中國解剖學(xué)會第十四屆全國組織學(xué)與胚胎學(xué)青年學(xué)術(shù)研討會暨第十一屆組織學(xué)與胚胎學(xué)教學(xué)與科研技術(shù)研討會論文匯編

2015年7月25日—27日

山東 濰坊

1.蘿卜硫素對糖尿病視網(wǎng)膜病變的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制研究 任翔 劉俊麗 張成鴻 孔力 大連醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室大連116044 糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）是一種由高血糖引起氧化應(yīng)激所致的神經(jīng)退行性病變。硫氧還蛋白（Trx）通過其二硫化物還原酶與過氧化物還原酶活性，在體內(nèi)各系統(tǒng)中行使多種氧化還原功能。蘿卜硫素（SF）是西蘭花等十字花科蔬菜中的提取物，前期研究發(fā)現(xiàn)它可通過上調(diào)Trx水平對Tubby基因變異小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞退變起到保護(hù)作用。我們在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討了SF對DR視網(wǎng)膜細(xì)胞退行性變性的保護(hù)作用及相關(guān)作用機(jī)制，以期為臨床治療DR提供關(guān)鍵靶點(diǎn)和新的理論依據(jù)。研究利用Balb／c小鼠和Neuro 2A細(xì)胞分別進(jìn)行。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分為正常組和高脂高糖飼料＋STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病組；體外實(shí)驗(yàn)分為正常組和高糖處理組。采用HE染色進(jìn)行視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)觀察和外核層計(jì)數(shù)，同時(shí)進(jìn)行視網(wǎng)膜凝集素標(biāo)記血管形態(tài)。流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測；Real time PCR和Western blot對相關(guān)基因和蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，糖尿病視網(wǎng)膜病變早期是一種以感光細(xì)胞丟失為重要特征的退行性病變，SF可通過上調(diào)Trx的表達(dá)，抑制其下游ASK1／p38／Txnip凋亡信號通路的激活，從而減少視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的損傷，延遲DR的發(fā)生。

2.蘿卜硫素介導(dǎo)Trx上調(diào)對2型糖尿病小鼠耳蝸毛細(xì)胞的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制 扶玉珍1劉俊麗1劉渤1孔慧2孔力1大連醫(yī)科大學(xué)：1組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室；2第二附屬醫(yī)院耳鼻喉科 大連116044 長期高血糖所致的氧化應(yīng)激是糖尿病性耳聾發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。研究證實(shí)蘿卜硫素（SF）能上調(diào)Tub小鼠耳蝸組織中硫氧還蛋白（Trx）的表達(dá)從而延遲耳蝸毛細(xì)胞的退行性變。本實(shí)驗(yàn)以高脂高糖飼料喂養(yǎng)及1%鏈脲估菌素（STZ）腹腔注射復(fù)制2型糖尿病小鼠模型。通過SF及Trx抑制劑（PX－12）的聯(lián)合作用，探討SF對糖尿病小鼠耳蝸毛細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制。首先，將Balb／c小鼠分為正常組（Control）及2型糖尿?。═2DM）組，繼之以不同劑量SF（0.5mg／kg，1mg／kg，2mg／kg）及同一劑量的SF不同給藥時(shí)間（5d，10d，15d）分別處理T2DM組，分析各組小鼠耳蝸毛細(xì)胞的缺失與耳蝸組織中Trx表達(dá)水平的相關(guān)性，以確定SF的最佳用藥劑量和最適用藥時(shí)間。最后用SF和PX－12對Control組和T2DM兩組進(jìn)行平行處理，重新分為對照組、治療組（SF）、和實(shí)驗(yàn)組（SF＋PX－12）。通過琥珀酸脫氫酶（SDH）染色進(jìn)行耳蝸毛細(xì)胞計(jì)數(shù)及HE染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析；免疫熒光組織化學(xué)檢測耳蝸組織中Trx及ASK1的表達(dá)；實(shí)時(shí)定量PCR檢測耳蝸組織中Trx及Txnip的的基因表達(dá)水平；Western blot方法檢測Trx、p－Erk、Nrf2、Ask1的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與正常組比較各T2DM組小鼠耳蝸毛細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著減少，Trx、p－Erk、Nrf2的蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)；Txnip基因、ASK1蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)。單純給與SF處理T2DM組與T2DM對照組比較時(shí)毛細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著增加，Trx、p－Erk、Nrf2的蛋白表達(dá)水平上調(diào)，Txnip基因、ASK1蛋白表達(dá)水平下調(diào)；而SF＋PX12聯(lián)合處理組與單純給與SF的T2DM組比較時(shí)，毛細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯減少，Trx、p－Erk、Nrf2的蛋白表達(dá)水平呈下調(diào)趨勢，Txnip基因表達(dá)水平、ASK1蛋白表達(dá)水平呈上調(diào)趨勢。以上結(jié)果提示蘿卜硫素可通過作用于p－Erk／Nrf2抗氧化信號通路介導(dǎo)糖尿病小鼠耳蝸組織中Trx的表達(dá)上調(diào)，從而抑制ASK1／p－Jnk／p38MAPK凋亡通路的激活，對高糖引起的耳蝸毛細(xì)胞退行性變起保護(hù)作用。

3.蘿卜硫素對2型糖尿病小鼠腎臟的保護(hù)作用及機(jī)制 劉俊麗 張恩鵬 孔力 大連醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 大連116044 糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥，也是引起終末期糖尿病腎病（end stage renal disease，ESRD）的主要原因。糖尿病時(shí)的高糖環(huán)境會引起體內(nèi)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的增加，并通過還原性輔酶Ⅱ等途徑引起足細(xì)胞凋亡、脫失，進(jìn)而引起DN的發(fā)生和發(fā)展。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，高糖時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞硫氧還蛋白（Trx）表達(dá)下調(diào)；糖尿病小鼠視網(wǎng)膜Trx表達(dá)呈下調(diào)趨勢。為探討DN的發(fā)病及保護(hù)機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)以高脂高糖飼料和鏈脲佐菌素（STZ）聯(lián)合誘導(dǎo)的2型糖尿病小鼠模型（T2DM）為研究對象，通過對DN小鼠腎小球及足細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察和Trx及Nrf2表達(dá)的檢測，研究蘿卜硫素SF對DN的保護(hù)作用及機(jī)制。將雄性Balb／c小鼠隨機(jī)分為正常對照組、SF預(yù)防組、T2DM組和SF治療組。石蠟切片HE染色結(jié)果表明，T2DM組腎小球增大，足細(xì)胞肥大且密度和數(shù)量減少；而治療組腎小球與正常對照組相比，足細(xì)胞密度和數(shù)量雖有減少，但其大小均勻，在形態(tài)上較為相近。實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot檢測Trx和Nrf2的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯示，與正常對照組相比，T2DM組腎臟Trx和Nrf2表達(dá)呈下調(diào)趨勢；而SF預(yù)防組則相對上調(diào)；與T2DM組相比，SF治療組腎臟Trx和Nrf2表達(dá)明顯上調(diào)，但未達(dá)到正常對照組表達(dá)水平。綜上表明，SF能上調(diào)氧化還原系統(tǒng)中Trx表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)Nrf2的表達(dá)，減少ROS的生成，從而延緩或減少腎小球及足細(xì)胞的損傷，最終對DN起到保護(hù)作用。

4.下調(diào)硫氧還蛋白表達(dá)對AGEs誘導(dǎo)Neuro2A細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制 任翔 盧鶴媛 劉渤 孔力大連醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 大連116044 神經(jīng)退行性疾病是一類慢性、進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病。其共同的特征是神經(jīng)元的退行性變性和凋亡。研究發(fā)現(xiàn)在多種神經(jīng)退行性疾病中均有糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）的積累。硫氧還蛋白（Trx）作為一種功能性蛋白不僅能夠有效的清除機(jī)體內(nèi)的活性氧族（ROS），還參與細(xì)胞的眾多生理過程。為探討Trx對AGEs誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)中采用Trx抑制劑PX12，研究Trx對AGEs誘導(dǎo)Neuro2A細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)機(jī)理。研究中設(shè)置AGEs處理組、PX12處理組、PX12預(yù)處理AGEs組以及對照組；采用CCK8法檢測細(xì)胞活性，DNA－Ladder、線粒體膜電位測定、流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測細(xì)胞凋亡，DCFH－DA法檢測ROS活性及分光光度計(jì)法檢測Caspase3酶活性，Real time－PCR檢測硫氧還蛋白相互作用蛋白（Txnip）的表達(dá)，Western blot檢測凋亡相關(guān)信號通路蛋白的表達(dá)。檢測結(jié)果顯示，Trx表達(dá)受到抑制后，AGEs誘發(fā)的Neuro2A細(xì)胞凋亡更為明顯，ROS活性和Caspase3活性明顯上升，Txnip表達(dá)亦明顯上升，ASK1、p－JNK、PTEN明顯升高，而p－AKT表達(dá)明顯降低。上述結(jié)果提示，AGEs能上調(diào)Txnip表達(dá)、增加ROS及Caspase3活性，誘導(dǎo)Neuro2A細(xì)胞凋亡；Trx能有效抑制AGEs誘導(dǎo)Neuro2A細(xì)胞發(fā)生凋亡；其作用機(jī)制與Trx－ASK1－JNK和Trx－PTEN－AKT信號通路相關(guān)。

5.干擾Txnip表達(dá)對AGEs誘導(dǎo)Neuro2A細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制 邱媛媛任翔馬海英孔力 大連醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 大連116044 糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）在體內(nèi)的不斷積累是導(dǎo)致糖尿病及其并發(fā)癥的重要因素，AGEs與其受體RAGE參與調(diào)節(jié)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成，破壞體內(nèi)氧化還原平衡導(dǎo)致氧化應(yīng)激（Oxidation Stress，OS），最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，AGEs誘導(dǎo)Neuro 2A細(xì)胞凋亡與AGEs作用下Txnip的過量表達(dá)呈正相關(guān)。本文選擇采用RNA干擾技術(shù)設(shè)計(jì)針對Txnip的干擾序列，構(gòu)建成sh RNA－Txnip，以研究Txnip對AGEs誘導(dǎo)Neuro2A細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究。結(jié)果顯示：①構(gòu)建sh RNA－Txnip質(zhì)粒抑制Txnip的基因表達(dá)效果顯著。②經(jīng)AGEs處理后（AGEs＋），Real timePCR檢測Txnip基因的表達(dá)與未處理組比較顯著增加，p38MAPK抑制劑SB203580處理和轉(zhuǎn)染sh Txnip干擾質(zhì)粒后均能抑制AGEs所致的Txnip表達(dá)水平的上調(diào)。③AGEs＋組Trx蛋白表達(dá)水平與AGEs組比較蛋白水平表達(dá)下調(diào)；經(jīng)SB203580預(yù)處理、轉(zhuǎn)染sh Txnip干擾質(zhì)粒預(yù)處理，均可抑制由AGEs所致的Trx的表達(dá)水平變化；采用Fluorescent Probe－DHE法檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成顯示，AGEs處理Neuro 2A－LacZ細(xì)胞3 h后，胞質(zhì)內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于未處理組，而轉(zhuǎn)染scramble、sh Txnip及sh Txnip和AGEs聯(lián)合處理的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生不明顯。④流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，p38抑制劑和轉(zhuǎn)染sh Txnip干擾質(zhì)粒能保護(hù)AGEs所致的細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果表明，Txnip是AGEs誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵，其機(jī)制與抑制ASK1的激活及ROS的產(chǎn)生有關(guān)，且受p38MAPK信號通路調(diào)節(jié)。

6.DIDS抑制氯離子通道ClC－2的表達(dá)減緩新生大鼠缺血缺氧性腦白質(zhì)損傷 趙柏雄1全弘宇1馬騰1田衍平2蔡其燕2李紅麗2第三軍醫(yī)大學(xué)：1學(xué)員旅四營；2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室和發(fā)育生物學(xué)教研室 重慶400038 缺血缺氧可引起新生兒腦白質(zhì)病變（WMLs），常導(dǎo)致兒童腦癱及認(rèn)知障礙。已有的研究提示2型氯離子通道（ClC2）的異常表達(dá)參與炎癥與細(xì)胞凋亡的發(fā)生，然而氯離子通道是否參與新生大鼠WMLs的發(fā)生，目前文獻(xiàn)報(bào)道尚少。本研究選擇新生4－5日齡SD大鼠，建立慢性腦缺血缺氧模型，在傷后不同時(shí)間給予Cl－通道阻斷劑DIDS處理。結(jié)果顯示，新生大鼠腦缺血缺氧損傷后白質(zhì)中ClC－2 m RNA和蛋白表達(dá)均較正常組顯著增高，且伴白質(zhì)組織中活性氧濃度顯著升高；iNOS、TNF－αmRNA的表達(dá)也大幅度增加。胼胝體等白質(zhì)區(qū)髓鞘染色較正常明顯淺淡；促凋亡蛋白Caspase－3與NG2陽性雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)目比例則明顯增多。在損傷早期應(yīng)用DIDS后，觀察到上述損傷均得到有效緩解。本研究證實(shí)新生大鼠腦缺血缺氧損傷后白質(zhì)區(qū)Cl－通道表達(dá)升高且與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)呈正相關(guān)，可導(dǎo)致由腦白質(zhì)中Caspase－3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡增多和髓鞘發(fā)育受阻。傷后早期應(yīng)用DIDS阻斷Cl－通道開放后可明顯降低Caspase－3介導(dǎo)的凋亡發(fā)生程度，提示早期使用DIDS可部分保護(hù)缺血缺氧損傷后的少突膠質(zhì)細(xì)胞。

7.Omega－3多不飽和脂肪酸對新生大鼠缺血缺氧性腦癱的治療作用 慈維昊 魏寰宇 王朔 季皓 汪云李成仁 第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部組織胚胎學(xué)教研室 重慶400038 腦癱是新生兒尤其是早產(chǎn)兒最常見最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，缺血缺氧（HI）是主要原因，而腦白質(zhì)是主要損傷部位，其中的晚期少突膠質(zhì)細(xì)胞前體（OPCs）是主要受損靶細(xì)胞。腦黃金DHA的主要成分（ω－3多不飽和脂肪酸）對胎兒及嬰兒的大腦特別腦白質(zhì)的生長發(fā)育極為重要。但ω－3對HI所致腦白質(zhì)損傷是否具有防治作用目前還不清楚。離體實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng) OPCs，制作缺糖缺氧（OGD）模型，設(shè)對照組和ω－3組，應(yīng)用LDH、CCK－8、Tunel染色、免疫熒光、Western blot和q－PCR等方法檢測細(xì)胞受損以及分化情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，ω－3組細(xì)胞受損明顯減輕，活性增高，凋亡細(xì)胞數(shù)目減少，而PDGFR－α、A2B5、NG2、CNPase、PLP和 MBP等少突膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)蛋白和mRNA的表達(dá)明顯增加。在體實(shí)驗(yàn)中，制備新生大鼠HI模型，設(shè)對照組和ω－3組，不同時(shí)相點(diǎn)取材，采用快藍(lán)、Fluomeylin染色、Tunel染色、免疫熒光、Western blot和q－PCR檢測腦白質(zhì)受損情況，結(jié)果顯示，與對照組相比，ω－3組的胼胝體區(qū)域髓鞘受損情況明顯減輕，細(xì)胞凋亡數(shù)目減少，PDGFR－α、A2B5、NG2、CNPase、PLP和MBP等少突膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)蛋白和m RNA的表達(dá)升高。動物成年后，應(yīng)用曠場實(shí)驗(yàn)和水迷宮檢測模型鼠成年后的運(yùn)動能力和學(xué)習(xí)記憶能力，結(jié)果顯示，與對照組相比，ω－3組動物的運(yùn)動能力和學(xué)習(xí)記憶能力明顯升高。本實(shí)驗(yàn)表明，ω－3可作為治療新生鼠腦HI后白質(zhì)損傷的藥物，從而為新生兒腦癱的防治提供新的方法和措施（本研究受重慶市自然科學(xué)基金cstc2013jcyj A10130資助）。

8.PIN1與突變亨廷頓蛋白毒性片段之間相互作用位點(diǎn)的分析 梁璇 彭挺 李和 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 武漢430030 亨廷頓病（Huntington＇s disease，HD）是一種常染色體顯性遺傳的神經(jīng)退行性疾病，由編碼亨廷頓蛋白的IT15基因突變所致。IT15第一外顯子中CAG重復(fù)數(shù)目異常增多，編碼產(chǎn)生擁有超長多聚谷氨酰胺片段的突變亨廷頓蛋白。突變亨廷頓蛋白會激活多種蛋白水解酶，這些蛋白水解酶將突變亨廷頓蛋白切割成不同長度的N末端片段，稱為突變亨廷頓蛋白毒性片段。這些毒性片段會在神經(jīng)元內(nèi)錯(cuò)誤折疊并致密聚集，產(chǎn)生細(xì)胞毒性。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，肽基脯氨酰順／反異構(gòu)酶PIN1能與突變亨廷頓蛋白毒性片段相互作用，抑制其錯(cuò)誤折疊并促進(jìn)其降解，進(jìn)而抑制其細(xì)胞毒性，然而二者間的具體結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合機(jī)制仍不明確。為了尋找PIN1與突變亨廷頓蛋白毒性片段之間的相互作用位點(diǎn)以及關(guān)鍵性氨基酸，我們分別構(gòu)建了PIN1、突變亨廷頓蛋白毒性片段不同結(jié)構(gòu)區(qū)域的缺失突變體和點(diǎn)突變體，利用免疫共沉淀以及熒光共定位分析的方法對二者之間的相互作用位點(diǎn)進(jìn)行了分析，明確了PIN1與突變亨廷頓蛋白毒性片段之間的相互作用位點(diǎn)、關(guān)鍵性氨基酸，以及可能存在的分子作用機(jī)制，將為深入了解突變亨廷頓蛋白異常聚集和HD的發(fā)病機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

