèi)的含量并不會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而減少，作為分選表皮干細(xì)胞的標(biāo)志物，CD34蛋白更加穩(wěn)定。在頭皮和包皮的表皮干細(xì)胞分選中，CD34蛋白是更加理想的分選標(biāo)志物。

但在某些實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的CD34檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)結(jié)果存在嚴(yán)重差異，整合以往的資料，存在此種現(xiàn)象的原因可能分別以下幾種：（1）早期的實(shí)驗(yàn)只進(jìn)行單一的Ⅱ型表位檢測(cè)，因此在同時(shí)進(jìn)行CD34的多種表位，可以更加清晰的表述CD34的表達(dá)狀態(tài)；（2）檢測(cè)部位的不同可能導(dǎo)致結(jié)論不同；（3）不同的實(shí)驗(yàn)室可能采取的實(shí)驗(yàn)方法存在差異，因此導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異。針對(duì)上述情況，試驗(yàn)中我們選取了不同解剖部位的皮膚進(jìn)行CD34表位的表達(dá)情況的研究，可以找出早期實(shí)驗(yàn)中存在差異結(jié)果的原因。

綜上所述，CD34陽(yáng)性分子與表皮干細(xì)胞在頭皮和包皮的表皮基底層細(xì)胞中有十分相似的分布，可以作為頭皮和包皮中表皮干細(xì)胞分選的標(biāo)志物，但其還需要不斷深入的研究，同時(shí)，ESCs具備多向分化的能力，且其自身多潛能的能力仍然在不斷發(fā)展，因此，在未來(lái)的研究中，ESCs將會(huì)更多的應(yīng)用于臨床與動(dòng)物疾病模型中。

［1］牛云飛，路衛(wèi)，夏照帆等.表皮干細(xì)胞在人體不同部位皮膚的分布差異.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，25（9）：959－961

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