Ephrin－A3逆向通路對(duì)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸攝取能力的影響

楊錦珊 徐 莉 魏慧星 吳 鋼 謝敏杰 王 偉＊

（1福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福州350000；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢430030）

EphA／ephrin－A信號(hào)系統(tǒng)作為獨(dú)特的雙向的信號(hào)傳遞過程。意味著ephrin－A配體結(jié)合相應(yīng)的EphA受體后一方面向EphA受體所在的細(xì)胞傳導(dǎo)正向信號(hào)，另一方面同時(shí)能接受來自于EphA受體向ephrin－A所在的細(xì)胞傳導(dǎo)的逆向通路信號(hào)［1］。EphA／ephrin－A信號(hào)系統(tǒng)廣泛參與介導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、軸突導(dǎo)向、血管生成、突觸可塑性及神經(jīng)再生等病理生理過程［2－4］。Ephrin－A3是海馬正常及缺血條件下表達(dá)均最為豐富的ephrin－A配體，主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞，而EphA4為海馬區(qū)表達(dá)最為豐富的EphA受體，并且是ephrin－A3最重要的激動(dòng)劑，可介導(dǎo)經(jīng)由ephrin－A3的逆向信號(hào)傳遞。EphA4介導(dǎo)的ephrin－A3逆向通路此前被發(fā)現(xiàn)與調(diào)節(jié)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體及樹突棘形態(tài)、突觸的功能有關(guān)［5，6］。本研究使用預(yù)聚集化的 EphA4－Fc激動(dòng)星形膠質(zhì)細(xì)胞ephrin－A3，在不同時(shí)間點(diǎn)測定培養(yǎng)基谷氨酸濃度，以探討星形膠質(zhì)細(xì)胞ephrin－A3與其谷氨酸攝取能力之間的關(guān)系，為了進(jìn)一步探索病理狀態(tài)下星形膠質(zhì)細(xì)胞ephrin－A3的調(diào)控作用提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

材料和方法

1.材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

出生2d內(nèi)的SD乳鼠由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

DMEM／F12、胎 牛 血 清、0.25% 胰 蛋 白 酶、PBS、HBSS、EBSS購自美國Hyclone公司；多聚賴氨酸、2－（4－Amidinophenyl）－6－indolecarbamidine dihydrochloride（DAPI）、谷氨酸、99%甘油、Triton－X100購自美國Sigma公司；BSA、CHAPS購自美國Amresco公司；蛋白 Marker（0671）購自加拿大Fermentas公司；重組小鼠EphA4Fc嵌合體購自美國R﹠Dsystems公司；重組人IgG（Fc）、山羊抗人IgG（Fc）抗體、CY3標(biāo)記的山羊抗兔抗體、FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體購自美國Jackson ImmunoResearchLaboratories公司；兔抗大鼠ephrin－A3抗體購自美國Novus公司；小鼠抗大鼠膠質(zhì)細(xì)胞纖維酸性蛋白（GFAP）抗體購自美國Neomarkers公司；兔抗大鼠β－tubulin抗體購自武漢啟動(dòng)子生物有限公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物試劑公司；PVDF膜（0.45μm）購自美國 Millipore公司；BCA蛋白定量試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)公司；SDSPAGE凝膠配制試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Amplex Red谷氨酸／谷氨酸鹽氧化酶分析試劑盒購自美國Invitrogen公司。超凈工作臺(tái)購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；恒溫孵育箱、三氣培養(yǎng)箱、超聲波裂解儀購自加拿大Thermo Fisher Scientific公司；熒光顯微鏡（BX51型）購自日本Olympus公司；臺(tái)式低溫離心機(jī)購自德國Eppendorf公司；電泳儀購自美國Bio－Rad公司；凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Syngene公司；Infinite 200多功能熒光酶標(biāo)儀購自奧地利Tecan公司。

2.方法

2.1 大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)

于無菌條件下取P0或P1天SD大鼠大腦，剔除腦膜和血管后小心分離雙側(cè)海馬，用顯微剪剪成1mm×1mm×1mm的小塊，以終濃度0.125%的胰蛋白酶消化后吹打成單細(xì)胞懸液，經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾，800rpm×8min離心并小心棄去上清后以含20%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶置于37℃含95%O2、5%CO2的恒溫孵育箱中培養(yǎng)，每2－3d更換培養(yǎng)基，細(xì)胞生長至80%融合時(shí)以1∶2比例傳代于新培養(yǎng)瓶，F(xiàn)2代細(xì)胞以3×105／cm2的細(xì)胞密度接種于多聚賴氨酸包被的玻片，10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿或12孔細(xì)胞培養(yǎng)板用于細(xì)胞染色鑒定或進(jìn)一步干預(yù)。