9.高血糖對阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)老年斑沉積AGEs／RAGE／NF－κB信號通路的影響 王旭遼寧中醫(yī)藥大學(xué)組胚教研室 沈陽110847 本研究采用APP／PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ），誘導(dǎo)產(chǎn)生糖尿病合并阿爾茨海默病（Alzheimer＇s disease，AD）的轉(zhuǎn)基因小鼠動物模型；應(yīng)用便攜式血糖測定儀監(jiān)測小鼠血糖的變化；Morris水迷宮檢測AD小鼠的行為學(xué)變化；ELISA法對AD小鼠腦內(nèi)AGEs含量進(jìn)行定量分析；免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測AD小鼠腦組織老年斑的分布、小鼠腦內(nèi)AGEs和NF－κB的表達(dá)；Western blot技術(shù)檢測AD小鼠腦內(nèi)AGEs、RAGE和NF－κB、BACE1蛋白的表達(dá)。研究結(jié)果顯示，STZ誘導(dǎo)的高血糖使APP／PS1轉(zhuǎn)基因小鼠血糖升高、學(xué)習(xí)記憶能力和空間探索能力均顯著降低、腦內(nèi)老年斑塊增多、腦內(nèi)AGEs含量增多、腦組織RAGE和NF－κB蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，同時(shí)STZ誘導(dǎo)的高血糖使APP／PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)BACE1蛋白表達(dá)增強(qiáng)。結(jié)果表明，STZ誘導(dǎo)的高血糖可通過AGEs／RAGE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路使NF－κB蛋白活性增高，導(dǎo)致BACE1表達(dá)增強(qiáng)，從而加劇APP／PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)APP向Aβ生成途徑代謝增加，致使腦內(nèi)Aβ過度沉積、老年斑形成及認(rèn)知功能損傷，揭示了高血糖可通過AGEs／RAGE／NF－κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路加劇AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)老年斑沉積的分子生物學(xué)機(jī)制。本項(xiàng)目為揭示糖尿病加劇AD病理生理進(jìn)程的分子機(jī)制以及為AD提供切實(shí)的預(yù)防和治療措施奠定充分的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

10.姜黃素對阿爾茨海默病神經(jīng)元保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究 于嵩 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)組胚教研室 沈陽110847 本研究旨在探討姜黃素對阿爾茨海默病小鼠神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制，從而進(jìn)一步將姜黃素應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病治療的中提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。采用C57BL／6小鼠和雙轉(zhuǎn)染人APP695swe基因和人早老素1（presenilin，PS－1）突變基因的AD模型小鼠 （APP／PS1小鼠）為研究對象，分別給予口服姜黃素處理；采用PCR技術(shù)對APP／PS1轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行鑒定，應(yīng)用Morris水迷宮及跳臺實(shí)驗(yàn)檢測AD小鼠的記憶、學(xué)習(xí)能力變化及空間探索能力變化；免疫組織化學(xué)技術(shù)、Western blot技術(shù)檢測姜黃素對APP／PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦神經(jīng)元的保護(hù)作用。研究結(jié)果表明，AD雙轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠相比記憶、學(xué)習(xí)能力和空間探索能力明顯降低，具有時(shí)間相關(guān)性；6月齡小鼠大腦皮質(zhì)和海馬內(nèi)開始出現(xiàn)老年斑塊，隨著年齡老年斑塊數(shù)量持續(xù)增加；半定量檢測p－Tau蛋白含量明顯增多。而姜黃素喂養(yǎng)組小鼠的記憶、學(xué)習(xí)能力和空間探索能力明顯改善，但是沒有達(dá)到野生型小鼠水平；姜黃素喂養(yǎng)組小鼠大腦皮質(zhì)和海馬內(nèi)老年斑塊數(shù)量明顯少于同月齡AD組小鼠；同時(shí)姜黃素喂養(yǎng)組小鼠腦內(nèi)p－Tau蛋白含量也明顯少于AD組小鼠。結(jié)果提示，姜黃素口服給藥可以提高APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的記憶能力、學(xué)習(xí)能力和空間探索能力，減少AD小鼠腦內(nèi)老年斑的形成，同時(shí)也降低小鼠腦內(nèi)p－Tau蛋白的含量。因此，姜黃素可能通過抑制老年斑的形成和Tau蛋白的磷酸化對AD小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元起保護(hù)作用。

11.Tau蛋白入核及抗凋亡機(jī)制的研究 呂玲 盧佳靜 張瑜 沈建英 李宏蓮 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 武漢430030 阿爾茨海默癥（Alzheimer disease，AD）是一種神經(jīng)退行性疾病，其病理研究中tau蛋白的作用機(jī)制是研究的重點(diǎn)之一。研究證明，tau蛋白過表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮保護(hù)作用。tau蛋白作為一種微管相關(guān)蛋白，主要分布在胞質(zhì)，胞核內(nèi)也有存在。目前tau蛋白抗凋亡的作用機(jī)制及其入核機(jī)制都未明確。本研究在已有基礎(chǔ)上對其入核和抗凋亡作用及機(jī)制進(jìn)行探討。為探討tau蛋白是否含有疑似入核序列，將表達(dá)人類全長tau蛋白的eGFP－C1－tau441質(zhì)粒一分為二，構(gòu)建質(zhì)粒eGFP－C1－tau（1－220）和eGFP－C1－tau（221－441）。將該3種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞株（N2a）細(xì)胞，48h后終止培養(yǎng)，熒光顯微鏡觀察顯示，tau（1－220）在胞漿和胞核內(nèi)表達(dá)均勻，而另外兩種質(zhì)粒主要在胞漿表達(dá)，免疫印跡也證實(shí)了該結(jié)果，由此可見tau（1－220）更易入核。為探討不同tau序列的過表達(dá)對細(xì)胞凋亡的影響，對轉(zhuǎn)染eGFP－C1－vector、eGFP－C1－tau441和eGFP－C1－tau（1－220）質(zhì)粒的細(xì)胞用0.5μmol／L廣譜凋亡誘導(dǎo)劑staurosporine（STP）凋亡誘導(dǎo)3h后提全蛋白及核蛋白進(jìn)行免疫印跡，結(jié)果表明，與空載組比較，tau441和tau（1－220）組均具有顯著的抗凋亡作用，而且凋亡誘導(dǎo)后核蛋白內(nèi)tau蛋白的含量尤其是tau（1－220）組明顯升高。為進(jìn)一步研究入核的tau441或者tau（1－220）片段與核內(nèi) DNA的關(guān)系，將轉(zhuǎn)染eGFP－C1－tau441，eGFP－C1－tau（1－220）質(zhì)粒的細(xì)胞在凋亡誘導(dǎo)前3h先加入20μmol／L紡錘菌素（抑制蛋白與DNA小溝結(jié)合）培養(yǎng)，進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)（不撤除紡錘菌素）提全蛋白和核蛋白進(jìn)行免疫印跡，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染tau（1－220）加紡錘菌素組與不加組相比，抗凋亡能力降低。同時(shí)，核蛋白的免疫印跡也表明，加入紡錘菌素后，核內(nèi)tau蛋白量顯著減少。綜上所述，我們推測，tau（1－220）序列可能帶有引導(dǎo)tau蛋白入核的關(guān)鍵序列，tau蛋白的抗凋亡作用可能是入核的tau蛋白與DNA小溝結(jié)合來維持DNA穩(wěn)定，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，從而抑制凋亡。

12.MiR－181a及其靶基因caprin－1在ALS轉(zhuǎn)基因鼠腦干中作用的研究 接琳琳 管英俊 陳燕春 周風(fēng)華 杜紅梅 張皓云 劉永新 濰坊醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 濰坊261053 選取95d、108d和122d野生型鼠和SOD1－G93A突變的肌萎縮側(cè)索硬化（ALS）轉(zhuǎn)基因鼠，應(yīng)用原位雜交技術(shù)分別檢測腦干中動眼神經(jīng)核（3N），紅核（RMC），面神經(jīng)核（7N），舌下神經(jīng)核（12N）中的 miR－181a的表達(dá)變化，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測miR－181a靶基因caprin－1在腦干各核團(tuán)的表達(dá)變化。選取NSC34細(xì)胞系，以共轉(zhuǎn)p EGFP－G93A－SOD1和 RFP－miR－181－silencing對照質(zhì)粒作為對照組，共轉(zhuǎn)p EGFP－G93A－SOD1和 RFP－miR－181－silencing對照質(zhì)粒，分別于24h、48h和72h收集細(xì)胞，檢測caprin－1的表達(dá)變化以證實(shí)caprin－1是miR－181a的靶基因。原位雜交結(jié)果顯示，與野生型鼠比較，ALS轉(zhuǎn)基因鼠腦干中miR－181a在95d，108d和122d表達(dá)均升高。免疫熒光染色結(jié)果顯示Caprin－1與神經(jīng)元共表達(dá)，未檢測到與小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞共表達(dá)，與野生型鼠比較，腦干中Caprin－1陽性細(xì)胞數(shù)量在95d、108d和122d均減少。與轉(zhuǎn)染p EGFP－G93A－SOD1和RFP－miR－181－silencing對照質(zhì)粒組比較，轉(zhuǎn)染 p EGFP－G93A－SOD1和 RFP－miR－181－silencing對照質(zhì)粒組，在24h、48h和72h caprin－1 m RNA和蛋白表達(dá)均增多。結(jié)果表明，miR－181a及其靶基因caprin－1在腦干中的異常變化與ALS發(fā)病密切相關(guān)。

13.成年大鼠脛神經(jīng)損傷后神經(jīng)病理性疼痛相關(guān)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)發(fā)生位置研究 丁有權(quán) 肖霞 齊建國 四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心組織胚胎學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室 成都610041 周圍神經(jīng)損傷后外周免疫器官中抗原特異性的適應(yīng)性免疫應(yīng)答參與神經(jīng)病理性疼痛的慢性化，而這種適應(yīng)性免疫應(yīng)答發(fā)生的具體位置和相關(guān)的抗原來源并不清楚。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，右側(cè)腘窩淋巴結(jié)和腹股溝淋巴結(jié)聯(lián)合清掃對成年SD雄性大鼠右側(cè)脛神經(jīng)永久性橫斷手術(shù)后腓腸神經(jīng)和隱神經(jīng)皮膚區(qū)域的疼痛的慢性轉(zhuǎn)化沒有影響；腹腔淋巴結(jié)清掃或者脾臟切除均可顯著抑制成年SD雄性大鼠右側(cè)脛神經(jīng)永久性橫斷手術(shù)后腓腸神經(jīng)和隱神經(jīng)皮膚區(qū)域的疼痛的慢性轉(zhuǎn)化；腘窩和腹股溝淋巴結(jié)引流同側(cè)后肢的所有抗原，腹腔淋巴結(jié)引流腰段脊髓的抗原，而脾臟引流進(jìn)入血液循環(huán)的抗原。因此，腰段脊髓的抗原引流至腹腔淋巴結(jié)或者進(jìn)入血液循環(huán)引流至脾臟，發(fā)生神經(jīng)病理性疼痛特異性的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)將為后續(xù)研究神經(jīng)病理性疼痛特異性適應(yīng)性免疫反應(yīng)的位置和抗原的性質(zhì)研究奠定基礎(chǔ)，也為靶向性調(diào)控外周神經(jīng)炎癥治療神經(jīng)病理性疼痛提供理論基礎(chǔ)。

14.成年大鼠坐骨神經(jīng)擠壓傷后腓腸神經(jīng)再支配無毛區(qū)皮膚的疼痛行為學(xué)分析 任弘毅 丁有權(quán) 齊建國 四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心組織胚胎學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室 成都610041 目前認(rèn)為外周神經(jīng)損傷或者疾病后出現(xiàn)的神經(jīng)病理性疼痛由軸突永久性離斷而不再生的神經(jīng)元或者由損傷神經(jīng)元鄰近的未損傷神經(jīng)元所傳遞，而軸突離斷后再生至原皮膚區(qū)域的神經(jīng)元是否傳遞疼痛，目前仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，成年SD大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)坐骨切跡水平擠壓傷3周后，大鼠后爪掌面原腓腸神經(jīng)支配的無毛區(qū)皮膚區(qū)域出現(xiàn)明顯的機(jī)械性疼痛異常、機(jī)械性疼痛過敏、冷痛異常和熱痛過敏。其中明顯的機(jī)械性疼痛異常和熱痛過敏在疼痛測量期間（至術(shù)后8周）持續(xù)存在，而機(jī)械性疼痛過敏和冷痛異常僅持續(xù)至術(shù)后6周。另外，機(jī)械性疼痛過敏和熱痛過敏存在雌雄差異，同窩雄性個(gè)體的疼痛相比于對應(yīng)的雌性個(gè)體更為明顯。大鼠后爪掌面外側(cè)區(qū)皮膚免疫熒光顯示擠壓傷后3周該區(qū)域出現(xiàn)明顯的神經(jīng)纖維的再支配。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，成年大鼠坐骨神經(jīng)擠壓傷后腓腸神經(jīng)再支配無毛區(qū)皮膚出現(xiàn)了神經(jīng)病理性疼痛。本實(shí)驗(yàn)提示，軸突離斷后再生至原皮膚區(qū)域的神經(jīng)元傳遞疼痛，這將為外周神經(jīng)損傷后的臨床治療提供除神經(jīng)再生之外的新靶點(diǎn)。

15.Investigating the effects of IFN－λon the proliferation and differentiation of neural stem cells Zhang Jiaqi，Sun Wanbing，F(xiàn)u Liping，Qiu Yinghui，Xiao Jihan，Wang Shanshan，Zhou Lin.Department of Histology and Embryology，Tong Ji Medical School，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030 Our previous study showed that Interferon（IFN）－λand its receptor（IFNLR）were expressed in human neural stem cells（NSCs）－derived neurons and the expression level of IFN－λand its receptors were gradually increased with the differentiation of human NT2－N neurons.To better understand the effects of IFN－λon the proliferation and differentiation of the NSCs，we selected mice model which facilitates the NSCs supply.IFN－λand IFNLR mRNA expression was assessed by RT－PCR using the brain tissue of C57B／L neonatal mice.Primary NSCs were isolated from the cerebral cortex of neonatal mice.The NSCs were untreated or treated with IFN－λrespectively for several days 24h after isolation.The growth of neurospheres was observed and the cell counting of neurospheres was performed.During NSCs differentiation，MAP2 was detected by immunofluorescence staining as a specific neuronal marker after different days of IFN－λtreatment or untreatment.The fluorescence intensity was measured by the software provided by the laser scanning confocal microscope.Our results showed that mice cerebrum expressed a small amount of IFN－λand IFNLR m RNA.Compared with control group，the number and size of neurospheres decreased obviously after IFN－λtreatment.On day 6 after proliferation，the number of the NSCs in IFN－λ－treated group decreased apparently compared with the untreated group.On day 7 during the NSCs differentiation，the MAP2 fluorescence intensity in IFN－λ－treated group was higher than that of the untreated group.However，there is no significant difference of MAP2 fluorescence intensity between the treated and untreated groups on other days during differentiation.In conclusion，we demonstrated that IFN－λand IFNLR were expressed in the brain tissue of postnatal mice，and IFN－λinhibited the proliferation of mice NSCs and promoted the NSCs differentiation to the neurons.These preliminary data indicate that IFN－λmay play a role in the neural development，besides of its traditional immune defense.

16.抗炎因子白介素10系統(tǒng)性早期給藥緩解成年大鼠脛神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制 馮亞平 任弘毅 李軒漾 齊建國 四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心組織胚胎學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室 成都610041 脊髓背角浸潤的炎癥免疫細(xì)胞和活化的膠質(zhì)細(xì)胞大量釋放促炎性分子，參與周圍神經(jīng)損傷或者疾病引起的慢性神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和維持。最新的研究表明，抗炎因子白介素10（IL－10）的基因治療載體鞘內(nèi)注射可以抑制慢性神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和維持，然而，鞘內(nèi)注射基因治療風(fēng)險(xiǎn)大，經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)較重。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，成年SD雄性大鼠右側(cè)脛神經(jīng)永久性橫斷手術(shù)后立即腹腔注射大鼠來源的重組蛋白IL－10（20μg／kg）可以顯著抑制疼痛的急性誘發(fā)和慢性轉(zhuǎn)化；腹腔注射IL－10的大鼠手術(shù)后5天同側(cè)脊髓背角灰質(zhì)淺層中小膠質(zhì)／巨噬細(xì)胞的數(shù)量，相比于手術(shù)后注射同等劑量的PBS的對照組大鼠明顯減少；腹腔注射IL－10的大鼠手術(shù)后7天同側(cè)脊髓背角灰質(zhì)淺層中表達(dá)抗炎性細(xì)胞因子IL－10的CD4＋T細(xì)胞的數(shù)量明顯增加；同時(shí)，腹腔注射IL－10的大鼠手術(shù)后7天和14天同側(cè)脊髓背角灰質(zhì)淺層中小膠質(zhì)／巨噬細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量，相比于對照組大鼠明顯減少。以上結(jié)果提示早期系統(tǒng)性給予IL－10可能通過抑制脊髓背角炎癥免疫反應(yīng)緩解成年大鼠脛神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)病理性疼痛，為周圍性神經(jīng)病理性疼痛治療提供新的方法。

17.鈣反應(yīng)性反式激活因子在神經(jīng)元分化中的作用及機(jī)制研究 王巧真1管英俊1金真真2彭挺2李和1，21濰坊醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系 濰坊261000，2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 武漢430032 鈣反應(yīng)性反式激活因子（calcium－responsive transactivator，CREST）是一種在神經(jīng)元內(nèi)通過募集CBP、p300介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)，與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育有關(guān)，但與神經(jīng)元分化的關(guān)系不明確。本研究以N2a細(xì)胞為模型，觀察了分化對CREST表達(dá)，不同CREST表達(dá)水平對N2a細(xì)胞突起生長，分化誘導(dǎo)對N2a細(xì)胞CREST m RNA和蛋白表達(dá)，不同CREST表達(dá)水平對細(xì)胞成熟神經(jīng)元標(biāo)志物、神經(jīng)元樹突標(biāo)志物以及神經(jīng)元軸突標(biāo)志物、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、分化相關(guān)蛋白mRNA和蛋白表達(dá)水平或活性水平及細(xì)胞增殖活力和細(xì)胞周期等的影響。結(jié)果顯示：①無血清誘導(dǎo)分化情況下，CREST在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)增加。②過表達(dá)CREST促進(jìn)N2a細(xì)胞的突起生長，而沉默CREST可明顯抑制無血清誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞的突起生長。③過表達(dá)CREST促進(jìn)N2a細(xì)胞成熟神經(jīng)元標(biāo)志物、樹突標(biāo)志物和軸突標(biāo)志物在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)，而在無血清誘導(dǎo)分化條件下，沉默CREST明顯抑制N2a細(xì)胞相應(yīng)標(biāo)志物在m RNA水平和蛋白水平的表達(dá)。④過表達(dá)CREST可導(dǎo)致N2a細(xì)胞周期阻滯，抑制N2a細(xì)胞的增殖，下調(diào)周期蛋白D1、周期蛋白E1和周期蛋白A1水平，降低視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，Rb）磷酸化水平，促進(jìn)p21的mRNA表達(dá)；過表達(dá)CREST上調(diào)N2a細(xì)胞的p53水平，提高其乙?；降桓淖兤鋗 RNA水平。以上結(jié)果表明，CREST可能通過募集組蛋白乙?；窩BP、p300，促進(jìn)p53的乙?；瘡亩€(wěn)定N2a細(xì)胞內(nèi)p53和促進(jìn)p53的活性，上調(diào)p21的表達(dá)。p21的表達(dá)增加通過抑制Rb的磷酸化修飾進(jìn)而抑制周期蛋白D1、周期蛋白E1和周期蛋白A1的表達(dá)，導(dǎo)致N2a細(xì)胞周期阻滯而分化。

