白塞病患者及正常人外周血免疫細(xì)胞群的比較研究

樊 超 陳宏翔

（1深圳市福永人民醫(yī)院皮膚科，廣東518103；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院皮膚科，武漢430022）

白塞?。˙ehcet’s disease，BD）又稱貝赫切特綜合征（Behcet’s syndrome），是一種病因未明的自身免疫性疾病，缺乏特異性的實(shí)驗(yàn)室診斷指標(biāo)和特殊的病理組織學(xué)改變，造成臨床上對(duì)該病診斷困難，部分病例甚至長(zhǎng)期誤診。目前，BD的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但越來越多的研究表明，免疫因素在BD發(fā)病中起重要作用。本研究對(duì)22例BD患者及正常人外周血免疫細(xì)胞群進(jìn)行了比較研究。

材料和方法

1.研究對(duì)象

2011年3月至2011年12月期間我院皮膚科門診BD患者22例（12例女性，10例男性），所有BD患者均符合日本白塞病研究委員會(huì)1987年修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］。BD穩(wěn)定期（stable BD，SBD）患者8例，為前22例患者中經(jīng)治愈并已停藥3個(gè)月的病例。正常人（normal control，N）22例，均來自年齡和性別匹配的健康體檢者。

采集BD患者外周血標(biāo)本時(shí)，有14例未接受任何治療，4例僅接受中成藥復(fù)方丹參針劑注射，還有4例接受復(fù)方丹參針劑注射和秋水仙堿治療。8例接受治療的患者在標(biāo)本采集之前24小時(shí)均未進(jìn)行任何治療。

2.實(shí)驗(yàn)材料

2.1 儀器

FACSCalibur流式細(xì)胞儀（BD Biosciences，San Diego，CA）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（購自美國(guó)Forma公司）；離心機(jī)（購自美國(guó)Sigma公司）。

2.2 試劑

抗人 CD4－FITC抗體 （eBioscience，Cat.NO.11－0048），抗人 CD8－PE（eBioscience，Cat.NO.12－0087）；抗人 CD28－APC抗體 （eBioscience，Cat.NO.17－0289）。

3.方法

3.1 紅細(xì)胞裂解液

NH4CL 4.16 g，KHCO30.5 g，EDTA.2Na 0.02 g，溶于100 ml水中，調(diào)p H至7.2，補(bǔ)充水至500 ml，4℃貯存，使用時(shí)需恢復(fù)至室溫。3.2流式細(xì)胞術(shù)（flowcytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)細(xì)胞表面分子

以無菌方式采集BD患者（n＝22）及正常人（n＝22）外周血5 m1，經(jīng)肝素抗凝。37℃保存，立即送檢。ICOS及其他免疫分子在外周血T細(xì)胞亞群上的表達(dá)水平采用FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。首先，取100μl全血與適當(dāng)體積的相應(yīng)抗體及同型對(duì)照抗體在室溫避光孵育30 min，加入2 ml流式細(xì)胞儀專用紅細(xì)胞裂解液室溫避光孵育10 min，加入5 ml PBS以1000 r／min離心10 min，棄上清，同法洗滌3次后，立即進(jìn)行三色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)與分析。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果以（Mean±SED）表示。外周血T細(xì)胞亞群及其CD28共表達(dá)水平在BD活動(dòng)期患者及正常健康對(duì)照組之間的比較采用非參數(shù)Kruskal－Wallis U rank sum test進(jìn)行分析。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

結(jié) 果

BD患者及正常人外周血免疫細(xì)胞群的比較：為研究BD患者體內(nèi)細(xì)胞免疫水平，我們首先采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了活動(dòng)期BD患者外周血免疫細(xì)胞群的比例變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：患者體內(nèi)CD4＋T細(xì)胞比例與正常人相比并無明顯變化，而CD8＋T細(xì)胞的比例卻顯著升高（P＜0.05），導(dǎo)致CD4＋／CD8＋的比例明顯下降（P＜0.05）。此外，BD患者外周血CD28細(xì)胞比例與正常人相比無明顯變化（表1）；而SBD與ABD患者之間CD4＋／CD8＋比值無明顯變化（見表2）；進(jìn)一步分析CD4＋和CD8＋T細(xì)胞上CD28＋ 的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)BD患者CD4＋T細(xì)胞及CD8＋T細(xì)胞上CD28＋表達(dá)水平較正常人明顯降低（P＜0.05）（表3）。以上結(jié)果支持BD患者體內(nèi)存在免疫細(xì)胞群比例的紊亂，值得進(jìn)一步研究免疫功能缺陷與疾病的關(guān)系。

表1 BD患者與正常人外周血免疫細(xì)胞群比例的比較Table 1 Percentages（%）of peripheral blood cell subsets in patients of BD and normal individuals

表2 SBD患者與ABD患者外周血免疫細(xì)胞群比例的比較Table 2 Percentages（%）of peripheral blood cell subsets in patients of SBD and ABD individuals

表3 BD患者及正常人外周血CD4＋T細(xì)胞及CD8＋T細(xì)胞表面CD28的陽性表達(dá)率Table 3 Percentages of CD28 on peripheral blood CD4 and CD8 T cells in patients of BD and normal individuals