2.2 離體培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度鑒定

將細(xì)胞爬片以100%冰甲醇固定15min，0.25%Triton X100PBS 破 膜 15min，10%BSA PBS封閉2h減少非特異性結(jié)合，小鼠抗GFAP一抗（1∶200）4℃孵育過夜，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗小鼠二抗（1∶200）室溫孵育1h，DAPI（10μg／ml）復(fù)染細(xì)胞核，50%甘油封片，Olympus熒光顯微鏡顯像并拍照。

2.3 海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的氧糖剝奪（OGD）及復(fù)氧復(fù)糖

純化的F2代海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，用無菌PBS漂洗培養(yǎng)瓶2遍后，加入無糖的EBSS緩沖液，置于含有93%N2／5%CO2／2%O2的三氣培養(yǎng)箱中，進(jìn)行氧糖剝奪培養(yǎng)90min。隨后棄去無糖的EBSS緩沖液，用無菌PBS漂洗培養(yǎng)瓶2遍后，加入含糖的EBSS緩沖液，重新移入含95%O2和5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱復(fù)氧復(fù)糖培養(yǎng)。

2.4 免疫熒光雙標(biāo)法檢測ephrin－A3在海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)

細(xì)胞爬片固定、破膜及封閉后由小鼠抗大鼠GFAP抗體（1∶200）和兔抗大鼠ephrin－A3抗體（1∶200）組成的混合一抗4℃孵育過夜，F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗小鼠GFAP抗體（1∶200）和CY3標(biāo)記的山羊抗兔抗體（1∶400）組成的混合性二抗室溫孵育1h，甘油封片，Olympus熒光顯微鏡顯像并拍照。

2.5 Western blot法檢測糖氧剝奪后星形膠質(zhì)細(xì)胞ephrin－A3表達(dá)變化

純化的F2代海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞以均等的密度接種于10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在糖氧剝奪后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)加入CHAPS裂解液冰上充分裂解細(xì)胞30 min，搜集細(xì)胞裂解液置于4℃離心機(jī)12000rpm離心10min，搜集上清以BCA法測定蛋白濃度，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5h，加入一抗ephrin－A3（1∶500），β－tubulin（1∶1000），4℃搖床孵育過夜，TBST漂洗4次后加入二抗，室溫孵育1h，TBST漂洗4次，超敏ECL發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測ephrin－A3、β－tubulin 的 蛋 白 表 達(dá) 水 平，Gene Genius Bio－Imaging system 凝膠成像儀拍照，并利用Image J軟件系統(tǒng)分析結(jié)果。

2.6 干預(yù)藥物的配置

20μg重組小鼠EphA4Fc嵌合體與48mg羊抗人IgG（Fc）抗體溶于30μl PBS 4℃孵育過夜，對(duì)照組以人IgG（Fc）片段代替重組小鼠EphA4－Fc嵌合體孵育過夜。

2.7 星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸攝取能力檢測

實(shí)驗(yàn)分為三組，不含星形膠質(zhì)細(xì)胞的空白對(duì)照組，EphA4－Fc干預(yù)組和IgG－Fc藥物對(duì)照組，待12孔板內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞生長至80% 融合后以含100μm谷氨酸的EBSS替換細(xì)胞培養(yǎng)基，向培養(yǎng)基內(nèi)分別加入終濃度3μg／ml的預(yù)聚集化的EphA4－Fc或IgG－Fc，其中正常組細(xì)胞置于37℃含95%O2、5%CO2的恒溫孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞上清，而OGD組細(xì)胞置于含有93%N2／5%CO2／2%O2的三氣培養(yǎng)箱中，進(jìn)行氧糖剝奪培養(yǎng)90min。隨后棄去無糖的EBSS緩沖液，各亞組加入含相應(yīng)的干預(yù)藥物和谷氨酸的有糖EBSS緩沖液，重新移入含95%O2和5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱復(fù)氧復(fù)糖培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞上清。根據(jù)操作手冊(cè)使用Amplex Red谷氨酸／谷氨酸鹽氧化酶分析試劑盒及Infinite 200多功能熒光酶標(biāo)儀測定上清中谷氨酸濃度。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量結(jié)果以（ˉx±SEM）表示，隨后進(jìn)行單因素方差分析，并使用Turkey法進(jìn)一步進(jìn)行組間比較，P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.離體培養(yǎng)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞純度鑒定及ephrin－A3的表達(dá)