18.施萬細(xì)胞通過縫隙連接促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向少突前體樣細(xì)胞分化 馬瑗鍰1邱學(xué)成2張榮宜2曾湘3曾園山21廣東醫(yī)學(xué)院 湛江524023，2中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院 廣州510080，3美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)外科系 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）移植治療脊髓損傷具有很好的臨床應(yīng)用前景。然而，脊髓損傷后會有大量內(nèi)源性施萬細(xì)胞（SCs）從脊神經(jīng)根絲遷入損傷區(qū)內(nèi)。因此，研究遷入的SCs對移植的MSCs的影響，對將來臨床上有效地移植MSCs治療脊髓損傷有重要的指導(dǎo)意義。本實(shí)驗(yàn)在大鼠受損傷的脊髓中移植MSCs，兩個(gè)月后檢測到遷入的SCs與移植的MSCs接觸的部位存在有縫隙連接蛋白（CX43），有些MSCs分化為少突前體樣細(xì)胞。我們將這兩種細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，也檢測到它們接觸的部位有CX43。Western blot顯示，SCs在與MSCs接觸后其CX43的表達(dá)增強(qiáng)。熒光染料Calcein AM穿越實(shí)驗(yàn)顯示，共培養(yǎng)2天后染料從SCs傳遞給MSCs。采用免疫熒光和組織化學(xué)染色技術(shù)檢測到，與單純MSCs組和SCs間接接觸共培養(yǎng)的MSCs組比較，SCs直接接觸共培養(yǎng)的MSCs組的少突前體樣細(xì)胞數(shù)量增高；采用縫隙連接阻滯劑生胃酮阻斷縫隙連接后，少突前體樣細(xì)胞數(shù)量則下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，SCs與MSCs直接接觸能夠形成縫隙連接，這些縫隙連接具有傳遞小分子物質(zhì)的功能，CX43蛋白可能參與它們之間縫隙連接的形成。直接與SCs接觸的MSCs向少突前體樣細(xì)胞分化能力的增強(qiáng)，可能與這兩種細(xì)胞之間形成的縫隙連接有關(guān)。因此，在應(yīng)用MSCs移植治療脊髓損傷時(shí)，要考慮到這種可能的修復(fù)機(jī)制。

19.Pin1抑制劑對小鼠植入前胚體外發(fā)育及2－細(xì)胞胚內(nèi)干細(xì)胞因子表達(dá)的影響 連秀麗 宋嬋嬋 賀琳程霄翔 陳俊明 杜娟 劉玥 王世鄂 福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系 福州350108 本研究旨在觀察Pin1在小鼠植入前胚中的定位分布及其抑制劑Juglone對小鼠植入前胚體外發(fā)育及2－細(xì)胞胚內(nèi)干細(xì)胞因子表達(dá)的影響，為進(jìn)一步闡明Pin1在植入前胚中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)利用免疫熒光法檢測小鼠不同發(fā)育階段植入前胚中Pin1的定位分布，發(fā)現(xiàn)各發(fā)育階段植入前胚中都存在Pin1的表達(dá)，細(xì)胞胞質(zhì)和胞核內(nèi)均有分布，且核內(nèi)熒光著色明顯比胞質(zhì)強(qiáng)。其次，進(jìn)行小鼠1－細(xì)胞胚體外培養(yǎng)，以培養(yǎng)液KSOM為對照組，以培養(yǎng)液中添加有不同濃度的Juglone為實(shí)驗(yàn)組，記錄并比較各組發(fā)育至2－細(xì)胞胚、4－細(xì)胞胚及囊胚階段的數(shù)目和比率。結(jié)果顯示，Juglone對小鼠植入前胚體外發(fā)育的影響具有濃度依賴性，5μmol／L、10μmol／L、25μmol／L的Juglone實(shí)驗(yàn)組4－細(xì)胞胚和囊胚發(fā)育率分別為90.35%、5.83%、1.74%和24.56%、0.00%、0.00%，明顯低于KSOM對照組（98.51%和97.01%）。但2－細(xì)胞胚發(fā)育率無差別。同時(shí)，運(yùn)用Real－time PCR技術(shù)檢測2－細(xì)胞胚內(nèi)干細(xì)胞因子Sox2、Oct4、c－Myc和Klf4 mRNA的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，Juglone（25μmol／L）可使Sox2 m RNA表達(dá)水平明顯降低，Klf4、c－Myc和Oct4 m RNA表達(dá)量略有降低。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，小鼠1－細(xì)胞胚之后，Pin1主要定位在細(xì)胞核內(nèi)，提示其可能參與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活動。且Pin1抑制劑Juglone能使2－細(xì)胞胚至4－細(xì)胞胚過渡率和干細(xì)胞因子Sox2 m RNA表達(dá)水平明顯降低，說明Pin1在小鼠植入前胚體外發(fā)育早期階段具有重要作用，可能參與調(diào)控合子基因組激活。

20.緊密連接蛋白claudin－7在發(fā)生發(fā)育小鼠腎泌尿小管表達(dá)的時(shí)空性研究 叢敬 顧玲 張婕 田瑩瑩翟效月 中國醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室沈陽110122 緊密連接是相鄰上皮細(xì)胞側(cè)面細(xì)胞膜接觸區(qū)特化形成的細(xì)胞連接，其在細(xì)胞旁路中形成屏障，決定并維持細(xì)胞的極性，參與信號傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、凋亡等活動。Claudins是蛋白亞型最多的一種緊密連接蛋白，且大多表達(dá)在特定的腎泌尿小管節(jié)段，claudin－7是這個(gè)家族的成員。本實(shí)驗(yàn)擬通過對claudin－7表達(dá)的時(shí)空性研究，探索其對腎泌尿小管上皮細(xì)胞緊密連接進(jìn)而極性形成及完善的意義。采集胎齡16天和18天胎鼠腎臟，以及生后7天仔鼠和28天及40天成鼠腎臟，制備成連續(xù)石蠟切片，選取若干張進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，亮視野顯微鏡下觀察腎泌尿小管Claudin－7的表達(dá)，并通過連續(xù)切片的顯微圖像進(jìn)行特異小管表達(dá)的定位。結(jié)果顯示，claudin－7的陽性表達(dá)呈線樣；在發(fā)育早期的腎單位，claudin－7表達(dá)在輸尿管芽上皮細(xì)胞的側(cè)面，芽干較芽泡表達(dá)更強(qiáng)；隨著腎臟的發(fā)育，claudin－7表達(dá)在連接小管和集合管上皮細(xì)胞的側(cè)面或基底面，尤其是在閏細(xì)胞的基底和基側(cè)面；在遠(yuǎn)端小管，claudin－7微弱表達(dá)在發(fā)育早期上皮細(xì)胞的側(cè)面，伴隨著細(xì)胞成熟分化逐漸減少，成熟小鼠腎臟遠(yuǎn)曲小管和遠(yuǎn)直小管不表達(dá)；在致密斑處，claudin－7始終表達(dá)在基底面，表達(dá)強(qiáng)度與小管成熟度一致。綜上所述，claudin－7早期表達(dá)在輸尿管芽和遠(yuǎn)端小管細(xì)胞，而后出現(xiàn)在集合管和連接小管細(xì)胞。此現(xiàn)象提示Claudin7與集合管系上皮細(xì)胞之間的緊密連接形成及細(xì)胞的極化有關(guān)。

21.小鼠孤雄胚胎干細(xì)胞向心肌分化的研究 李彤梁宵孫瑞珍單智焱雷蕾 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室哈爾濱150081 為探討小鼠孤雄胚胎干細(xì)胞（Androgenetic Embryonic Stem Cells，AgESCs）向心肌分化的能力及對心梗模型小鼠的治療效果，我們建立小鼠AgES細(xì)胞系并對其進(jìn)行體外自發(fā)分化，觀察其向心肌分化的效率與受精的胚胎干細(xì)胞（f ES）是否有差異及采用Real－time PCR手段檢測各階段心臟發(fā)生標(biāo)記物的表達(dá)情況；此外，將AgES細(xì)胞及其預(yù)分化產(chǎn)物分別進(jìn)行心梗模型小鼠體內(nèi)細(xì)胞移植，通過生存率統(tǒng)計(jì)及超聲心動圖的監(jiān)測來觀察對心梗模型小鼠的治療效果。我們觀察到小鼠Ag ES與f ES在體外自發(fā)分化時(shí)均可以成功分化為跳動的擬胚體（Beating EBs），分化的效率無明顯差異。在體外分化過程中，心臟發(fā)生各階段標(biāo)記物如Brachyury T、Tbx5、ANP等均在相應(yīng)階段表達(dá)上升，且分別于分化的D6、D9、D15時(shí)AgES組的相對表達(dá)量明顯高于f ES組；Ag ES細(xì)胞及其預(yù)分化產(chǎn)物均可以減緩心梗模型小鼠的死亡，且在一定時(shí)間段內(nèi)可以緩解心梗小鼠射血分?jǐn)?shù)（EF）及左心室短軸縮短率（FS）的下降甚至使之回升，于D28其心功指標(biāo)顯高于f ES注射組。故我們得出結(jié)論小鼠AgES細(xì)胞在體外可以成功分化為心肌細(xì)胞但心肌分化效率與f ES無明顯差異；AgES來源的細(xì)胞對心梗模型小鼠有一定的治療效果且相較于f ES來源的細(xì)胞治療效果更好。

22.胚胎生殖細(xì)胞抽提物對iPS細(xì)胞誘導(dǎo)效率及表觀遺傳記憶的影響 胡靜 趙巧湜 單智焱 雷蕾 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 哈爾濱150081 為研究小鼠胚胎生殖細(xì)胞（Embryonic germ cells，EGCs）抽提物誘導(dǎo)的體細(xì)胞重編程及對誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPS）誘導(dǎo)效率及表觀遺傳記憶的影響，我們建立了12.5dpc原始生殖細(xì)胞 （primordial germ cells，PGCs）來源的EGCs，并以小鼠胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）為對照，應(yīng)用qPCR檢測EGCs中與發(fā)育相關(guān)的11個(gè)父源與母源印記基因的表達(dá)情況。制作EGCs抽提物，聯(lián)合四因子病毒誘導(dǎo)MEF細(xì)胞，對重編程細(xì)胞進(jìn)行建系，甲基化DNA免疫共沉淀測序檢測建系細(xì)胞的印記基因及基因組甲基化的情況。結(jié)果顯示，EGCs克隆有高水平堿性磷酸酶活性，表達(dá)小鼠ESCs多能性標(biāo)記物OCT4及細(xì)胞表面標(biāo)記SSEA－1；核型為正常的40條染色體，體內(nèi)可分化出3個(gè)胚層來源的組織；EGCs的印記基因表達(dá)量顯著高于ESCs。MEF細(xì)胞經(jīng)EGCs抽提物孵育后細(xì)胞增殖能力旺盛，增殖活力明顯增加；在細(xì)胞培養(yǎng)的第五天觀察到類似mES的克隆樣集落生長，堿性磷酸酶檢測顯示陽性、免疫熒光染色顯示多潛能標(biāo)記Oct4陽性，但是在克隆出現(xiàn)后的培養(yǎng)中，克隆不再進(jìn)行生長。qPRC檢測到EGCs抽提物孵育后細(xì)胞多潛能基因Oct4、Nanog、Sox2基因的表達(dá)出現(xiàn)先升高再降低的呈拋物線狀的趨勢；印記基因H19、Igf2、Snrpn、Igf2r的表達(dá)與對照組MEF比較明顯增加；EGCs抽提物聯(lián)合四因子病毒誘導(dǎo)MEF細(xì)胞，所獲iPS的細(xì)胞增殖明顯比單純iPS組活躍，其印記基因的表達(dá)明顯高于單純iPS組；EGCs抽提物的孵育能夠提高iPS誘導(dǎo)效率的5～7倍；通過MeDIP－seq測序和單純iPSs組相比，聯(lián)合iPS組全基因組DNA呈低甲基化狀態(tài)，GO分析顯示甲基化異常改變明顯的基因類型包括免疫系統(tǒng)類、細(xì)胞周期類和細(xì)胞凋亡類等。因此我們認(rèn)為EGCs抽提物可以使體細(xì)胞發(fā)生部分重編程，誘發(fā)多潛能基因的表達(dá)和印記基因的擦除。EGCs抽提物可以促進(jìn)四因子誘導(dǎo)的iPS效率，并改變iPS的印記狀態(tài)。

23.人誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞系的建立 師迎旭 杜華 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 呼和浩特010050 人胚胎干細(xì)胞（h ESCs）是研究正常人類發(fā)育的首選細(xì)胞，但因?yàn)閭惱韱栴}利用hESCs進(jìn)行研究具有極大的局限性。誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（inducedpluripotent stem cells，iPSCs）的出現(xiàn)是干細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域中的一個(gè)重要里程碑。2006年日本科學(xué)家Shinya Yamanaka第一次利用病毒載體將4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（Oct4，Sox2，Klf4和c－Myc）轉(zhuǎn)導(dǎo)整合入分化的體細(xì)胞的染色體中，誘使處于終末分化階段的體細(xì)胞經(jīng)重編程后轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃婆咛ジ杉?xì)胞的一種細(xì)胞類型－－iPSCs。iPSCs這一特點(diǎn)，與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生過程極其相似，因此通過研究iPSCs，可以為腫瘤基礎(chǔ)研究和臨床診斷與治療提供一種新的解決途徑。使用iPSCs作為研究的初始細(xì)胞為研究人類遺傳性疾病、腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及評估基因突變對于發(fā)育的影響提供了一個(gè)有效的研究平臺。利用攜帶4種基因的反轉(zhuǎn)錄病毒感染HS27細(xì)胞20d后，可以觀察到有人胚胎干細(xì)胞樣克隆出現(xiàn)，選取AP（＋）且具有典型的人胚胎干細(xì)胞克隆形態(tài)的克隆進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)，并對其從克隆形態(tài)、生長特性、多潛能標(biāo)志基因表達(dá)和畸胎瘤形成及分化等方面進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HS27細(xì)胞來源的iPSCs能夠在體外長期傳代培養(yǎng)。AP染色可觀察到未分化的人胚胎干細(xì)胞變紅或紫色，分化的細(xì)胞為無色。進(jìn)一步通過免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測分析構(gòu)建的人iPSCs中人胚胎干細(xì)胞標(biāo)志性基因（如 Oct4、SSAE－4、TRA－1－60、TRA－1－81）表達(dá)情況。利用懸滴法研究iPSCs分化為擬胚體的能力。最后，將iPSCs注射到裸鼠皮下，1個(gè)月左右可見SCID小鼠皮下形成畸胎瘤。剝離小鼠腫瘤組織，石蠟包埋，然后進(jìn)行蘇木精－伊紅染色，研究iPSCs向三胚層分化的能力。結(jié)果表明，誘導(dǎo)后的iPSCs可維持人胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特性。人iPSCs的成功建立為下一步構(gòu)建人腫瘤細(xì)胞重編程的技術(shù)平臺奠定了扎實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為腫瘤病患個(gè)體化診治提供了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

24.JAM－A基因干擾促進(jìn)表皮干細(xì)胞增殖 仵敏娟 周童 劉厚奇 第二軍醫(yī)大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 上海200433 JAM－A屬于免疫球蛋白超家族，跨膜分布，同源二聚化后可與細(xì)胞內(nèi)的PDZ（PSD－95／Discs－large／ZO－1）結(jié)構(gòu)域結(jié)合，和胞內(nèi)外信號傳遞、細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖等關(guān)系密切。為了探討JAM－A基因?qū)θ吮砥じ杉?xì)胞分化與增殖的影響，將JAM－A基因和JAM－A干擾基因用重組慢病毒病毒基因?qū)爰夹g(shù)導(dǎo)入人表皮干細(xì)胞內(nèi)，在證實(shí)目的基因在人表皮干細(xì)胞中導(dǎo)人成功后，檢測人表皮干細(xì)胞的增殖能力、標(biāo)記性分子、增殖相關(guān)抗原及細(xì)胞安全性等指標(biāo)的變化。分離獲取的人表皮干細(xì)胞在接種后第7天進(jìn)入快速生長期，第10天時(shí)到達(dá)平臺期；JAM－A基因及JAM－A干擾基因?qū)肴吮砥じ杉?xì)胞后，可觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，Western blot檢測到JAM－A蛋白表達(dá)水平的變化，倒置顯微鏡下拍照檢測發(fā)現(xiàn)各組人表皮干細(xì)胞直徑無明顯變化，而JAM－A干擾基因?qū)虢M細(xì)胞增殖則明顯加快，作為短暫擴(kuò)增細(xì)胞的標(biāo)志K14表達(dá)變?yōu)殛栃裕鳛楦杉?xì)胞和腺上皮細(xì)胞共同標(biāo)記的KI9的陽性明顯減弱，β－integrin表達(dá)也下調(diào)，終末分化標(biāo)志K10表達(dá)為陰性，增殖指標(biāo)Ki67在JAM－A干擾基因?qū)虢M呈顯著陽性。JAM－A基因?qū)虢M細(xì)胞增殖減緩，核質(zhì)比增大，體積變小，仍高表達(dá)表皮干細(xì)胞特異性抗原。各組細(xì)胞在畸胎瘤實(shí)驗(yàn)中均為陰性。

