自身免疫性心肌炎中Th17／Treg細(xì)胞及其相關(guān)因子的動態(tài)變化

陳清泉 房光萃 曾 彧 楊秀霖 陳開杰 陳 敏＊

（1福建醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系，福州350004；2廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院，漳州36000）

心肌炎（Myocarditis）是指各種病因引起的心肌肌層局限性或彌漫性的炎性病變，以病毒感染引起的急性心肌炎最常見，部分轉(zhuǎn)為自身免疫性心肌炎，后期可發(fā)展至擴張型心肌?。―ilated Cardiomyopathy，DCM）。DCM患者預(yù)后差，至今無特效的治療手段，在出現(xiàn)充血性心力衰竭的臨床表現(xiàn)后病死率高［1］。因此，如何有效控制心肌炎發(fā)展，是當(dāng)今醫(yī)學(xué)急待解決的問題。研究發(fā)現(xiàn)自身免疫反應(yīng)在心肌炎向擴張型心肌病發(fā)展過程中起著重要的作用，這與輔助性T細(xì)胞異?；罨嘘P(guān)，并與慢性心肌炎和心肌纖維化的發(fā)生相關(guān)［2－4］。以往認(rèn)為，心肌的炎癥損傷機制是由IFN－γ介導(dǎo)的Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)過強所致，近來發(fā)現(xiàn)Th17／Treg細(xì)胞平衡對于控制自身免疫反應(yīng)的發(fā)展起關(guān)鍵作用。Th17細(xì)胞屬于CD4＋T輔助細(xì)胞亞群，其所分泌的IL－17是一種重要的促炎因子，與多種細(xì)胞因子產(chǎn)生協(xié)同作用以放大炎癥反應(yīng)［5，6］。視黃酸相關(guān)孤兒受體 （retinoic acid－related orphan receptor，RORγt），是調(diào)控Th17細(xì)胞分化發(fā)育的特異性轉(zhuǎn)錄因子。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）是發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)免疫作用的T淋巴細(xì)胞亞群，表達(dá)具有特異性調(diào)節(jié)作用的叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子（foxhead box protein 3，F(xiàn)oxp3），活化后主要分泌IL－10和轉(zhuǎn)化生長因子β（Transforming growth factor－β，TGF－β），抑制免疫細(xì)胞活化，從而抑制自身免疫反應(yīng)［7，8］。有研究報道，Treg細(xì)胞數(shù)量減少、Th17／Treg細(xì)胞失衡與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無力等多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［9，10］，但在自身免疫性心肌炎中Th17／Treg細(xì)胞分化的規(guī)律及其作用尚未清楚。本文通過實驗性自身免疫性心肌炎（Experimental Autoimmune Myocarditis，EAM）小鼠模型，研究EAM小鼠心肌組織中Th17及Treg細(xì)胞相關(guān)的RORγt、Foxp3、IL－17和TGF－βm RNA表達(dá)水平，以及血清IL－17和TGF－β的變化，分析Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞相關(guān)因子在EAM小鼠心肌組織中的變化規(guī)律，為尋找自身免疫性心肌炎的免疫治療方法提供新的思路和實驗依據(jù)。

材料和方法

1.實驗動物

36只11－12周雄性健康SPF級Balb／C小鼠（許可證號：SCXK（滬）2012－0002），體質(zhì)量18－22 g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供。飼養(yǎng)條件：室溫20－25℃；空氣流通，相對濕度40%－70%；動物自由攝食和飲水。

2.方法

2.1 EAM模型建立

參考Toyozaki等［11］的方法，將實驗動物隨機分為EAM組與正常對照兩大組。EAM組小鼠18只：第0 d和第7 d，于小鼠左右側(cè)腹股溝、腋下等部位多點皮下注射心肌肌球蛋白（Sigma公司）和弗氏完全佐劑混合乳0.2 ml（含心肌肌球蛋白0.1 mg）；正常對照組18只：同劑量PBS代替心肌肌球蛋白。初次免疫后于7、21、56 d實驗組和對照組隨機抽取6只小鼠，眼眶采血后處死小鼠迅速取出心臟HE染色和PCR檢測。