成熟并純化的F2代星形膠質(zhì)細(xì)胞呈不規(guī)則形，胞體肥大扁平，邊界清晰，星狀生長連接成網(wǎng)，折光性和立體感較強(qiáng)。對(duì)F2代離體培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行GFAP和DAPI免疫熒光染色鑒定純度，計(jì)算GFAP陽性細(xì)胞的比例＞98%，表明培養(yǎng)純化后的星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度＞98%，可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)（圖1A）。

圖1 原代星形膠質(zhì)細(xì)胞鑒定和ephrin－A3的表達(dá)。（A）原代星形膠質(zhì)細(xì)胞鑒定：綠色熒光為GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞，藍(lán)色熒光為DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核；（B）ephrin－A3在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)：紅色熒光為ephrin－A3的表達(dá)，綠色熒光為GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞，標(biāo)尺＝20μm。Fig.1The purity identification and ephrin－A3expression of cultured primary astrocytes（A）The purity of astrocytic cultures was determined by doublelabelingcultured cells with anti－GFAP（green）and DAPI（blue）.（B）Doubleimmunofluorescent staining of ephrin－A3（red）and GFAP （green）in cultured astrocytes.The scale bar＝20μm.

GFAP／ephrin－A3免疫熒光雙標(biāo)顯示幾乎100%的星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)ephrin－A3，ephrin－A3呈點(diǎn)狀彌漫分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞胞膜和胞漿，未見其表達(dá)于胞核（圖1B）。

2.糖氧剝奪后星形膠質(zhì)細(xì)胞ephrin－A3表達(dá)水平變化

Western blot結(jié)果表明在糖氧剝奪后ephrin－A3出現(xiàn)了一過性的蛋白表達(dá)水平上調(diào)，ephrin－A3表達(dá)水平在糖氧剝奪后1h即開始出現(xiàn)蛋白表達(dá)上調(diào)，6h到達(dá)頂峰后逐漸下降，在糖氧剝奪后的24h蛋白表達(dá)水平與正常水平相較無顯著差異（圖2）。

圖2 糖氧剝奪后星形膠質(zhì)細(xì)胞ephrin－A3表達(dá)水平變化 （A）Western blot檢測糖氧剝奪后不同時(shí)間點(diǎn)星形膠質(zhì)細(xì)胞ephrin－A3的表達(dá)；（B）半定量分析糖氧剝奪后不同時(shí)間點(diǎn)星形膠質(zhì)細(xì)胞ephrin－A3表達(dá)水平變化，＊＊P＜0.01，＊P＜0.05。Fig.2Temporal changes of ephrin－A3expression in culturedastrocytes after OGD.（A）Representative Western blots of ephrin－A3andβ－tubulin proteins incultured astrocytes0，1，3，6，12and 24hafterOGD.（B）Statistic analysis of Western blot signals of astrocytic ephrin－A3in each group after OGD，＊＊P＜0.01，＊P＜0.05.

3.EphA4－Fc對(duì)體外培養(yǎng)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸攝取能力的影響

在加入含谷氨酸的EBSS培養(yǎng)基中培養(yǎng)1、3、6及12h后，IgG對(duì)照組細(xì)胞外谷氨酸分別降至76.8%，59.6%，32.0%及12.7%，說明IgG對(duì)照組星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸攝取能力正常；與之對(duì)比，EphA4干預(yù)組細(xì)胞外谷氨酸濃度分別降至82.3%，71.7%，43.5%及19.8%，較IgG對(duì)照組顯著升高，結(jié)果顯示EphA4組星形膠質(zhì)細(xì)胞的谷氨酸攝取能力受到了明顯的抑制（圖3A）。