25.人肝癌細(xì)胞在豬肝中嵌合狀況的研究 周曉囡 吳嫣爽 王嘉悅 李君 杜瀟 雷蕾 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)組織與胚胎學(xué)教研室哈爾濱150081 將人類的肝癌細(xì)胞注射入適齡豬的肝臟中，探索人類細(xì)胞是否能在豬的肝臟中存活，建立人豬嵌合的肝癌的模型，為臨床藥物試驗(yàn)和其它細(xì)胞在豬肝臟中的移植奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)將人類的HeG2－Puro－GFP細(xì)胞通過腹腔鏡手術(shù)操作注射入肝臟部分切除的巴馬小型豬的肝實(shí)質(zhì)中。實(shí)驗(yàn)共分為4組：G0組為對照組，實(shí)行肝部分切除術(shù)后注射生理鹽水；G1組未實(shí)施肝部分切除術(shù)，直接注射HeG2－Puro－GFP細(xì)胞；G2組肝部分切除術(shù)后注射 HeG2－Puro－GFP細(xì)胞；G3組肝部分切除術(shù)后注射HeG2－Puro－GFP細(xì)胞，術(shù)后12h飼喂免疫抑制劑。細(xì)胞移植后定期采集外周血，檢測肝功的變化，及血清中人類甲胎蛋白的表達(dá)水平。巴馬小型豬處死后，對其肝臟進(jìn)行取材，觀察肝組織病理性變化特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組肝功的各項(xiàng)指標(biāo)在術(shù)后2W左右基本已恢復(fù)到術(shù)前水平；在豬肝臟中可以檢測到HeG2－Puro－GFP細(xì)胞的嵌合，均能檢測到GFP陽性細(xì)胞，在移植天數(shù)相同的情況下使用免疫抑制劑的細(xì)胞嵌合率高于其它各組；Elisa檢測結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)組的外周血中可以檢測到人AFP的表達(dá)；HE結(jié)果顯示肝組織有炎細(xì)胞的浸潤、肝細(xì)胞壞死和肝細(xì)胞腫脹等病理特征。以上結(jié)果表明，人的HeG2－Puro－GFP細(xì)胞可以在豬肝中嵌合，并能分泌人的甲胎蛋白，免疫抑制劑的使用能延長細(xì)胞的存活時(shí)間和存活效率。

26.Smad7通過影響Wnt通路促進(jìn)結(jié)腸腫瘤發(fā)生 黃河 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)系 長沙410013 Wnt／β－Catenin通路的突變被認(rèn)為是腸癌發(fā)生的起始步驟。剔除APC腫瘤抑制因子會引起β－Catenin降解從而導(dǎo)致腸息肉的發(fā)生，后者進(jìn)一步在其他因素影響下導(dǎo)致腸癌。Smad7是TGF－beta和BMP信號通路的抑制因子，最近研究表明Smad7與結(jié)腸癌有關(guān)聯(lián)。我們制作了在腸道上皮敲入Smad7的VillinCre；RSmad7條件性基因敲入（CKI）小鼠，該小鼠3月齡時(shí)已明顯觀測到腸道息肉的形成，6月齡時(shí)觀測到腺瘤形成，12月齡時(shí)已經(jīng)惡化為結(jié)直腸癌。免疫組織化學(xué)染色顯示，在正常小鼠β－catenin在腸上皮細(xì)胞膜表達(dá)，僅在腸隱窩基部干細(xì)胞觀測到核陽性；而在CKI小鼠自發(fā)形成的癌組織，觀測到β－catenin高度核陽性，且Wnt信號通路的靶分子CD44、Sox9等也同時(shí)被激活。進(jìn)一步制作VillinCre；RSmad7；APCC／＋小鼠。Kaplan－Meier生存曲線顯示，每組7只小鼠中，VillinCre；RSmad7；APCC／＋不到3個(gè)月全部死亡，VillinCre；APCC／＋小鼠有2只死亡，野生型小鼠APCC／＋無一死亡。對小鼠樣本進(jìn)行解剖，癌組織惡性程度增高，免疫組織化學(xué)顯示W(wǎng)nt／β－catenin通路被激活。結(jié)果提示，Smad7的上調(diào)能加速腫瘤形成從而導(dǎo)致小鼠結(jié)直腸癌死亡率上升。

27.c－kit信號在結(jié)直腸黏液性腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用與機(jī)制 沈萍 譚俊 楊姝 孫海梅 肖杰 王亞希 吳波 季鳳清 周德山 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系 北京100069 結(jié)直腸黏液性腺癌（colorectal mucinous adenocarcinoma，CRMAC）約占結(jié)直腸腺癌的20%，其腫瘤組織內(nèi)含有大量的細(xì)胞外黏液，腫瘤惡性程度高，侵襲及轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，患者預(yù)后較差，但有關(guān)CRMAC的發(fā)病機(jī)制仍未明了。有研究提示c－kit信號可能在CRMAC發(fā)生發(fā)展過程中起一定作用。本研究利用野生型C57BL小鼠和c－kit功能缺失突變小鼠（Wads－／－），通過腹腔注射AOM及喂食DSS的方法成功建立CRMAC動物模型，同時(shí)利用人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT－116，探討c－kit信號在CRMAC發(fā)生發(fā)展過程中的可能調(diào)控機(jī)制。AOM＋DSS誘導(dǎo)37周后，HE染色、Alcian blue染色和MUC2免疫熒光染色證實(shí)所有野生型（15只）和 Wads－／－（5只）小鼠均發(fā)生結(jié)直腸腺癌，其中約50%的野生型小鼠為CRMAC，而Wads－／－小鼠無一例為CRMAC。CRMAC腫瘤細(xì)胞惡性程度較高、穿透基膜浸潤至黏膜下層，c－kit活性及其下游的促黏液分泌因子Math1的表達(dá)均較非CRMAC和正常小鼠黏膜上皮顯著增高，提示c－kit可能通過上調(diào)Math1的表達(dá)促進(jìn)CRMAC的發(fā)生。在體、離體實(shí)驗(yàn)均表明，過表達(dá)c－kit還可抑制p53的表達(dá)，同時(shí)增加cyclin D1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)CRMAC細(xì)胞的增殖，并且可通過上調(diào)ETV4的表達(dá)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力；運(yùn)用Imatinib抑制c－kit活性后，腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均受到明顯的抑制。本研究初步證明c－kit可以促進(jìn)CRMAC的發(fā)生、增殖和侵襲，為該疾病的臨床診療提供了新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。

28.抑癌基因Keap1抑制非小細(xì)胞肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究 許麗娥 吳波 楊姝 孫海梅 季鳳清 周德山 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系北京100069 高侵襲和易轉(zhuǎn)移的腫瘤生物學(xué)特征是肺癌死亡率居高不下的主要原因，尤其在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）最為常見。已知腫瘤細(xì)胞運(yùn)動需細(xì)胞骨架解聚與重組、細(xì)胞極性形成、細(xì)胞前端伸出偽足、形成新的黏著斑及細(xì)胞尾部收縮等過程?？梢娔[瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移與細(xì)胞骨架解聚、重組過程密切相關(guān)。而小G蛋白Rho A是調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架解聚與重組的關(guān)鍵分子。Keap1（Kelch－like ECH－associated protein 1）是近年備受關(guān)注的抑癌基因，在多種腫瘤組織中表達(dá)降低。我們前期研究發(fā)現(xiàn)Keap1在非小細(xì)胞肺癌中呈低表達(dá)狀態(tài)，但是有關(guān)Keap1在非小細(xì)胞肺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過構(gòu)建Keap1過表達(dá)慢病毒載體，轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、H460及H1299，建立Keap1過表達(dá)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞模型。通過細(xì)胞多功能分析儀（RTCA）檢測發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Keap1可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲，免疫熒光發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Keap1的腫瘤細(xì)胞內(nèi)F－actin富集并形成束狀應(yīng)力纖維，細(xì)胞質(zhì)中黏著斑變大、數(shù)量增多，Keap1過表達(dá)組Rho A活性明顯升高。通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)Keap1過表達(dá)細(xì)胞中負(fù)性調(diào)節(jié)Rho A活性的Myo9b蛋白表達(dá)降低，經(jīng)過蛋白酶體抑制劑MG132處理后Myo9b蛋白表達(dá)上調(diào)。荷瘤鼠動物模型過表達(dá)組與對照比相比，腫瘤體積小并且腫瘤同側(cè)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞少。結(jié)果表明，抑癌基因Keap1通過蛋白酶體途徑使Myo9b表達(dá)降低，促使Rho A活性升高進(jìn)而穩(wěn)固細(xì)胞骨架、調(diào)節(jié)黏著斑循環(huán)，抑制非小細(xì)胞肺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。

29.缺氧微環(huán)境下H3K4me3修飾促進(jìn)肝癌HOXB9表達(dá)的表觀遺傳學(xué)機(jī)制研究 洪金金 娜荷芽 苗方笑李善花 廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室廈門361102 肝細(xì)胞癌（HCC）是原發(fā)性肝癌最主要的類型，具有生長快、侵襲力強(qiáng)、易轉(zhuǎn)移及預(yù)后差等特點(diǎn)。缺氧作為快速生長腫瘤的一種常見現(xiàn)象，與腫瘤的發(fā)生、生長、代謝、浸潤及轉(zhuǎn)移都有著密不可分的關(guān)系。已證實(shí)，組蛋白甲基化修飾作為重要的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控形式，在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的生物學(xué)功能。我們通過基因組染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP－on－ChIP）技術(shù)探討缺氧條件下肝癌細(xì)胞H3K4me3正性組蛋白甲基化的修飾規(guī)律，發(fā)現(xiàn)2500多個(gè)靶基因啟動子區(qū)域的H3K4me3修飾水平發(fā)生變化，其中包括HOXB9、BGLAP及ADAMTS4等基因。HOXB9在肺癌、乳腺癌及肝癌的發(fā)生及發(fā)展中具有促進(jìn)作用。本研究從已獲得的染色質(zhì)組蛋白甲基化等組學(xué)數(shù)據(jù)的整合分析入手，利用ChIP等關(guān)鍵技術(shù)深入篩選和鑒定肝癌中受H3K4me3調(diào)控的靶基因網(wǎng)絡(luò)，明確缺氧調(diào)控HOXB9等關(guān)鍵靶基因轉(zhuǎn)錄的優(yōu)勢組蛋白甲基化修飾規(guī)律，鑒定了MLL等組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物組成，探討以H3K4me3調(diào)控的正性組蛋白甲基化修飾為靶點(diǎn)的小分子化合物在肝癌治療中的潛在應(yīng)用前景。本研究將有助于揭示缺氧誘導(dǎo)的正性組蛋白甲基化異常修飾促進(jìn)肝癌發(fā)生的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，擴(kuò)展對H3K4me3調(diào)控的HOXB9等靶基因網(wǎng)絡(luò)等領(lǐng)域的認(rèn)識，為肝癌防治提供嶄新的靶點(diǎn)。

30.整合素－β1、PKC與膠質(zhì)瘤細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)改變及侵襲性的關(guān)系 杜華 鐘延豐 師迎旭 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室 呼和浩特010050 侵襲性是腫瘤細(xì)胞最重要的生物學(xué)特性之一，膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的一類腫瘤，主要生物學(xué)特性表現(xiàn)為浸潤性生長、廣泛的局部侵襲而罕見顱外轉(zhuǎn)移。膠質(zhì)瘤的侵襲性生長涉及到細(xì)胞信號傳導(dǎo)、細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移等多個(gè)環(huán)節(jié)。整合素（integrin）β1是整合素分子家族中重要的β亞單位，能與不同的α亞單位結(jié)合，構(gòu)成ECM的絕大多數(shù)受體，是細(xì)胞與細(xì)胞間，尤其是細(xì)胞與ECM間不可缺少的粘附因子。蛋白激酶C（PKC）是一族結(jié)構(gòu)相近、Ca2＋和磷脂依賴、甘油二酯（DAG）活化的同工酶，是細(xì)胞活化包括腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要信號分子，對正常細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)均起重要作用，也是介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞粘附、運(yùn)動、侵襲及轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。本研究通過黏附實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)和體外侵襲實(shí)驗(yàn)來檢測整合素β1和PKC對人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株（U251MG）的細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并通過免疫熒光染色激光共聚焦顯微鏡和掃描電鏡觀察細(xì)胞骨架和細(xì)胞表面?zhèn)巫愕母淖?。?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)用抗整合素β1抗體阻斷腫瘤細(xì)胞自泌性整合素β1的功能，可以改變腫瘤細(xì)胞內(nèi)微絲的排列極向，胞膜下可見平行排列的微絲束，粗壯而密集，沿細(xì)胞極性平行排列或縱橫交錯(cuò)成網(wǎng)狀貫穿整個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞突起，細(xì)胞表面?zhèn)巫銣p少，細(xì)胞運(yùn)動遷移及體外侵襲能力明顯減弱。應(yīng)用PKC激活劑PMA，細(xì)胞內(nèi)微絲縮短，排列紊亂和熒光信號彌散，并可見絮團(tuán)狀小體－F－actin小體的出現(xiàn)；F－actin小體的出現(xiàn)及其數(shù)量與腫瘤的惡性程度和轉(zhuǎn)移潛能具有一定的正相關(guān)性，此時(shí)細(xì)胞表面?zhèn)巫銛?shù)量明顯增多、密集而粗壯，U251MG腫瘤細(xì)胞黏附、運(yùn)動遷移及體外侵襲能力增強(qiáng)。應(yīng)用PKC抑制劑Calphostin C，腫瘤細(xì)胞微絲圍繞胞膜下成簇狀排列，細(xì)胞偽足基本消失，使細(xì)胞運(yùn)動遷移及體外侵襲能力降低?？拐纤卅?抗體與PKC激活劑或抑制劑聯(lián)合應(yīng)用，分別增強(qiáng)上述作用。研究結(jié)果表明，整合素可能通過激活PKC而影響細(xì)胞骨架蛋白從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動侵襲能力；抑制PKC活性或阻斷細(xì)胞表面整合素－β1能有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和惡性進(jìn)展。

31.MAGE－D4在大腸癌中的表達(dá)及其臨床意義 張慶梅 羅彬 陳芳 農(nóng)蔚霞 石蕾 彭亞 謝小薰 廣西醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 南寧530021 黑色素瘤相關(guān)抗原（Melanoma－associated antigen，MAGE）是一類被視為腫瘤免疫治療理想靶點(diǎn)的腫瘤特異性抗原。MAGE－D4是MAGE家族的一個(gè)新成員，不／低表達(dá)于多種正常組織，但高表達(dá)于膠質(zhì)瘤、肺癌、肝癌、食道癌和乳腺癌等多種腫瘤組織，且與肝癌、食道癌和乳腺癌的預(yù)后相關(guān)。然而迄今為止，MAGE－D4在大腸癌中的表達(dá)情況尚不清楚，故本研究旨在檢測大腸癌中MAGE－D4的表達(dá)，探討其作為大腸癌預(yù)后診斷和免疫治療靶抗原的可能性。應(yīng)用RT－PCR和免疫組織化學(xué)法在m RNA和蛋白水平檢測MAGE－D4在正常大腸組織、大腸腺瘤、結(jié)腸癌及其匹配的癌旁組織中的表達(dá)，然后對MAGE－D4與大腸癌患者臨床病理指標(biāo)以及生存期的相關(guān)性進(jìn)行進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，MAGE－D4 m RNA在大腸癌中的表達(dá)率 （76.7%，46／60）明顯高于癌旁組織 （15.0%，9／60）；MAGED4蛋白在所有大腸癌組織中均表達(dá)，其中70.0%（21／30）呈現(xiàn)高表達(dá)，而在癌旁組織中均未檢測到MAGED4蛋白；大腸腺瘤和正常大腸組織中均未檢測到MAGE－D4 mRNA和蛋白。此外，MAGE－D4 mRNA和蛋白表達(dá)與大腸癌患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、CEA含量、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、腫瘤分化程度及組織學(xué)類型等臨床病理指標(biāo)均無關(guān)，但MAGE－D4蛋白表達(dá)與患者生存期相關(guān)，即高表達(dá)患者的生存期明顯短于低表達(dá)患者的生存期，且其具有作為大腸癌獨(dú)立預(yù)后因子的趨勢。以上這些結(jié)果表明MAGE－D4在大腸癌組織中特異性高表達(dá)，有望成為大腸癌預(yù)后評估和免疫治療的理想靶抗原。

32.PDIA6對Wnt信號通路的影響及其機(jī)制 高會君 邵淑娟 胡 軍 遲鑫明 張麗媛 大連醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室 大連116044 蛋白二硫鍵異構(gòu)酶家族A成員6（PDIA6）是本實(shí)驗(yàn)室通過質(zhì)譜高通量實(shí)驗(yàn)篩選并經(jīng)組織芯片驗(yàn)證的肺鱗癌相關(guān)蛋白，其在肺鱗癌組織中表達(dá)增高。我們在Hela細(xì)胞中利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測，發(fā)現(xiàn)PDIA6可能激活Wnt信號通路。本研究通過將外源性PDIA6基因轉(zhuǎn)染到人Hela細(xì)胞中，進(jìn)一步探究PDIA6對Wnt信號通路的影響及作用機(jī)制，從而了解PDIA6在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的功能和作用機(jī)制，探討其作為腫瘤治療靶點(diǎn)的可能性。將pCMV－sport6－PDIA6質(zhì)粒和空載體pCMV－sport6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，Western blot法檢測PDIA6高表達(dá)后對Wnt信號通路中關(guān)鍵蛋白β－catenin及其重要靶蛋白cyclinDl、c－myc表達(dá)的影響，以驗(yàn)證PDIA6對 Wnt通路的激活作用；利用免疫熒光觀察PDIA6高表達(dá)后β－catenin在細(xì)胞中的定位；Western blot法檢測PDIA6高表達(dá)后β－catenin Ser45磷酸化狀態(tài)；放線菌酮處理細(xì)胞，Western blot法檢測PDIA6高表達(dá)后β－catenin穩(wěn)定性的變化；MG－132處理細(xì)胞，Western blot法檢測PDIA6高表達(dá)后對β－catenin泛素降解過程的影響。與空載體pCMV－sport6對照組相比較，PDIA6高表達(dá)后β－catenin、cyclinDl及c－myc均表達(dá)上調(diào)且細(xì)胞核中β－catenin表達(dá)上調(diào)；免疫熒光結(jié)果顯示PDIA6高表達(dá)后β－catenin定位于細(xì)胞核；放線菌酮處理細(xì)胞PDIA6高表達(dá)后β－catenin蛋白表達(dá)速度降低較慢；PDIA6高表達(dá)后β－cateninSer45磷酸化水平降低；MG－132處理細(xì)胞PDIA6高表達(dá)后βcatenin蛋白水平并無改變，但影響了β－catenin的泛素－蛋白酶體降解過程。結(jié)果提示，在Hela細(xì)胞中PDIA6可能通過抑制β－catenin氨基端Ser45的磷酸化，進(jìn)而抑制β－catenin泛素－蛋白酶體降解，使得βcatenin累積入核激活Wnt信號通路，促進(jìn)β－catenin核移位，激活下游靶基因cyclin Dl、c－myc轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活。