2.2 HE染色

組織切片常規(guī)脫蠟至水化，將脫蠟干凈的切片浸入蘇木素液5 min；自來水沖洗后，1%鹽酸酒精分化15 s，自來水沖洗至細(xì)胞核藍(lán)色，結(jié)締組織無色；入蒸餾水5 min；甩干水分，浸入1%酒精伊紅染色液染色3 min；浸入70%酒精快速清洗，之后梯度乙醇浸洗脫水，再經(jīng)過二甲苯使切片透明，將染色完成的切片從二甲苯中取出，滴上中性樹膠，蓋上蓋玻片，鏡檢。

2.3 RT－PCR 檢 測 IL－17、RORγt、Foxp3 和TGF－βm RNA 表達(dá)

利用Trizol一步法提取心臟組織總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以2μl cDNA為模板，應(yīng)用上下游引物行PCR擴增。95℃預(yù)變性5 min；執(zhí)行35個循環(huán)：94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸60 s，最后72℃總延伸10 min。取5μl擴增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，染色，在紫外線投射儀下觀察電泳條帶，目的基因mRNA表達(dá)量＝目的基因DNA條帶／β－actin DNA條帶灰度值。引物序列詳見表1。

表1 RT－PCR引物序列Table 1

2.4 ELISA 檢測IL－17和 TGF－β

眼眶取血滴于1.5 ml EP管中，室溫靜置30 min，3000 r／min離心15 min，取上層血清。按照IL－17和TGF－β的ELISA試劑盒（R＆D公司）說明書進(jìn)行檢測。

3.統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)以均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析。各組之間的均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Student－Newman－Keuls檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.各組心肌組織病理學(xué)變化

正常對照組小鼠心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞間隙正常（圖A），EAM組小鼠出現(xiàn)不同程度的病理改變，7 d組小鼠心肌細(xì)胞腫脹，相鄰細(xì)胞間隙增大，排列紊亂（圖B），21 d組心外膜下及心肌間質(zhì)有大量炎癥細(xì)胞浸潤，肌纖維排列紊亂，核大深染、異型（圖C），56 d組炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，部分心肌細(xì)胞斷裂，纖維增生 （圖D）。以上病理學(xué)變化表明EAM模型建立成功。

圖1 心肌組織病理變化（HE染色×200）A：對照組，B：EAM 7 d組，C：EAM 21 d組，D：EAM 56 d組 （HE×200）Fig.1 The pathology changes of the myocardial tissue in each group（HE×200）A：Normal group；B：Experimental group 7 d；C：Experimental group 21 d；D：Experimental group 56 d.

2.各 組 心 肌 組 織 IL－17、RORγt、Foxp3 和TGF－βm RNA的表達(dá)水平

EAM 21 d組心肌組織IL－17、RORγt、Foxp3、TGF－βm RNA的表達(dá)水平明顯高于正常對照組（P＜0.01）；EAM 7 d組、56 d組表達(dá)量與正常對照組的差異無顯著性意義（P＞0.05），但低于EAM 21 d組 （P＜0.05）；對照組各時點之間比較無差異（P＞0.05）（圖2）。

圖2 各組心肌組織IL－17、RORγt、Foxp3和TGF－βmRNA的表達(dá)水平a P＜0.01 vs對照組；b P＜0.05 vs EAM 7 d組和56 d組Fig.2 the expression of the mRNA of IL－17，RORγt，F(xiàn)oxp3and TGF－βin cardial tissue of each group tested by RT－PCRa P＜0.01 compared with normal group；b P＜0.05compared with EAM group 7 d and 56 d