在加入含谷氨酸的EBSS培養(yǎng)基并糖氧剝奪培養(yǎng)90min后的0、1、3及6h進(jìn)行細(xì)胞外谷氨酸濃度測定發(fā)現(xiàn)，IgG對(duì)照組細(xì)胞外谷氨酸分別降至65.9%，41.9%，11.7%及2.2%；與之對(duì)比，EphA4干預(yù)組細(xì)胞外谷氨酸濃度分別降至88.1%，63.9%，23.2%及3.3%，較IgG對(duì)照組顯著升高，結(jié)果顯示EphA4組星形膠質(zhì)細(xì)胞的谷氨酸攝取能力較IgG對(duì)照組顯著降低，在糖氧剝奪狀態(tài)下更明顯（圖3B）。

上述結(jié)果顯示EphA4介導(dǎo)的ephrin－A3逆向通路與星形膠質(zhì)細(xì)胞的谷氨酸攝取能力密切相關(guān)。

圖3 ephrin－A3逆向通路激活對(duì)離體培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸攝取能力的影響。（A）正常狀態(tài)下EphA4干預(yù)組較之IgG對(duì)照組星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸攝取能力降低；（B）糖氧剝奪狀態(tài)下EphA4干預(yù)組較之IgG對(duì)照組星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸攝取能力降低更為顯著，＊P＜0.05，n＝5。Fig.3Effect of ephrin－A3reverse signalingon glutamate clearance capability of culturedastrocytes under normal and ischemicconditions.（A）Comparing to the IgG control group，the astrocyticglutamate clearance capability declinedapparently in the EphA4group under normal condition.（B）The astrocyticglutamate clearance capability decreased more remarkably in the EphA4group than that of the IgG control group after OGD，＊P＜0.05，n＝5.

討 論

星形膠質(zhì)細(xì)胞作為哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分布最為廣泛的一種細(xì)胞，其功能涵蓋營養(yǎng)、支持、代謝、血流調(diào)節(jié)等眾多方面，尤其對(duì)于穩(wěn)定中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境更是不可或缺。越來越多的證據(jù)表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞的谷氨酸攝取能力異常與一系列神經(jīng)系統(tǒng)的疾病密不可分，興奮性氨基酸毒性被認(rèn)為與海馬遲發(fā)性神經(jīng)元凋亡、癲癇、肌萎縮側(cè)索硬化等病理過程及疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［7－13］。

Eph受體及其配體ephrin介導(dǎo)的Eph／ephrin雙向信號(hào)通路近年來廣受關(guān)注，既往的研究主要聚焦于Eph／ephrin在生長發(fā)育期所扮演的角色，然而新近研究發(fā)現(xiàn)Eph／ephrin雙向信號(hào)通路同樣涉及以缺血為代表的一系列神經(jīng)系統(tǒng)損傷與疾?。?4－17］。

研究發(fā)現(xiàn)在海馬表達(dá)于神經(jīng)元的EphA4與表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞的ephrin－A3所介導(dǎo)的神經(jīng)元－星型膠質(zhì)細(xì)胞間雙向通訊，一方面通過EphA4正向通路調(diào)節(jié)AMPA受體進(jìn)而影響樹突棘形態(tài)［18］，另一方面通過ephrin－A3逆向通路對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)行調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響突觸功能和海馬可塑性［6］。另有研究發(fā)現(xiàn)在缺血后的海馬EphA4和ephrin－A3均有明顯的表達(dá)上調(diào)，且其上調(diào)與capase－3變化趨勢相一致，提示 EphA4／ephrin－A3信號(hào)系統(tǒng)可能參與海馬缺血后的病理生理過程［19］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)ephrin－A3高表達(dá)于海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞，以預(yù)聚集化的EphA4－Fc干預(yù)星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的谷氨酸攝取能力受到明顯抑制，結(jié)合既往研究發(fā)現(xiàn)的EphA4／ephrin－A3逆向通路對(duì)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的調(diào)控［5，6］，我們認(rèn)為 E－phA4對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸攝取能力的抑制作用主要通過激活ephrin－A3逆向通路進(jìn)而下調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體來完成。盡管我們認(rèn)為預(yù)聚集化的EphA4－Fc主要通過ephrin－A3逆向通路抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的谷氨酸攝取能力，但仍不能排除E－phA4激活其他ephrin－A，為此在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中我們將特異性沉默ephrin－A3對(duì)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示ephrin－A3高表達(dá)于海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞，并且EphA4介導(dǎo)的ephrin－A3逆向通路激活顯著抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的谷氨酸攝取能力為進(jìn)一步研究EphA4／ephrin－A3逆向通路在海馬缺血后病理過程中的作用打下基礎(chǔ)。

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