33.磷酸化蛋白質(zhì)組策略研究MCM2磷酸化在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用 李會敏 邵淑娟 胡軍 張麗媛 遲鑫明 孫兵 大連醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 大連116044 基于對磷酸化肽具有高選擇性的納米材料結(jié)合二甲基化同位素標(biāo)記技術(shù)，本研究建立了蛋白組學(xué)鑒定平臺，并由此鑒定出與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的磷酸化蛋白MCM2及其磷酸化位點(diǎn)S27、S139。MCM2是一種重要的DNA復(fù)制啟動調(diào)節(jié)因子，存在許多磷酸化位點(diǎn)，功能失調(diào)會導(dǎo)致染色體缺陷，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。本課題探究MCM2磷酸化在腫瘤轉(zhuǎn)移中的功能及其作用機(jī)制，期望為腫瘤轉(zhuǎn)移預(yù)警和干預(yù)提供治療新靶點(diǎn)。利用Tissue array檢測出MCM2磷酸化與卵巢癌轉(zhuǎn)移相關(guān)；Western blot驗(yàn)證了低表達(dá)MCM2磷酸化蛋白的卵巢癌細(xì)胞系HO8910；轉(zhuǎn)染MCM2磷酸化質(zhì)粒的細(xì)胞可高表達(dá)MCM2（S27），MCM2（S139）磷酸化蛋白，轉(zhuǎn)染磷酸化位點(diǎn)突變體質(zhì)粒的細(xì)胞不能高表達(dá)相應(yīng)的MCM2磷酸化蛋白；結(jié)晶紫染色觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染S27A、S139A突變體質(zhì)粒的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染MCM2磷酸化質(zhì)粒的細(xì)胞細(xì)長有突起；Western blot和Real－time PCR檢測結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染S27A、S139A突變體質(zhì)粒的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染 MCM2磷酸化質(zhì)粒的細(xì)胞中，Snail，Vimentin，β－catenin蛋白表達(dá)水平均上調(diào)，Vimentin和Snail RNA表達(dá)水平均上調(diào)，β－catenin RNA表達(dá)水平無明顯變化，E－cadherin在蛋白和RNA表達(dá)水平均下調(diào)；CCK－8結(jié)果顯示，S27、S139磷酸化位點(diǎn)突變后，細(xì)胞增殖不受影響；劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell基底膜遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，MCM2磷酸化能促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。上述結(jié)果表明，MCM2磷酸化與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生相關(guān)，可能通過激活Wnt／β－catenin信號通路，促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

34.趨化因子受體CCR7促進(jìn)大腸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及西妥昔單抗耐藥的機(jī)制研究 高玲玲 馬慧穎 許平平 韋燁 梁春敏 許劍民 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎系 上海200030 惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移以及治療過程中耐藥性的產(chǎn)生，是影響腫瘤患者療效與預(yù)后的重要因素，也是腫瘤治療過程中所面臨的最大的挑戰(zhàn)。我們以前的研究表明，趨化因子CCR7（Chemokine receptor 7）高表達(dá)于肝癌與胃癌組織且與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究首先應(yīng)用生物信息學(xué)的分析軟件EGAN（Exploratory Gene Association Networks）與KEGG（KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes）對CCR7下游與腫瘤相關(guān)的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)的分析，結(jié)果顯示CCR7下游蛋白與腫瘤的耐藥性以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial－Mesenchymal transition，EMT）密切相關(guān)。接下來我們應(yīng)用190例配對的大腸癌的組織芯片，通過免疫組織化學(xué)檢測其CCR7的表達(dá)，結(jié)果顯示，大腸癌組織的CCR7的表達(dá)明顯的高于正常組織；同時(shí)與臨床病理資料的相關(guān)性分析顯示，CCR7的表達(dá)與腫瘤的浸潤深度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)；生存分析的結(jié)果顯示，CCR7陰性組病人的總體生存率明顯優(yōu)于CCR7陽性組，5年總體生存率分別為58%與40%。最后，應(yīng)用大腸癌細(xì)胞系HCT116與Caco－2進(jìn)行體外機(jī)制的驗(yàn)證，結(jié)果顯示，體外用CCR7的特異性配體SLC刺激大腸癌細(xì)胞可以激活CCR7下游PI3K／AKT信號通路且可以旁路激活EGFR信號通路，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT（細(xì)胞的間質(zhì)性標(biāo)志物β－catenin和Twist明顯上調(diào)，同時(shí)伴隨細(xì)胞遷移能力的改變），同時(shí)細(xì)胞對大腸癌靶向藥物西妥昔單抗的藥物反應(yīng)性明顯的降低；CCR7的中和抗體Nue－CCR7可以有效中和CCR7受體從而阻止SLC引起的上述一系列的改變。以上結(jié)果表明，CCR7下游的信號通路與大腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移以及靶向治療過程中的耐藥性密切相關(guān)，從而提示CCR7可能成為大腸癌診療過程中的又一重要的分子標(biāo)志物與分子治療靶點(diǎn)。

35.人核仁定位蛋白12的核仁定位序列分析及細(xì)胞學(xué)功能研究 杜佩瑤 彭挺 李和 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 武漢430030 核仁是核糖體RNA（r RNA）基因存儲、r RNA合成、加工以及核糖體大小亞單位的裝配場所，并參與細(xì)胞增殖調(diào)控、腫瘤發(fā)生、應(yīng)激、凋亡、核內(nèi)蛋白降解等多種重要的生理過程。核仁定位蛋白12（Nucleolar Location Protein 12，NOL12）是一種新發(fā)現(xiàn)的核仁定位蛋白，能夠與r RNA結(jié)合參與r RNA的轉(zhuǎn)錄和加工。已有的研究發(fā)現(xiàn)果蠅的NOL12同源體Viriato直接參與了果蠅眼睛的生長和分化，并且在果蠅胚胎發(fā)育中作為果蠅癌基因Myc的下游蛋白對細(xì)胞的生長、分化和存活起促進(jìn)作用；對大鼠NOL12的核仁定位機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，大鼠NOL12的核仁定位序列可能位于其蛋白的C末端。目前關(guān)于人類NOL12蛋白的核仁定位序列、定位機(jī)制，以及其在細(xì)胞中所發(fā)揮的作用還未見報(bào)道。本研究通過生物信息學(xué)分析對人NOL12可能存在的核仁定位序列進(jìn)行了預(yù)測，根據(jù)預(yù)測結(jié)果將人全長NOL12分解為多個(gè)片段，分別構(gòu)建了與GFP重組的融合蛋白。通過觀察GFP在亞細(xì)胞水平的熒光定位發(fā)現(xiàn)：人NOL12存在著3段相對獨(dú)立的核仁定位信號序列，分別位于其N端的1－10、C端166－184和C端185－213號位氨基酸殘基，而其他區(qū)域的重組蛋白未見明顯核仁定位。在人宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞中，過表達(dá)NOL12使Hela細(xì)胞的增殖能力、集落生成率及處于S期的細(xì)胞比例均顯著增加，干擾NOL12使Hela細(xì)胞的增值能力顯著抑制，表明NOL12確實(shí)參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和生長。對多個(gè)臨床宮頸癌樣本的病理組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測及在增殖刺激條件下對Hela細(xì)胞中NOL12表達(dá)變化檢測顯示，相對于癌旁組織，宮頸癌巢中的NOL12免疫反應(yīng)性顯著增高；在用含高濃度血清（30%）或含有表皮生長因子（EGF）的培養(yǎng)基進(jìn)行增殖刺激情況下，Hela細(xì)胞中的NOL12蛋白水平的顯著增加。因此，人NOL12的蛋白水平與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展明顯相關(guān)。

36.Wnt10b基因失活對肝癌細(xì)胞增殖及分化的影響 孫莉吳國慧范曉麗 桂林醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室桂林541000 本研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默人肝癌細(xì)胞內(nèi)Wnt10b蛋白表達(dá)，探討Wnt10b蛋白對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖、周期、凋亡、遷移及侵襲的作用。根據(jù)Wnt10b m RNA編碼序列設(shè)計(jì)RNA干擾靶點(diǎn)并構(gòu)建特異性小發(fā)夾RNA（p LVTHM，p LV－sh Wnt10b1和p LV－sh Wnt10b2），經(jīng)慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞，Western blot檢測Wnt10b蛋白表達(dá)，CCK－8增殖實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、Hoechst 33342熒光染色、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell小室觀察細(xì)胞增殖、周期、凋亡、遷移及侵襲變化情況。與對照組相比，sh Wnt10b1和sh Wnt10b2的Wnt10b蛋白表達(dá)均呈現(xiàn)下調(diào)，其中sh Wnt10b2下調(diào)更明顯；兩組細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力均受抑制，細(xì)胞凋亡率增加，處于G0－G1期和S期的細(xì)胞數(shù)量增加，其中sh Wnt10b2細(xì)胞活性受抑制更明顯。下調(diào)Wnt10b蛋白表達(dá)可顯著抑制Hep G2細(xì)胞增殖、克隆形成和遷移侵襲能力，阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)凋亡。以上結(jié)果提示，Wnt10b在人肝癌細(xì)胞惡性增殖、凋亡和遷移侵襲等過程中扮演癌基因角色，其可望作為一個(gè)潛在的基因治療靶點(diǎn)，為肝癌臨床防治提供新思路。

37.MTA1沉默對胃癌細(xì)胞增殖和運(yùn)動的影響 原甜甜1衣艷梅2李濟(jì)偉1林斌斌1楊曉1吳民華2廣東醫(yī)學(xué)院：1第一臨床醫(yī)學(xué)院；2組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 湛江524000 雖然胃癌的發(fā)病率在近年來有下降的趨勢，但其仍然是我國及全世界發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤之一。早期胃癌的預(yù)后較好，而進(jìn)展期胃癌，特別是伴有淋巴結(jié)或血道轉(zhuǎn)移者預(yù)后較差，其5年生存率小于50%。因此，探索胃癌發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移的相關(guān)因素，對胃癌的預(yù)后判斷及治療方案的選擇具有重要意義。本研究觀察了轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1（MTA1）基因沉默對人胃癌細(xì)胞SGC7901增殖和遷移侵襲能力的影響，探討MTA1基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。利用脂質(zhì)體法將靶向MTA1的小分子干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染到胃癌細(xì)胞株SGC7901中，運(yùn)用 實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot技術(shù)檢測SGC7901細(xì)胞內(nèi)MTA1的m RNA和蛋白表達(dá)水平，CCK－8法檢測細(xì)胞增殖能力，Transwell小室實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移和侵襲能力。結(jié)果顯示，MTA1 siRNA可有效抑制SGC7901細(xì)胞MTA1基因在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)。CCK－8實(shí)驗(yàn)表明MTA1 siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖不受影響；Transwell小室實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯下降。結(jié)果表明，沉默MTA1表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞株SGC7901遷移和侵襲，而不影響細(xì)胞增殖。由此提示，MTA1在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮重要作用。

38.EGF／EGFR介導(dǎo)的ALC1／CHD1L表達(dá)對肝癌細(xì)胞增殖的影響 李楊 馮麗 白銀山 馬寧芳 廣州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室 廣州511436 Chromodomain Helicase／Adenosine Triphosphatase DNA BindingProtein 1－Like（ALC1／Chd1l）為1q21區(qū)的致癌基因，是肝癌細(xì)胞惡性增殖、間質(zhì)－上皮轉(zhuǎn)化、浸潤轉(zhuǎn)移及惡性轉(zhuǎn)化的一個(gè)關(guān)鍵因素，在多種實(shí)體腫瘤中存在高水平表達(dá)，其表達(dá)調(diào)控是控制肝癌細(xì)胞惡性增殖的關(guān)鍵。表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）及其受體（EGFR）與胚肝發(fā)育和腫瘤發(fā)生有關(guān)，EGF／EGFR信號通路和ALC1／Chd1l之間的調(diào)控關(guān)系目前不清楚。本研究通過ALC1／Chd1l sh RNA干擾、RT－PCR、MTT實(shí)驗(yàn)、免疫組織化學(xué)等方法探討了EGF／EGFR信號通路與ALC1／Chd1l基因在肝癌細(xì)胞中表達(dá)的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)選用人肝癌Hep G2和7402細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)分析所選hEGF最佳適宜濃度和作用時(shí)間，確定表皮生長因子h EGF的有效濃度為100ng／μl，連續(xù)刺激24h后，采用RT－PCR技術(shù)檢測ALC1／CHD1L基因m RNA的表達(dá)量；細(xì)胞免疫熒光顯示7402和Hep G2細(xì)胞中有ALC1／Chd1l與EGFR的共表達(dá)；7402細(xì)胞ALC1／Chd1lmRNA的基礎(chǔ)表達(dá)水平低于Hep G2細(xì)胞，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EGF作用12h后Hep G2和7402細(xì)胞ALC1／Chd1lmRNA的表達(dá)開始增加，24h達(dá)峰值，細(xì)胞的增殖隨之增加，以7402細(xì)胞的效果更為顯著；sh RNA干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲減Hep G2細(xì)胞ALC1／Chd1l后，再次加入h EGF因子，可引起ALC1／Chd1l表達(dá)再次升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示EGF／EGFR信號通路介導(dǎo)了ALC1／CHD1L基因的表達(dá)，從而影響肝癌細(xì)胞的增殖，對于EGF／EGFR信號通路調(diào)控ALC1／Chd1l的機(jī)制有待進(jìn)一步證實(shí)。

39.核轉(zhuǎn)錄因子SP1與腫瘤的關(guān)系 何倩麗1林冬靜2吉林醫(yī)藥學(xué)院：1臨床醫(yī)學(xué)2010級；2組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 吉林132013 特異性蛋白（specificity protein，Sp）是一類廣泛存在的鋅指蛋白超家族成員，通過同源序列C端3個(gè)串聯(lián)的Cys2His2型鋅指結(jié)構(gòu)域識別富含GC／GT盒啟動子區(qū)，并以不同親和力與之結(jié)合，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄過程，參與機(jī)體生理、病理過程的調(diào)控。在Sp家族9個(gè)成員（Sp1～Sp9）中，Sp1蛋白被認(rèn)為是該家族中功能最強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活因子，與REST、AP2、CPBP等形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，對富含GC盒啟動子區(qū)具有很強(qiáng)的親和力?？偨Y(jié)近年來研究發(fā)現(xiàn)，SP1在人類許多腫瘤中高表達(dá)或異常活化，這可能與腫瘤原癌基因、抑癌基因及細(xì)胞周期調(diào)控分子、凋亡抑制蛋白等相關(guān)基因的調(diào)控有關(guān)，探討其對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的影響作用及機(jī)制，主要通過 TGF－β、PI3K／Akt、ERK1／2、Wnt／β－catenin、Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移及血管生成。因此，SP1可能作為多種惡性腫瘤治療及其預(yù)后的潛在指標(biāo)。

40.ω－3多不飽和脂肪酸對結(jié)腸癌細(xì)胞的作用及機(jī)制研究 章坤 胡志梅 時(shí)哲敏 齊海霞 常亞楠 韓亞偉韓曉輝鄭麗娜洪偉 天津醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)系天津300070 結(jié)腸癌的發(fā)病率及死亡率在惡性腫瘤中位居前列，全球以每年超過百萬新增病例的速度遞增，我國結(jié)腸癌的發(fā)病率近年來也迅速升高。已有報(bào)道表明，ω－3多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids，PUFAs）對多種腫瘤有抑制作用。本研究探討ω－3 PUFAs對結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的作用及其機(jī)制。結(jié)果顯示，ω－3 PUFAs抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡，且ω－3 PUFAs的作用具有濃度和時(shí)間依賴性；對ω－3 PUFAs作用機(jī)理的探究發(fā)現(xiàn)，ω－3 PUFAs通過促進(jìn)癌蛋白YAP1的磷酸化，引起YAP1從細(xì)胞核向細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移。ω－3 PUFAs不僅引起YAP1的磷酸化水平升高，同時(shí)降低總YAP1／TAZ的蛋白水平。通過引起癌蛋白YAP1的去激活，ω－3 PUFAs抑制YAP1介導(dǎo)的促增殖和抑凋亡靶基因的表達(dá)，從而抑制結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。通過RNA干擾技術(shù)，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)ω－3 PUFAs促進(jìn)YAP1的磷酸化是通過經(jīng)典Hippo通路的關(guān)鍵分子MST和LATS，而且觀察到ω－3 PUFAs同樣能夠促進(jìn)LATS的磷酸化。通過在人的結(jié)腸癌標(biāo)本和結(jié)腸癌小鼠模型中的進(jìn)一步的研究表明ω－3 PUFAs通過與特定的受體結(jié)合激活Hippo信號通路促進(jìn)YAP1的磷酸化，進(jìn)而抑制結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。