圖1 正常人及BD患者外周血CD4及CD8T細(xì)胞上CD28表達(dá)水平的代表圖Fig.1 The expression level of CD28 with CD4T cells and CD8T cells in The normal persons and Behect＇s disease

討 論

BD是一種累及皮膚粘膜、眼、滑膜、血管、腸道、肺和神經(jīng)系統(tǒng)等多系統(tǒng)的血管炎性疾患。目前BD的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但是越來越多的研究顯示，免疫因素在疾病發(fā)病中起重要作用。盡管在白塞病外周血中細(xì)胞活動(dòng)是增加的，但有報(bào)道在兒童中的新生兒白塞病病例其受累婦女也提示體液因素的作用。不同的細(xì)胞因子和淋巴細(xì)胞的總數(shù)增高促使Th1型和Th2型淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答失調(diào)，在我們以往的實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)［2］。正如T淋巴細(xì)胞對(duì)濾過性毒菌或細(xì)菌性病原體對(duì)抗原的特殊應(yīng)答，由于其向感染區(qū)域浸潤(rùn)而傾向Th1型淋巴細(xì)胞應(yīng)答。

最近發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞亞型的畸變可激活CD8、CD29、CD56和CD69標(biāo)記的高表達(dá)。在白塞病患者中CD8＋CD16＋和CD8＋CD56＋的T淋巴細(xì)胞亞類雖處于正常水平，但CD4＋CD16＋、CD4＋CD56＋、CD8＋αβ＋和CD8＋CD11b＋卻顯著增高，提示白塞病的T淋巴細(xì)胞激活與其它類型的炎癥紊亂相類似。而且T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)到眼前房則進(jìn)一步說明T細(xì)胞在眼白塞病的發(fā)病機(jī)制中起主要作用。而且最近的臨床試驗(yàn)表明用人化的抗CD52單克隆抗體、CAMPATH－1 H（一種抗腫瘤藥），采用淋巴細(xì)胞減少型療法，再次表明T淋巴細(xì)胞的自體反應(yīng)在白塞病發(fā)病過程中的重要作用。

一些研究顯示CD8＋T淋巴細(xì)胞總數(shù)在血清中的濃度（外周血液中）都是上升的［3－6］，循環(huán) CD4＋／CD8＋的比率下降。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)BD患者CD4＋／CD8＋的比率與正常人相比明顯下降，證實(shí)了上述觀點(diǎn)。隨著對(duì)BD研究的深入和檢測(cè)方法的改進(jìn)，人們發(fā)現(xiàn)BD的免疫紊亂與疾病的臨床表現(xiàn)、嚴(yán)重程度以及檢測(cè)所用的方法密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)有關(guān)BD的免疫學(xué)方面研究進(jìn)行初步探討。在實(shí)驗(yàn)中我們通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了BD患者外周血T細(xì)胞亞群，包括CD4＋和CD8＋T細(xì)胞及CD28＋細(xì)胞，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BD患者體內(nèi)存在較嚴(yán)重的免疫功能紊亂，主要表現(xiàn)在CD8＋T細(xì)胞比例上調(diào)導(dǎo)致CD4＋／CD8＋比值相對(duì)于正常人顯著降低（表1），而SBD與 ABD患者之間CD4＋／CD8＋比值無明顯變化（見表2）。說明BD患者體內(nèi)T細(xì)胞處于過度活化狀態(tài)，且免疫效應(yīng)細(xì)胞的比例也大大增加，打破了體內(nèi)疫平衡狀態(tài) 。結(jié)果支持BD患者體內(nèi)存在免疫細(xì)胞群比例的紊亂，值得進(jìn)一步研究免疫功能缺陷與疾病的關(guān)系。

進(jìn)一步分析CD4＋和CD8＋T細(xì)胞上CD28的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)BD患者CD4＋T細(xì)胞及CD8＋T細(xì)胞上CD28表達(dá)水平較正常人明顯降低（P＜0.05）（表3）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BD患者體內(nèi)存在免疫細(xì)胞群的紊亂，為臨床診斷白塞病提供了相應(yīng)的理論依據(jù)。

［1］Revised Japanese criteria for Behcet’s disease.Behcet’s Disease reseach committee of Japan 1987 congress news of the 6th SEAPAL congress of rheumatology 1988.

［2］樊超，鄭勁鋒，陳宏翔.人外周血Th細(xì)胞和Tc細(xì)胞內(nèi)IFN－γ及IL－4表達(dá)水平與白塞病的關(guān)系.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2011，20（1）：23－26

［3］Spalton DJ：Intraocular inflammation.in Spalton DJ，Hitchings RA，Hunter PA（eds）：Atlas of clinical ophthalmology.London，Mosby，1994，pp 1－32

［4］Hamzaoui K，Hamzaoui A，Guemira F，et al：Cytokine profile in Behcet’s disease patients.Relationship with disease activity.Scand J Rheumatol，2002，31：205－210

［5］Houman H，Hamzaoui A，Ben Ghorbal I，et al：Tc1／Tc2 ratio in the inflammatory process in patients with Behcet’s disease.Mediators Inflamm，2004，13：247－253

［6］Raziuddin S，al－Dalaan A，Bahabri S，et al：Divergent cytokine production profile in Behcet’s disease.Altered Th1／Th2 cell cytokine pattern.J Rheumatol，1998，25：329－333