3.各組血清IL－17和TGF－β濃度變化

圖3顯示，EAM 21 d組外周血IL－17水平明顯高于正常對照組（P＜0.01），也高于EAM 7 d組和56 d組 （P＜0.05），EAM 21 d和56 d組血清TGF－β水平較正常對照組升高 （P＜0.05），EAM 7 d組血清IL－17和TGF－β水平與正常對照組比較無顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 ELISA法檢測小鼠血清中IL－17、TGF－β含量變化a P＜0.05 vs對照組；c P＜0.05 vs EAM 7 d組和56 d組；e P＜0.05 vsEAM 7 d組Fig.3 The level of IL－17 and TGF－βin mice peripheral blood serum tested by ELISAa P＜0.05 compared with normal group 21 d；c P＜0.05 compared with EAM group 7 d and 56 d；e P＜0.05 compared with EAM group 7 d

4.心肌組織RORγt／Foxp3 mRNA相對表達(dá)量

EAM 21 d組與56 d組RORγt／Foxp3 m RNA比值較正常對照組明顯升高（P＜0.05）（圖4）。

圖4 各組小鼠RORγt／Foxp3 mRNA相對表達(dá)量＊P＜0.05 vs對照組和EAM 7 d組Fig.4 Expression of RORγt／Foxp3 m RNA in myocardial tissue of each group＊P＜0.05 compared with normal group and EAM group 7 d

討 論

心肌炎是心肌自身的炎癥病變，急性期多見于病毒感染等因素侵犯心肌引起直接損傷，后期可繼發(fā)針對心肌肌球蛋白的免疫應(yīng)答，造成進(jìn)一步心肌損傷。其病理過程與實驗性自身免疫性心肌炎發(fā)生機制和結(jié)局有較多的共性，與多種T細(xì)胞異?；罨閷?dǎo)的自身免疫反應(yīng)有關(guān)，其中促炎性Th17細(xì)胞與抑制性Treg細(xì)胞之間平衡狀態(tài)的打破與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)［12－13］，是自身免疫性疾病持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。

本文發(fā)現(xiàn)，在EAM組心肌組織炎癥初期，IL－17 mRNA表達(dá)量升高，21 d組達(dá)到高峰水平。同時外周血中IL－17含量與心肌組織RORγt mRNA呈現(xiàn)類似變化。RORγt是控制Th17細(xì)胞活化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子［14］，其在EAM炎癥過程中的高表達(dá)，促進(jìn)初始CD4＋T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞，分泌IL－17。IL－17作為重要的炎癥介質(zhì)，通過強大的招募中性粒細(xì)胞及激活其他免疫細(xì)胞，促進(jìn)多種細(xì)胞釋放下游炎性因子［5，6］，導(dǎo)致心肌炎癥損傷甚至壞死。Alunno［15］認(rèn)為，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中Th17細(xì)胞發(fā)揮了主要的致炎作用，而Treg細(xì)胞功能下降，導(dǎo)致自身免疫性疾病進(jìn)入慢性階段。說明Th17細(xì)胞功能亢進(jìn)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病等的發(fā)生與發(fā)展。

Treg細(xì)胞是一群具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群，通過分泌TGF－β和IL－10兩類抑制性細(xì)胞因子，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞和部分效應(yīng)性T細(xì)胞活化和增殖，減輕炎癥反應(yīng)。Foxp3為Treg細(xì)胞發(fā)育過程中的核心轉(zhuǎn)錄因子［7］，可調(diào)控初始T細(xì)胞向Treg轉(zhuǎn)化。Zhang等［8］發(fā)現(xiàn)注射Treg細(xì)胞明顯減輕病毒性心肌炎急性期的炎癥反應(yīng)，起到保護(hù)心肌組織，改善心臟功能的作用。本文結(jié)果顯示EAM 21 d組心肌組織TGF－β和Foxp3 mRNA表達(dá)水平明顯高于對照組，血清TGF－β含量也顯著升高。TGF－β具有多重功能，在不同情況下可表現(xiàn)抗炎與促炎的不同作用。在高濃度的TGF－β與IL－6共同誘導(dǎo)作用下，初始CD4＋T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞，而TGF－β單獨作用可誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化。因此推測EAM 21 d組TGF－β升高對Th17細(xì)胞分化產(chǎn)生促進(jìn)作用，使得心肌炎癥反應(yīng)在同一時期達(dá)到高峰。EAM 56 d組Treg細(xì)胞表達(dá)降低，發(fā)揮免疫抑制作用的細(xì)胞數(shù)減少，不能有效控制自身反應(yīng)性T細(xì)胞激活，導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)的持續(xù)存在。提示在心肌炎癥階段存在Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞及其相關(guān)因子失衡狀態(tài)。抑制Th17分化或增強Treg功能，調(diào)節(jié)Th17／Treg細(xì)胞動態(tài)平衡將有助于減輕心肌組織炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)實驗性自身免疫性心肌炎與Th17相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子的高表達(dá)密切相關(guān)，研究Th17／Treg細(xì)胞分化在自身免疫性心肌炎發(fā)生發(fā)展的作用，有助于進(jìn)一步闡明自身免疫性心肌炎的發(fā)病機制，為尋找有效的心肌炎免疫治療方法提供新思路。