41.核受體介導(dǎo)褪黑素抑制胃癌血管生成 王日雄 宋軍羅建華張慧馬賽君劉卉 周瑞祥 福建醫(yī)科大學(xué)福州350108 腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和預(yù)后均與血管生成相關(guān)。本研究旨在探討乏氧條件下，運(yùn)用CCK－8、ELISA、real time RT－PCR、ICC、WB、siRNA沉默核受體RZR／RORγ等方法研究褪黑素（MLT）抑制胃癌血管生成作用及其與褪黑素核受體的關(guān)系。首先觀察了MLT體外抗人胃癌細(xì)胞增殖及其對MLT核受體的影響：建立不同濃度不同時(shí)間點(diǎn)MLT對人胃癌細(xì)胞株干預(yù)模型，結(jié)果顯示，MLT抑制人胃癌細(xì)胞MGC－803、SGC－7901、AGS增殖，呈時(shí)間劑量依賴性，100μmol／L氯化鈷模擬的化學(xué)性低氧可促進(jìn)人胃癌細(xì)胞SGC－7901增殖；MLT下調(diào)人胃癌細(xì)胞VEGF mRNA與蛋白表達(dá)，同時(shí)下調(diào)核受體RZR／RORγ表達(dá)。然后檢測了MLT體外抗人胃癌細(xì)胞SGC－7901血管生成機(jī)制及MLT核受體RZR／RORγ的作用研究：建立乏氧條件下3 mmol／L濃度MLT干預(yù)24h對人胃癌細(xì)胞SGC－7901影響的體外模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用siRNA技術(shù)沉默ROR／RZRγ能明顯拮抗MLT對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用；乏氧條件下，3 mmol／L MLT干預(yù)24h后明顯下調(diào)胃癌細(xì)胞RZR／RORγ表達(dá)，并下調(diào)SENP1、HIF－1α、VEGF mRNA及蛋白表達(dá)；沉默核受體則逆轉(zhuǎn)該效果。最后分析了MLT體內(nèi)抗荷胃癌祼鼠血管生成及其核受體機(jī)制：應(yīng)用人胃癌細(xì)胞SGC－7901建立荷胃癌祼鼠模型，以不同濃度MLT干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MLT能縮小荷胃癌祼鼠的腫瘤體積，減輕腫瘤重量，達(dá)到抗腫瘤作用；MLT能下調(diào)腫瘤組織核受體RZR／RORγ表達(dá)并下調(diào)SENP1、HIF－1α、VEGF、MVD表達(dá)，抑制腫瘤血管生成；MLT下調(diào)腫瘤組織核受體RZR／RORγ表達(dá)。本研究證實(shí)褪黑素能夠抑制人胃癌細(xì)胞SGC－7901血管生成，其機(jī)制包括通過下調(diào)核受體RZR／RORγ表達(dá)，進(jìn)而抑制SENP1、HIF－1α、VEGF表達(dá)，最終抑制腫瘤血管生成，抑制腫瘤細(xì)胞生長。

42.Influence of estrogen receptorαphosphorylation at serine 309 on male reproductive functionin of mice Wei Jinhua，Ma Binfang，Cheng Pang，Zhao Jie，Zhang Yuanqiang，Li Zhen.Department of Histology and Embryology，The Fourth Military MedicalUniversity，Xi＇an 710032 Recent studies in estrogen receptorα（ERα）knockout mice have demonstrated that the testicle development is abnormal，and that sperm recovered from cauda epididymis exhibit reduced motilities and fail to fertilize eggs in vitro.Phosphorylation at serine 305（S305）site of ERαis sufficient to recruit coactivator SRC1，and to induce ERαactivity in a ligand－independent manner.The ERαS309 site in mice is homologous with ERαS305 in human.This study was to investigate the influence of estrogen receptorαphosphorylation at S309 on male reproductive function of mice.ERαS309A mutant mice were produced by mutating serine into alanine and the fertility of male mice was observed by mating studies.Epididymal sperm motility was detected by com－puter－assisted sperm analyzer and the expression of epididymal micro－environmentrelated genes in efferent ducts were examined by Real－Time PCR and Western blotting.The results showed that adult ERαS309A male mice were subfertility，and that sperm numbers were normal whereas spermmotilities were lower than those in wild type mice.The expression levels of aquaporin 9（AQP9）and carbonic anhydrase 12（CA12），both containing estrogen response element，were reduced in the efferent ducts of ERαS 309A mice.These results indicate that phosphorylation at S305 site might play an important role in the process of ERα－mediated transcription to maintain a stable fluid／ion transportation in epididymal lumen where sperm aquires their motility.This study provides a basis for future research of the effect of S305 phosphorylation in ERαregulation of male reproductive function.

43.TGF－β1對成年大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌雌激素的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制研究 楊倩倩劉鏝利 喬慧蓮 馬靜 李臻第四軍醫(yī)大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 西安710032 正常水平的雌激素在男性生殖系統(tǒng)中同樣發(fā)揮著重要的作用，雌激素在睪丸局部主要由間質(zhì)細(xì)胞（Leydig cells，LCs）合成，但其分泌的具體調(diào)控機(jī)制并不完全清楚。轉(zhuǎn)化生長因子－β1（Transforming growth factor－β1，TGF－β1）在睪丸的不同發(fā)育階段均有表達(dá)，通過自分泌或旁分泌的方式調(diào)節(jié)睪丸發(fā)育和精子發(fā)生。我們采用Percoll連續(xù)密度梯度離心法提取、純化并原代培養(yǎng)成年大鼠睪丸LCs，放免分析不同劑量TGF－β1對Leydig細(xì)胞性激素合成的影響；采用氚水釋放實(shí)驗(yàn)檢測雌激素合成的限速酶芳香化酶活性；并通過Western blot和Real－time PCR方法檢測芳香化酶編碼基因CYP19，及CYP19上PII啟動子的轉(zhuǎn)錄因子SF－1、CREB的表達(dá)情況能否添加R2C細(xì)胞中的實(shí)驗(yàn)；利用間接免疫熒光技術(shù)檢測TGF－β1作用后，縫隙連接蛋白43（connexin43，Cx43）在Leydig細(xì)胞中的分布情況；采用 Western blot對Cx43蛋白磷酸化亞型含量進(jìn)行檢測；采用熒光漂白后恢復(fù)實(shí)驗(yàn)對Cx43介導(dǎo)的GJIC進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，原代培養(yǎng)的Leydig細(xì)胞經(jīng)不同劑量TGF－β1處理后，細(xì)胞上清中E2和T含量皆低于正常對照組，并呈劑量依賴趨勢。TGF－β1作用后，芳香化酶的活性降低，其編碼基因CYP19及其轉(zhuǎn)錄因子SF－1、CREB在翻譯和轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)均受到不同程度的抑制。且經(jīng)TGF－β1處理后，Cx43表達(dá)則主要定位于胞漿中，隨著其劑量增大及時(shí)間延長，磷酸化Cx43蛋白定量明顯增多。TGF－β1可顯著下調(diào)Leydig細(xì)胞間的GJIC。以上結(jié)果提示，TGF－β1信號通路對CYP19的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是影響LCs中雌激素分泌的重要機(jī)制，并且TGF－β1影響LCs間的縫隙鏈接通訊功能。

44.TET家族在小鼠精原干細(xì)胞的表達(dá)分析 白銀山劉珊珊董文偉馮麗李楊馬寧芳 廣州醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室廣州511436 小鼠精原干細(xì)胞（mouse spermatogonial stem cells，mSSCs）具有自我更新、分化和去分化的生物學(xué)特征，成為干細(xì)胞調(diào)控、精子發(fā)生和體細(xì)胞重編程相關(guān)機(jī)制研究的重要材料，然而關(guān)于mSSCs表觀調(diào)控機(jī)制還并不清楚。TET（ten－eleven translocation，TET）家族（包括TET1、TET2和TET3）可以催化5－甲基胞嘧啶（5－methylcytosine，5－mC）生成5－羥甲基胞嘧啶（5－h(huán)ydroxymethylcytosine，5－h(huán)mC），促進(jìn)基因組DNA的去甲基化，這個(gè)表觀調(diào)控過程涉及干細(xì)胞的自我更新、分化、去分化和癌化等眾多方面。然而TET家族介導(dǎo)的甲基化調(diào)控在mSSCs中的作用也未明確。本文通過RT－PCR、QPCR和免疫組織化學(xué)等方法初步分析了TET家族在mSSCs表達(dá)情況。RT－PCR檢測結(jié)果顯示TET1／2／3在mSSCs中均存在表達(dá)；QPCR結(jié)果顯示mSSCs中TET3表達(dá)水平高，TET1／2表達(dá)水平較低；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示新生小鼠睪丸組織內(nèi)TET3較高水平表達(dá)在新生小鼠生殖母細(xì)胞（gonocytes）和隨后出現(xiàn)的mSSCs中；成年小鼠睪丸組織中，TET3表達(dá)在各類生精細(xì)胞中，但處于基底膜處的細(xì)胞表達(dá)水平較高，隨著向精子分化，表達(dá)依次降低。與多能的小鼠胚胎干細(xì)胞（mouse embryonic stem cells，mESCs）對比，TET1／2在mSSCs中表達(dá)水平很低，而TET3高水平表達(dá)。這些結(jié)果暗示了TET家族在mSSCs自我更新、向精子分化和體外去分化過程中存在著潛在的表觀調(diào)控作用，更深入的研究有待進(jìn)一步證實(shí)。

45.染色體重塑基因CHD1L對新生小鼠精原干細(xì)胞增殖的影響 劉珊珊 馮麗 董文偉 白銀山 馬寧芳廣州醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室廣州511436 小鼠精原干細(xì)胞的自我更新與分化過程受到多個(gè)基因的調(diào)控，本文旨在探討染色體重塑基因CHD1L（chromodomain helicase／ATPase DNA binding protein 1－like）在睪丸組織的表達(dá)及對維持新生小鼠精原干細(xì)胞自我更新的機(jī)制。取不同發(fā)育階段雄性C57小鼠睪丸組織制作石蠟切片；二步法消化免疫磁珠分離新生5－7d雄性C57小鼠精原干細(xì)胞鋪片進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光及后續(xù)分子實(shí)驗(yàn)。采取qRT－PCR、Western Blot、免疫熒光等實(shí)驗(yàn)方法檢測CHD1L在新生小鼠睪丸中的表達(dá)；通過CHD1L－sh RNA慢病毒干擾技術(shù)研究CHD1L對相關(guān)干性分子表達(dá)的調(diào)控作用。qRT－PCR結(jié)果顯示，CHD1L mRNA在睪丸組織中有高表達(dá)，并伴隨年齡的增長呈現(xiàn)遞增的趨勢，而CHD1L蛋白表達(dá)則出現(xiàn)相反的趨勢；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，CHD1L陽性細(xì)胞位于曲細(xì)精管基底膜內(nèi)側(cè)，并與MVH（生殖細(xì)胞特異性標(biāo)記）、干性相關(guān)基因OCT4、PLZF、GFRa1（精原干細(xì)胞特異性標(biāo)記）共表達(dá)；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾CHD1L表達(dá)后明顯下調(diào)OCT4，PLZF，GFRa1的表達(dá)；干擾組精原干細(xì)胞克隆數(shù)及Brdu陽性細(xì)胞比率明顯低于對照組；以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，CHD1L表達(dá)于新生小鼠睪丸未分化精原細(xì)胞內(nèi)，與精原干細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。

46.小鼠精子成熟過程唾液酸分子的表達(dá)變化 馬雪倩1馬芳1，21四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院 成都610041，2四川大學(xué)華西第二醫(yī)院 成都610000 唾液酸是蛋白質(zhì)合成后糖基化修飾的一種常見形式，普遍存在于多種蛋白肽鏈上，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的性質(zhì)及影響其功能。最新研究表明，哺乳動物成熟精子表面存在著豐富的唾液酸分子，其類型的不同及含量的變化在精子成熟過程中起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菫榱嗣鞔_小鼠精子在附睪不同區(qū)域成熟過程中，其表面唾液酸含量與類型的變化，初步探索唾液酸對精子存活的保護(hù)作用及機(jī)制。實(shí)驗(yàn)采用C57BL／6性成熟的雄性小鼠15只，體重30g（8－10w）。分別取附睪不同部位（頭部、體部、尾部）的附睪液，采用HPLC檢測精子表面唾液酸分子的含量以及類型，Western blot檢測精子表面唾液酸蛋白的類型，利用熒光染色測定不同部位的精子活力。HPLC檢測發(fā)現(xiàn)，小鼠附睪中精子表面存在N－乙酰神經(jīng)氨酸和羥－乙酰神經(jīng)氨酸兩種唾液酸形式，其含量從附睪頭部至尾部顯著增加；Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)α2－3，α2－6連接的唾液酸表達(dá)從附睪頭部至尾部顯著增加；隨著唾液酸及其連接表達(dá)的增加，精子的活力也增加。由此可見，小鼠精子表面有非常豐富的糖分子，其末端的唾液酸分子尤其豐富，所攜帶的負(fù)電荷與精子的運(yùn)動能力有關(guān)。從頭部至尾部精子的唾液酸逐漸增加，活力上升，推測精子表面的唾液酸化在附睪中呈動態(tài)變化，可能對精子受孕能力的儲備有一定的作用，即精子在附睪中從形態(tài)到功能逐漸成熟。

47.MAPK磷酸酶－1調(diào)節(jié)睪丸閉鎖蛋白o(hù)ccludin功能的機(jī)制研究 潘藝青 徐晨 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系 上海市生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海200025 睪丸的免疫調(diào)控系統(tǒng)是一個(gè)多因素構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)體系，內(nèi)在因素相互影響、相互作用共同維持睪丸的免疫自穩(wěn)，為精子生成提供特定的微環(huán)境。在炎癥及感染等病理狀態(tài)下，免疫系統(tǒng)不僅能積極動員對抗外來入侵，還可能打破內(nèi)在平衡而發(fā)生自身免疫反應(yīng)，嚴(yán)重則導(dǎo)致免疫性不育。故此生殖免疫調(diào)控機(jī)制越來越受到關(guān)注，阻止自身免疫不良結(jié)局也成為亟待解決的問題。MAPK磷酸酶－1（MKP－1）屬于雙特異性磷酸酶家族，可選擇性使MAPK信號通路分子中磷酸絲／酪氨酸殘基去磷酸化，下調(diào)炎癥反應(yīng)，在免疫調(diào)控中發(fā)揮非常重要的負(fù)調(diào)節(jié)功能。然而MKP－1分子在生殖系統(tǒng)中的功能研究甚少，MKP－1在睪丸Sertoli細(xì)胞中的功能迄今未見報(bào)道。本研究首先觀察MKP－1分子在小鼠睪丸組織的時(shí)空表達(dá)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)出生后小鼠睪丸組織即表達(dá)MKP－1分子，其主要定位于生精小管Sertoli細(xì)胞，精子細(xì)胞弱表達(dá)。通過以MKP－1基因敲除（KO）小鼠作為研究對象，觀察MKP－1 KO小鼠生殖系統(tǒng)表型，發(fā)現(xiàn)MKP－1 KO小鼠精子活動率和前向運(yùn)動力降低、精子畸形率明顯增加；血－睪屏障結(jié)構(gòu)改變、通透性增加。為進(jìn)一步研究睪丸組織中MKP－1作用靶分子，觀察KO小鼠睪丸組織緊密連接蛋白（如閉鎖蛋白o(hù)ccludin）表達(dá)改變及相關(guān)MAPK信號分子的作用規(guī)律，發(fā)現(xiàn)MKP－1可通過MAPK信號分子調(diào)節(jié)閉鎖蛋白o(hù)ccludin的功能，參與調(diào)節(jié)Sertoli細(xì)胞緊密連接動力學(xué)改變。上述結(jié)果為睪丸生殖免疫調(diào)控機(jī)制的研究提供新的線索和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

48.肥胖對雄性小鼠生育的影響及其機(jī)制研究 凡永1劉悅1薛珂1顧國寶 樊衛(wèi)民2徐雅麗1，3丁之德11上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系 上海市生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2閘北區(qū)中心醫(yī)院，3瑞金醫(yī)院生殖中心 上海200025肥胖是一種可嚴(yán)重?fù)p害青少年和成人健康的綜合代謝性疾病，可誘發(fā)包括心血管疾病、2型糖尿病、高血壓和癌癥在內(nèi)的多種疾病。盡管肥胖對女性生殖或者卵細(xì)胞發(fā)育的不良影響已成共識，但其對男性生育力的危害還尚未定論。本研究旨在于探索高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖是否會損傷雄性生育力，并從動物模型上進(jìn)一步揭示其作用機(jī)制。高脂喂養(yǎng)雄性C57BL／6小鼠10周建立起肥胖模型。與正常飼料喂養(yǎng)的雄鼠相比，肥胖雄鼠的精子活動力以及前向活動力顯著下降，其精子畸形率明顯上升，精子的頂體反應(yīng)發(fā)生率下降；同時(shí)，肥胖雄鼠雄激素水平下降，雌激素水平上升。由此可見，精子功能參數(shù)的改變有力地證明了肥胖雄鼠的生育力受到損傷，此結(jié)論也被與肥胖雄鼠合籠配對的實(shí)驗(yàn)后雌鼠其受孕率下降所證實(shí)。睪丸形態(tài)學(xué)的超微結(jié)構(gòu)分析顯示，肥胖鼠睪丸生精上皮嚴(yán)重空泡化，生精細(xì)胞間以及生精細(xì)胞與支持細(xì)胞間的細(xì)胞連接松散。進(jìn)一步的Western blot分析表明，肥胖鼠睪丸中構(gòu)成血睪屏障的相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、ZO－1及androgen receptor顯著降低，而囊泡運(yùn)輸相關(guān)蛋白clathrin顯著升高，血睪屏障的完整性明顯受損。綜上，肥胖可致雄性小鼠精液中精子功能參數(shù)和性激素水平顯著下降，其結(jié)果可導(dǎo)致小鼠生育力受損，而血睪屏障的破壞可能是肥胖影響雄性生育力機(jī)制中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。

49.Bmp4／smad信號通路對小鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖和凋亡的影響 丁祥云1郝晶21山東醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 臨沂276000，2山東大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 濟(jì)南250012 骨形態(tài)蛋白4（Bone morphology protein 4，Bmp4）是調(diào)控卵泡發(fā)育的一種關(guān)鍵基因，但其對顆粒細(xì)胞的調(diào)控作用尚不清楚。因此，我們探討了Bmp4／smad信號通路對小鼠顆粒細(xì)胞增殖與凋亡的影響及其可能的作用機(jī)制。首先采用免疫組織化學(xué)方法，檢測到生后各周小鼠卵巢中均表達(dá)Bmp4及p－Smad1／5／8，尤其新生至3w小鼠卵巢中各基因表達(dá)較多，隨后表達(dá)逐漸減弱。然后，通過卵泡穿刺法獲取小鼠顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)，分對照組、Bmp4組（添加重組Bmp4）和添加Bmp4抑制劑組。各組分別于培養(yǎng)24h、48h后，Brdu及Mtt結(jié)果顯示Bmp4抑制劑組顆粒細(xì)胞增殖與存活率均高于對照組和Bmp4組；TUNEL染色檢測凋亡的顆粒細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比率，Bmp4組明顯高于對照組和Bmp4抑制劑組；免疫熒光及 Western blotting結(jié)果顯示，加入Bmp4可明顯促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)p－Smad1／5／8入核。以上研究結(jié)果表明，Bmp4可促進(jìn)小鼠顆粒細(xì)胞凋亡、抑制其增殖與存活，并可能通過激活Bmp4／smad信號通路而發(fā)揮作用。

50.雙酚A影響胚泡植入的作用機(jī)制研究 潘曉燕 李質(zhì)馨 王喜艷 竇肇華 吉林醫(yī)藥學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 吉林132013 雙酚A（Bisphenol A，BPA）是世界上使用最廣泛的工業(yè)化合物之一，從礦泉水瓶、醫(yī)療器械、食品包裝的內(nèi)里、罐頭內(nèi)包裝、嬰兒用瓶、牙科填充劑以及其他數(shù)百種日用品中都含有BPA。BPA結(jié)構(gòu)類似于雌二醇和己烯雌酚，具有弱的雌激素活性，其在機(jī)體中發(fā)揮作用的方式與雌激素相似，主要是通過與靶細(xì)胞上的雌激素受體結(jié)合而干擾機(jī)體正常的生殖功能。為闡明BPA對胚泡植入的影響及其作用機(jī)制，本研究將昆明孕鼠從D0.5到D4.5分別灌服200，400，和600 mg／kg／d的BPA，統(tǒng)計(jì)胚泡的著床點(diǎn)數(shù)，檢測孕鼠體內(nèi)的雌激素水平、子宮內(nèi)膜上雌激素受體和粘附分子的表達(dá)以及囊胚上粘附分子的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)400 mg／kg／d BPA能明顯降低孕鼠著床點(diǎn)數(shù)，600 mg／kg／d BPA抑制胚泡著床，沒有觀察到著床點(diǎn)；D5孕鼠血清中的雌激素水平?jīng)]有顯著差異，BPA沒有影響卵巢對雌激素的合成和分泌；但在400和600 mg／kg／d BPA處理組，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中的雌激素受體α表達(dá)較對照組顯著減少，影響雌激素對子宮內(nèi)膜發(fā)育的調(diào)控作用。此外，200 mg／kg／d BPA處理組子宮內(nèi)膜和囊胚中粘附分子integrinβ3和trophinin的表達(dá)與對照組沒有顯著差異，而400 mg／kg／d和600 mg／kg／d BPA處理組孕鼠子宮內(nèi)膜和囊胚中integrinβ3和trophinin的表達(dá)顯著降低。由此可見，高濃度BPA顯著降低子宮內(nèi)膜中雌激素受體的表達(dá)，影響雌激素對植入期子宮內(nèi)膜發(fā)育的調(diào)控作用，使子宮內(nèi)膜和囊胚細(xì)胞中粘附分子integrinβ3和trophinin的表達(dá)顯著降低，從而影響了胚泡與子宮內(nèi)膜之間的粘附，造成著床點(diǎn)數(shù)量顯著降低。

51.DMBG對PCOS大鼠卵巢中Akt／HIF－1α通路的影響 王凡 陳佳潔 張正紅 王昭凱 王正朝 福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福建省發(fā)育與神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室福州350007 為了闡明DMBG對PCOS大鼠卵巢中Akt／HIF－1α通路的影響，本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)與蛋白印跡方法對來曲唑誘導(dǎo)的PCOS大鼠卵巢中AKT／HIF－1α信號通路的表達(dá)情況進(jìn)行分析，并通過DMBG藥物干預(yù)對該信號通路在PCOS發(fā)生及其治療中的作用進(jìn)行研究。首先，18只6周齡有規(guī)律4天動情周期的清潔級SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組、溶劑對照組和PCOS模型組，每組6只，重復(fù)兩次，通過陰道涂片與卵巢組織學(xué)對PCOS大鼠模型的建立進(jìn)行確認(rèn)。然后，再利用上述PCOS建模方法進(jìn)行DMBG藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)，18只6周齡有規(guī)律4天動情周期的清潔級SD大鼠隨機(jī)分為治療對照組、PCOS模型組和DMBG干預(yù)組，每組6只，重復(fù)兩次。實(shí)驗(yàn)動物的卵巢一側(cè)固定，用于HE染色及免疫組織化學(xué)染色；另一側(cè)冷凍，用于功能蛋白的表達(dá)檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCOS模型組大鼠均處于動情周期間期，表明沒有排卵；卵巢組織學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組大鼠卵巢除了含有卵泡外還含有許多黃體，PCOS模型組大鼠卵巢含有大量的排卵前卵泡，而DMBG干預(yù)組大鼠卵巢中還有少量的黃體；免疫組織化學(xué)結(jié)果表明HIF－1α、ET－2，Akt及兩個(gè)不同位點(diǎn)磷酸化的Akt蛋白主要在卵泡顆粒細(xì)胞中表達(dá)，且PCOS大鼠卵巢中具有不同程度的降低。蛋白印跡結(jié)果進(jìn)一步表明Akt／HIF－1α通路蛋白在PCOS大鼠卵巢中均有不同程度的降低，DMBG可以拯救這些蛋白的表達(dá)，從而緩解PCOS的癥狀。綜上所述，在PCOS發(fā)生過程中大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中Akt／HIF－1α通路在不同程度上被抑制或損壞了，DMBG藥物干預(yù)可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)該現(xiàn)象，緩解PCOS癥狀（本研究受教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃NCET－120614資助）。

52.非標(biāo)記蛋白組學(xué)揭示能量代謝和局部粘附調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的容受性 陳騫 徐晨 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系 上海市生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海200025 女性子宮內(nèi)膜根據(jù)月經(jīng)周期激素水平的周期變化也呈現(xiàn)周期性變化，這種周期性變化對子宮內(nèi)膜容受態(tài)的建立和胚胎的順利著床是至關(guān)重要的。然而，目前對子宮內(nèi)膜容受態(tài)建立的分子機(jī)制仍然知之甚少。本研究中，我們采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LC－MS）為基礎(chǔ)的非標(biāo)記定量（label－free quantitative）蛋白組學(xué)分析的方法，對正常育齡期婦女的增生期和分泌中期（種植窗期）子宮內(nèi)膜進(jìn)行了比較分析（每組6例）。結(jié)果共檢測到2138個(gè)蛋白，其中317個(gè)蛋白在增生期和種植窗期之間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。顯著差異蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析顯示腦型肌酸激酶（CKB）在種植窗期的上調(diào)可能與子宮內(nèi)膜的容受性相關(guān)，而細(xì)胞間黏附相關(guān)蛋白則整體下調(diào)。KEGG信號通路分析的結(jié)果與蛋白間相互作用的網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果一致。包括α－actinin（ACTN），細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，整合素αV等蛋白在種植窗期均表達(dá)下調(diào)，這種細(xì)胞間局部粘附水平的下降可能有助于胚胎的著床。Western blot分析和免疫組織化學(xué)進(jìn)一步驗(yàn)證CKB蛋白在種植窗期上調(diào)和ACTN在種植窗期下調(diào)。本研究結(jié)果展示了子宮內(nèi)膜從增生期到分泌期蛋白水平的顯著變化，這一結(jié)果有助于揭示人類子宮內(nèi)膜容受態(tài)建立的關(guān)鍵生物機(jī)制（如能量代謝和局部粘附）。

53.血清E2、P及LIF在異位妊娠早期診斷中的作用 晏長榮 異位妊娠是婦科常見急腹癥之一。血清β－HCG檢測雖是目前早期診斷異位妊娠的重要方法，但在日常工作中有時(shí)尚不足以明確、及時(shí)地診斷。本文聯(lián)合檢測血清雌二醇（E2）和孕酮（P）及白血病抑制因子（LIF）水平，以探討E2、P及LIF在異位妊娠早期診斷中的作用。選擇湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院和十堰市人民醫(yī)院等婦科就診的女性，按入選標(biāo)準(zhǔn)將患者分為異位妊娠組（EP組）80例，先兆流產(chǎn)組（TA組）105例，正常宮內(nèi)早孕組（NIUP組）130例。采用微粒子酶免疫分析技術(shù)、酶免疫技術(shù)和放射免疫分析分別對血清中E2、P和LIF水平進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，3組患者血清中E2、P、LIF在NIUP組最高，TA組次之，EP組最低，3組兩兩比較，差異均有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.我們發(fā)現(xiàn)血清E2、P、LIF均有助于鑒別正常妊娠與異位妊娠，可作為臨床早期診斷異位妊娠的輔助指標(biāo)。

54.乙醇誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞中的atrogin－1表達(dá)的研究 初海鷹 于麗君 舒畫 馬海英 周欣 金偉 大連醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 大連116044 酒精相關(guān)的肌病特點(diǎn)是嚴(yán)重的骨骼肌生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)變化與肌萎縮。乙醇在機(jī)體代謝過程中產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）和自由基，引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化。泛素連接酶是骨骼肌萎縮中的關(guān)鍵酶，目前已將泛素連接酶E3s中的Atrogin－1作為檢測肌萎縮發(fā)生的早期生物標(biāo)記物。本實(shí)驗(yàn)采用乙醇作用于C2C12成肌細(xì)胞建立急性酒精中毒模型，運(yùn)用活性氧檢測和Western blot檢測技術(shù)，觀察乙醇處理C2C12成肌細(xì)胞前后ROS、Atrogin－1、P38蛋白的變化，及給予P38通路的抑制劑后Atrogin－1的表達(dá)變化，分析乙醇對C2C12成肌細(xì)胞的氧化損傷和影響Atrogin－1的表達(dá)機(jī)制。結(jié)果顯示乙醇（100 mmol／L）作用于C2C12成肌細(xì)胞24小時(shí)后，ROS水平升高，與正常組有顯著性差異；在乙醇（100 mmol／L）作用于細(xì)胞8－24小時(shí)中，Atrogin－1蛋白水平與對照組相比，均有顯著性差異，且在8小時(shí)表達(dá)最多；乙醇（100 mmol／L）作用C2C12細(xì)胞8小時(shí)后，磷酸化蛋白P－38水平明顯升高，與對照組有顯著性差異；加入P－38通路的特異性抑制劑SB203580后，與乙醇處理組相比，Atrogin－1蛋白水平明顯降低。有此提示，乙醇可引起C2C12成肌細(xì)胞中活性氧產(chǎn)生的增加，誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)；ROS可通過MAPK信號通路里的P－38途徑引起Atrogin－1蛋白水平升高。本研究為探索骨骼肌萎縮的發(fā)生機(jī)制提供新的思路。

55.Mir－181a在缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬中的作用及機(jī)制研究 丁寶龍 雋兆東 管英俊 陳燕春接琳琳周風(fēng)華 濰坊醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 濰坊261053 本研究利用原代培養(yǎng)Wistar大鼠乳鼠心肌細(xì)胞和H9C2心肌細(xì)胞系觀察mir－181a在缺血再灌注所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬中的作用及其機(jī)制。通過缺氧10h復(fù)氧2h，體外模擬缺血再灌注損傷，實(shí)時(shí)定量PCR測定原代心肌細(xì)胞和H9C2細(xì)胞內(nèi)mir－181a在缺血再灌注前后的表達(dá)變化。將H9C2細(xì)胞隨機(jī)分為4組，分別轉(zhuǎn)染mir－181a up（up組）、mir－181a control up（con up組）、mir－181a down（down組）和 mir－181a control down（con down組）4種質(zhì)粒，模擬缺血再灌注損傷后，通過倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染24h和48h時(shí)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)測定各組在轉(zhuǎn)染24h和48h時(shí)mir－181a的變化，免疫印跡法測定各組轉(zhuǎn)染24h和48h時(shí)的Atg5（Atg5為mir－181a的靶基因）和LC3II的表達(dá)變化。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，在缺血再灌后，原代wistar大鼠心肌細(xì)胞與H9C2細(xì)胞的mir－181a表達(dá)降低，說明mir－181a參與缺血再灌注損傷的調(diào)控。細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示24h和48h時(shí)各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較高、細(xì)胞存活率好。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24h和48h時(shí)up組mir－181a的表達(dá)均高于con up組，而down組mir－181a的表達(dá)均低于con down組。免疫印跡結(jié)果顯示24h和48h時(shí)up組Atg5和LC3II均低于con up組，而down組高于con down組，即上調(diào)mir－181a后，Atg5蛋白反而下降，而下調(diào)mir－181a后，Atg5蛋白則升高。結(jié)果表明，mir－181a參與缺血再灌注損傷的調(diào)控，并通過負(fù)性調(diào)控Atg5的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對自噬的調(diào)節(jié)。

56.自噬相關(guān)基因Atg7在環(huán)境毒素MPTP引起的中腦多巴胺神經(jīng)元損傷中的作用 牛雪園 溫州醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 神經(jīng)科學(xué)研究所 溫州325035 自噬與帕金森病的發(fā)病進(jìn)程有著一定的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)采用5月齡自噬相關(guān)基因Atg7條件性敲除小鼠TH－cre Atg7 flox／flox小鼠和野生型（wildtype，WT）小鼠，采用隨機(jī)化原則分為4組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究：TH－cre Atg7 flox／flox小鼠生理鹽水注射組、TH－cre Atg7 flox／flox小鼠MPTP注射組、WT生理鹽水注射組和WT MPTP注射組。在連續(xù)慢性造模5周后，進(jìn)行足跡實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)、曠場實(shí)驗(yàn)等行為學(xué)檢測，酪氨酸羥化酶（Th）免疫組織化學(xué)染色對中腦黑質(zhì)多巴胺殘存神經(jīng)元計(jì)數(shù)和紋狀體光密度分析，免疫印跡法對帕金森病病理學(xué)特征α－突觸核蛋白量進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，條件性敲除Atg7小鼠中腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元數(shù)目下降，說明基本自噬對于多巴胺神經(jīng)元正常存活起著重要作用；對造模情況進(jìn)行免疫蛋白印跡分析顯示，WT MPTP注射組α－突觸核蛋白量與WT生理鹽水注射組相比增加顯著，說明造模成功。行為學(xué)分析顯示，與WT MPTP注射組相比，TH－cre Atg7 flox／flox小鼠 MPTP注射組步態(tài)不平穩(wěn)性得到了部分補(bǔ)償；黑質(zhì)神經(jīng)元計(jì)數(shù)的結(jié)果顯示，TH－cre Atg7 flox／flox小鼠MPTP注射組殘存神經(jīng)元胞體數(shù)高于WT MPTP注射組；紋狀體光密度分析結(jié)果也同樣顯示了自噬敲除后光密度得到了部分補(bǔ)償。以上結(jié)果說明抑制自噬可減弱于MPTP的敏感性，表明自噬在MPTP致帕金森病進(jìn)程中可能對神經(jīng)元有一定的損傷作用。

57.干預(yù)自噬小鼠LSK數(shù)字基因組表達(dá)譜的變化 林巍巍 陳穎 李奕 談玲 王曉冬 南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室南通226001 電離輻射可導(dǎo)致造血系統(tǒng)細(xì)胞的DNA損傷，影響基因表達(dá)進(jìn)而導(dǎo)致造血干細(xì)胞功能受損。在干預(yù)小鼠的自噬水平對輻照后造血系統(tǒng)的保護(hù)實(shí)驗(yàn)中，我們已經(jīng)證明自噬對造血系統(tǒng)有一定的保護(hù)作用。但是，其機(jī)理和可能的調(diào)節(jié)途徑尚不清楚。為了闡明自噬機(jī)制在DNA損傷及修復(fù)中基因表達(dá)和調(diào)控的影響，本實(shí)驗(yàn)利用華大基因公司數(shù)字基因組表達(dá)譜（RNA－Seq），分析自噬提高型（RAPA組）、自噬缺失型（Atg7－／－組）和野生型小鼠（Ctrl組）3組造血干細(xì)胞（Linege－，Sca－1＋，c－Kit＋，LSK）基因表達(dá)的變化并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。通過對3組樣品的差異表達(dá)基因的兩兩比較，找到77個(gè)基因在Atg7－／－組中表達(dá)最高，而在RAPA組表達(dá)最低；204個(gè)基因在Atg7－／－組中表達(dá)最低，而在RAPA組表達(dá)最高。其差異倍數(shù)（log2｜fold＿change｜＞2）和顯著水平（q＿value＜0.05）兩個(gè)水平，挑選出 Atg7－／－組高表達(dá)的22個(gè)表達(dá)差異轉(zhuǎn)錄本，GO分析確定這些差異基因行使造血、細(xì)胞的死亡、細(xì)胞周期對氧壓力的防御反應(yīng)有關(guān)的生物學(xué)功能。KEGG pathway注釋這些差異基因主要參與細(xì)胞周期和DNA的復(fù)制等一些信號通路。選取與DNA修復(fù)、DNA損傷的反應(yīng)和應(yīng)對電離輻射反應(yīng)有關(guān)的基因在3個(gè)組中的表達(dá)進(jìn)行聚類分析，并運(yùn)用Real time PCR技術(shù)驗(yàn)證其中13個(gè)基因的差異表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與RNA－Seq測序結(jié)果基本一致，其中ATM及其引發(fā)下游HR或NHEJ兩條修復(fù)途徑中的Rad51和lig4的基因表達(dá)量在RAPA組中表達(dá)最高，而在Atg7－／－組表達(dá)最低，但p53的表達(dá)卻是RAPA組增高，Atg7－／－組表達(dá)最高。我們推測預(yù)激活自噬機(jī)制可以提高LSK的損傷應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制和損傷修復(fù)機(jī)制，也促進(jìn)p53的表達(dá)提高細(xì)胞生存率，促進(jìn)DNA修復(fù)。而自噬缺陷的LSK這些參與損傷應(yīng)激和修復(fù)機(jī)制的基因表達(dá)都相應(yīng)減少，而ROS水平的增加和p53表達(dá)的明顯增高可進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。這為今后深入研究自噬對造血系統(tǒng)的輻照保護(hù)的分子機(jī)制提供了思路。