［1］Schultheiss HP，Kuhl U，Cooper LT.The management of myocarditis.Eur Heart J，2011，32（21）：2616－2625

［2］Nindl V，Maier R，Ratering D，et al.Cooperation of Th1 and Th17 cells determines transition from autoimmune myocarditis to dilated cardiomyopathy.Eur J Immunol，2012，42（9）：2311－2321

［3］陳敏，吳卉卉，沈曉麗等.基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制因子與擴張型心肌病的關(guān)系.中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2011，20（1）：27－32

［4］Ueda H，Howson JM，Esposito L et al.Association of the T cell regulatory gene CTLA－4 with susceptibility to autoimmune disease.Nature，2003，423（9）：506－511

［5］Huang G，Wang Y，Chi H.Regulation of TH17 cell differentiation by innate immune signals.Cell Mol Immunol，2012，9（4）：287－295

［6］Song X，Qian y.IL－17 family cytokines mediated signaling in the pathogenesis of inflammatory diseases.Cell signal，2013，25（12）：2335－2347

［7］Ohkura N，Kitagawa Y，Sakaguchi S.Development and maintenance of regulatory T cells.Immunity，2013，38（3）：414－423

［8］Zhang Y，Jiang L，Zhang M，et al.Galectin－9 Induced Myeloid Suppressor Cells Expand Regulatory T Cells in an IL－10－Dependent Manner in CVB3－Induced Acute Myocarditis.Int J Mol Sci，2014，15（3）：3356－3372

［9］Geremia A，Biancheri P，Allan P，et al.Innate and adaptive immunity in inflammatory bowel disease.Autoimmun Rev，2014，13（1）：3－10

［10］Xiao J，Liu C，Li G，et al.PDCD5 negatively regulates autoimmunity by upregulating FOXP3＋regulatory T cells and suppressing Th17 and Th1 responses.J Autoimmun，2013，47：34－44

［11］Toyozaki T，Saito T，Shiraishi H，et al.Macrophage inflammatory protein－1alpha relates to the recruitment of inflammatory cells in myosin－induced autoimmune myocarditis in rats.Laboratory investigation；a journal of technical methods and pathology，2001，81（7）：929－936

［12］Yin H，Li X，Zhang B，et al.Sirolimus ameliorates inflammatory responses by switching the regulatory T／T helper type 17 profile in murine colitis.Immunology，2013，139（4）：494－502

［13］Geremia A，Jewell DP.The IL－23／IL－17 pathway in inflammatory bowel disease.Expert Rev Gastroenterol Hepatol，2012，6（2）：223－237

［14］Chen Z，Lin F，Gao Y，et al.FOXP3 and RORγt：transcriptional regulation of Treg and Th17.Int Immunopharmacol，2011，11（5）：536－542

［15］Aluno A，Bartoloni E，Bistoni O，et al.Balance between regulatory T and Th17 cells in systemic lupus erythematosus：the old and the new.Clin Dev Immunol，2012：823085.