58.胚胎期小鼠腎組織的形態(tài)學(xué)研究 顧玲 陳雪 叢敬 張婕 田瑩瑩 翟效月 中國醫(yī)科大學(xué)組織與胚胎學(xué)教研室 沈陽110122 腎臟發(fā)生經(jīng)歷前腎、中腎和后腎3個(gè)階段，小鼠后腎結(jié)構(gòu)的發(fā)生始于胚胎（E）10.5天。通過觀察其后腎胚胎期發(fā)育的組織學(xué)特征，可揭示早期腎發(fā)育中微細(xì)結(jié)構(gòu)的形態(tài)演變規(guī)律。本研究收集E12、E14、E16、E18天胎齡小鼠腎臟，4%多聚甲醛浸泡固定，石蠟包埋并5μm連續(xù)切片，病理切片掃描儀獲取數(shù)字圖像，計(jì)算機(jī)配準(zhǔn)，C語言編程，追蹤并觀察腎微細(xì)結(jié)構(gòu)。E12天，小鼠后腎中央由于輸尿管芽侵入出現(xiàn)髓質(zhì)，可見間充質(zhì)細(xì)胞稀疏分布，周圍是致密的基質(zhì)細(xì)胞。隨著腎發(fā)育，從腎被膜下至皮髓交界處的整個(gè)皮質(zhì)區(qū)出現(xiàn)了依次分布的生腎區(qū)及Ⅰ至Ⅴ期腎單位。輸尿管芽分支增多，其芽泡分布于被膜下的生腎區(qū)。與之相連接的腎單位數(shù)目也隨發(fā)育而增多。小鼠出生前（E18天），腎髓質(zhì)仍可見大量梯狀排列的間充質(zhì)及垂直其中的髓襻等結(jié)構(gòu)，其數(shù)量遠(yuǎn)少于成年腎臟髓質(zhì)中的髓襻。皮髓質(zhì)中血管網(wǎng)稀疏分布。綜上，小鼠后腎中髓質(zhì)出現(xiàn)早于皮質(zhì)，而皮質(zhì)發(fā)育快于髓質(zhì)，出生前髓質(zhì)發(fā)育遠(yuǎn)沒完成，但已有部分成熟結(jié)構(gòu)，提示其髓質(zhì)尿液濃縮功能的完善在生后完成。

59.小鼠腎近端小管與出球微動脈的三維重建 陳雪任昊楊蓓林庚翟效月 中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組胚教研室沈陽110122 為探討小鼠皮質(zhì)微循環(huán)分布與重吸收功能的關(guān)系，本研究三維重建了腎近端小管和出球微動脈的走行，分析其走行特點(diǎn)及毗鄰關(guān)系。C57／BL／6J小鼠灌流固定后樹脂812包埋，垂直腎長軸連續(xù)半薄切片，甲苯胺藍(lán)染色，顯微鏡下獲取數(shù)字圖像，計(jì)算機(jī)配準(zhǔn)，C語言編程，追蹤并三維重建近端小管和出球微動脈走行。在皮質(zhì)迷路中，近端小管起始段在離開腎小球后，先向被膜方向走行約100～1400μm后返折，在各自腎小球周圍盤曲并占據(jù)相對獨(dú)立的區(qū)域。在髓放線中，近端小管直部的走行有明顯的層次：來自皮質(zhì)淺層腎單位的近端小管直部走行于中央，來自皮質(zhì)深層腎單位的近端小管直部則依次走行在其外圍。所有近端小管都止于腎外髓外帶與內(nèi)帶的交界處，并移行為髓袢降支細(xì)段。出球微動脈的走行與其腎小球在皮質(zhì)分布的位置有關(guān)。其共同之處是，在形成球后毛細(xì)血管網(wǎng)之前都有一支向被膜方向走行一段距離。淺表與中間皮質(zhì)腎單位的出球微動脈向被膜走行10～260μm。而來自近髓腎單位的出球微動脈向被膜走行120～250μm。但是，中間皮質(zhì)腎小球的出球微動脈另有一分支出球后短暫走行即形成毛細(xì)血管網(wǎng)；而近髓腎小球除上述兩支外，另有一支伸入髓質(zhì)構(gòu)成直小血管下降支。此外，來自同一腎單位的近端小管與出球微動脈并沒有明顯的伴行關(guān)系。綜上，來自腎皮質(zhì)不同水平的近端小管與出球微動脈的空間走行具有各自的規(guī)律與特點(diǎn)。出球微動脈形成的球后毛細(xì)血管網(wǎng)依腎小球在皮質(zhì)中的分布而呈現(xiàn)區(qū)域支配：而不依自身腎單位近端小管的走行而分布，提示皮質(zhì)腎小管重吸收功能的微循環(huán)可能是整體而非單一腎單位性的調(diào)節(jié)。

60.小鼠腎近端小管形態(tài)計(jì)量學(xué)研究 梁非 王慧 顧玲 翟效月 中國醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室沈陽110122 腎近端小管具有較強(qiáng)的重吸收功能，也是腎缺血、缺氧及高糖應(yīng)激中易受損傷也易被修復(fù)的節(jié)段。根據(jù)對人、大鼠及兔近端小管形態(tài)計(jì)量學(xué)的研究，按超微結(jié)構(gòu)的不均一性一般將近端小管分為S1、S2和S3三段。S1段起始于腎小球，構(gòu)成近端小管曲部的約2／3；S2段由剩余的曲部和直部的起始部分構(gòu)成；剩余的近直小管則為S3段，位于深層皮質(zhì)和外髓的外帶。在功能研究中發(fā)現(xiàn)腎近端小管的這種分段是與其功能相對應(yīng)的。很多小鼠近端小管的研究也直接沿用這種節(jié)段性加以分析。但是，這種節(jié)段性已被證明有種屬差異。我們通過利用計(jì)算機(jī)輔助的三維重建技術(shù)，以C57／BL／6J小鼠腎組織連續(xù)切片形成的系列配準(zhǔn)的顯微圖像為基礎(chǔ)，運(yùn)用超微結(jié)構(gòu)體視學(xué)的方法，分別對起源于皮質(zhì)三個(gè)水平的腎單位淺表腎單位（4條）、中間腎單位（4條）和近髓腎單位（3條）的近端小管亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的包括微絨毛高度、管腔直徑和上皮高度，管壁的體積，內(nèi)吞體包括溶酶體的體密度，線粒體的體密度的節(jié)段性進(jìn)行分析。在這些指標(biāo)中，我們發(fā)現(xiàn)上皮高度、管壁的體積、內(nèi)吞體包括溶酶體的體密度等指標(biāo)的曲線有相似的變化趨勢，即在曲部的起始階段保持平直，而在曲部的后部升高，在曲直交界區(qū)域保持高位，而后在通過直部起始部位后開始下降。這個(gè)趨勢與S1、S2和S3的分段相吻合，但這些指標(biāo)的變化很微小，沒有像其他種屬的變化顯著。而對微絨毛高度、管腔直徑線粒體的體密度等指標(biāo)的研究中我們沒有發(fā)現(xiàn)具有節(jié)段性分布的特點(diǎn)。這項(xiàng)研究為以后小鼠近端小管形態(tài)與功能的研究提供了依據(jù)。

61.化學(xué)性缺氧對腎小球系膜細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2及其下游抗氧化酶蛋白表達(dá)的影響 林庚 楊蓓中國醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室沈陽110122 探討化學(xué)性低氧模型劑氯化鈷（cobalt chloride，CoCl2）對大鼠腎小球系膜細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2及其下游抗氧化酶硫氧還蛋白（Srx），γ－谷氨酰半胱氨酸連接酶催化亞基（Gclc）蛋白表達(dá)的影響。采用培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞株，500μmol／L CoCl2作用2、6、12、18、24h；利用Western－Blotting檢測不同暴露時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞核、細(xì)胞漿和細(xì)胞總的Nrf2蛋白表達(dá)及其抗氧化酶Srx、Gclc的蛋白表達(dá)；應(yīng)用Real－time PCR檢測不同時(shí)間點(diǎn)抗氧化酶Srx、Gclc m RNA表達(dá)；結(jié)果顯示：大鼠腎小球系膜細(xì)胞暴露CoCl22h時(shí)，Nrf2蛋白表達(dá)增多，6h達(dá)到高峰，之后隨時(shí)間的延長Nrf2蛋白表達(dá)逐漸降低。Nrf2核蛋白表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)性與細(xì)胞總的Nrf2表達(dá)完全一致。Srx和Gclc表達(dá)亦存在時(shí)間效應(yīng)性，即暴露CoCl26h，Srx和GclcmRNA和蛋白表達(dá)隨時(shí)間延長逐漸升高，12h達(dá)到高峰。綜上表明，大鼠腎小球系膜細(xì)胞暴露CoCl2后，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Nrf2的蛋白表達(dá)，并促進(jìn)其轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)其下游抗氧化酶Srx、Gclc基因轉(zhuǎn)錄活性和蛋白表達(dá)。

62.喹硫平抑制MAPK和NF－κB通路的激活而抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成 汪云 王洪凱 李濤肖嵐 第三軍醫(yī)大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 重慶400038 骨質(zhì)流失是許多惡性腫瘤如乳腺癌、前列腺癌主要的并發(fā)癥之一，了解破骨細(xì)胞形成機(jī)制對于防治腫瘤骨轉(zhuǎn)移有重要意義。RANKL是NF－κB受體活化劑，是破骨細(xì)胞分化中的關(guān)鍵因子，在腫瘤相關(guān)的骨吸收中也起重要作用。本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)一種抗精神病藥——喹硫平能在體外抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的分化。運(yùn)用RAW264.7細(xì)胞及骨髓來源的巨噬細(xì)胞（BMMs）經(jīng)RANKL誘導(dǎo)模型，我們發(fā)現(xiàn)非毒性劑量喹硫平能在RAW264.7細(xì)胞和BMMs細(xì)胞中抑制RANKL介導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化，并能減少M(fèi)DA－MB－231細(xì)胞導(dǎo)致的溶骨性損傷。進(jìn)一步分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示喹硫平處理細(xì)胞后能降低P－P38、MAPK、P－ERK1／2和P－JNK的表達(dá)水平。在NF－κB通路中喹硫平能降低P－P65的表達(dá)，阻止P65入核及延緩IκBa的降解。提示喹硫平可通過抑制RANKL介導(dǎo)的MAPK和NF－κB通路來抑制破骨細(xì)胞的形成，可能成為骨質(zhì)溶解的新型治療藥物。

63.γ分泌酶在大鼠體內(nèi)分布與表達(dá)研究 楊智英1羅學(xué)港2嚴(yán)小新21長沙衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系 長沙410100，2中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)系 長沙410013 為從不同角度觀察γ分泌酶在大鼠腦和外周組織的分布和表達(dá)，探討γ分泌酶的生物學(xué)意義，取成年正常SD大鼠腦、眼球、觸須墊 （大鼠觸須生長區(qū)的皮膚）、骨骼肌、心、肝、胰腺、胃、空腸、結(jié)腸、睪丸、卵巢、腎、脾等組織制作冰凍切片，與氚標(biāo)記的γ分泌酶抑制劑L685，458（［3H］－L685，458）共孵育后放射自顯影成像；采集圖像并經(jīng)光密度分析，以腦組織頂葉皮層的密度為基準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)化各部位密度，得到各組織的相對分布密度；將大鼠各組織勻漿與［3H］－L685，458進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)，得到各組織γ分泌酶與［3H］－L685，458結(jié)合的最大結(jié)合容量（Bmax）和解離常數(shù)（Kd）。結(jié)果顯示，［3H］－L685，458結(jié)合位點(diǎn)存在于檢測的所有器官／組織中。腦組織頂葉的結(jié)合位點(diǎn)均勻分布在皮質(zhì)各層。與腦組織比較，眼中有中等程度的結(jié)合位點(diǎn)，眼球晶狀體中的結(jié)合位點(diǎn)最少；皮膚中的結(jié)合位點(diǎn)比所有被檢測組織的都要多，且集中于毛囊附近；骨骼肌中的結(jié)合位點(diǎn)普遍較低；心肌組織的結(jié)合位點(diǎn)略低于腦組織，主要集中表達(dá)在心壁內(nèi)層；肝臟和消化道管壁都有豐富的結(jié)合位點(diǎn)，消化管結(jié)合位點(diǎn)密集存在于粘膜層；睪丸和卵巢有較豐富的結(jié)合位點(diǎn)，略高于腦組織，其中卵泡的結(jié)合位點(diǎn)高于其他部位；腎皮質(zhì)和髓質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)與腦組織密集度基本一致；脾臟中結(jié)合位點(diǎn)較少。各組織測定的相對結(jié)合密度與放射自顯影結(jié)果一致。腦、外周組織勻漿與［3H］－L685，458結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示不同組織有著不同的最大結(jié)合容量，最大結(jié)合容量數(shù)值與各組織放射自顯影檢測的相對結(jié)合密度基本一致，而解離常數(shù)無顯著性差異。γ分泌酶在大鼠體內(nèi)廣泛而不均勻分布，并具有組織選擇性；在所檢測的組織中，皮膚中γ分泌酶分布的豐度最高，且集中在毛囊附近；γ分泌酶在腦和外周組織中具有重要的生物學(xué)功能。

64.tBHQ通過Nrf2途徑抑制亞砷酸鈉對小鼠胰島β細(xì)胞的毒性損傷 楊蓓 陳雪 中國醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 沈陽110122 本研究旨在探討叔丁基對苯二酚（tert－butylhydroquinone，tBHQ）對亞砷酸鈉（sodium arsenite，Na AsO2）致小鼠胰島β細(xì)胞MIN6毒性損傷的拮抗作用及機(jī)制。采用小鼠胰島β細(xì)胞MIN 6細(xì)胞株培養(yǎng)，Na AsO2暴露或t BHQ預(yù)處理12h后再Na AsO2暴露；MTT檢測細(xì)胞生長活性，Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)cleaved－caspase－3和Nrf2蛋白的表達(dá)，Real－time PCR檢測Nrf2及其調(diào)控的II相解毒酶NAD（P）H：醌氧化還原酶1（NQO1）和抗氧化酶γ－谷氨酰半胱氨酸連接酶（GCLC）mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示，Na AsO2（4μmol／L）單獨(dú)作用于 MIN6細(xì)胞，與空白對照組相比，細(xì)胞活性明顯降低，細(xì)胞內(nèi)的cleaved－caspase－3蛋白表達(dá)顯著升高；tBHQ（50μmol／L）預(yù)處理12h能夠顯著降低NaAsO2對MIN6細(xì)胞損傷作用。與NaAsO2單獨(dú)作用組相比，tBHQ預(yù)處理能夠顯著增加細(xì)胞總的及細(xì)胞核內(nèi)的Nrf2蛋白水平，但對Nrf2的m RNA表達(dá)沒有顯著地影響。tBHQ預(yù)處理后，NQO1和GCLC的mRNA表達(dá)均明顯高于相同濃度Na AsO2單獨(dú)作用組。綜上表明，tBHQ能夠誘導(dǎo)小鼠胰島β細(xì)胞內(nèi)Nrf2的蛋白表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)其下游II相解毒酶NQO1和抗氧化酶GCLC的轉(zhuǎn)錄活性，拮抗亞砷酸鈉對小鼠胰島β細(xì)胞毒性損傷作用。

65.L－NAT對大鼠肝臟缺血再灌注后急性胰腺損傷的保護(hù)作用 趙姍姍 胡夢琪 王淑惠 李楊 趙納杰于海 于樹娜 蔣吉英 濰坊醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室 濰坊261053 為了探討N－乙酰－L－色氨酸（N－acetyl－L－tryptophan，L－NAT）對肝臟缺血再灌注損傷后引起的胰腺細(xì)胞凋亡是否產(chǎn)生保護(hù)作用，本研究觀察了LNAT對大鼠肝臟缺血再灌注后急性胰腺損傷的影響。選用雄性成年SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注損傷（I／R）組和I／R＋L－NAT組；采用夾閉至肝中葉和左葉肝蒂的分支45Min、再灌注6h的方法制作肝缺血再灌注模型。經(jīng)左心室灌注固定，取胰腺組織，冰凍切片，HE染色檢測觀察胰腺細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化；免疫組織化學(xué)染色法檢測胰腺組織Bax、Bcl－2的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①對照組胰島細(xì)胞排列整齊，胰腺周圍部腺泡結(jié)構(gòu)完整；I／R組胰腺細(xì)胞水腫、腺泡間隔明顯擴(kuò)張，炎性細(xì)胞浸潤；L－NAT干預(yù)后胰腺形態(tài)變化明顯減輕。②免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，對照組僅有散在數(shù)個(gè)Bax、Bcl－2陽性表達(dá)；I／R后大鼠胰腺細(xì)胞Bax和Bcl－2表達(dá)顯著增加，Bax／Bcl－2顯著升高；與I／R組相比，L－NAT組Bax的表達(dá)減少，Bcl－2的表達(dá)多，Bax／Bcl－2顯著降低。上述結(jié)果提示，L－NAT可能通過調(diào)節(jié)Bcl－2家族蛋白的表達(dá)、降低Bax／Bcl－2保護(hù)肝缺血再灌注后引起的急性胰腺組織損傷，為肝I／R損傷的防治提供新的靶點(diǎn)（本研究受山東省自然科學(xué)基金ZR2014HL020資助）。

66.模擬失重對大鼠下頜下腺Ghrelin－O－乙酰轉(zhuǎn)移酶（GOAT）表達(dá)的影響 趙潔 趙赫 張金山 馬君賢張巖 第四軍醫(yī)大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 西安710032 航天失重引起體液頭向轉(zhuǎn)移進(jìn)而影響消化系統(tǒng)功能。亦饑餓素（ghrelin）是目前發(fā)現(xiàn)的惟一一種生長激素促分泌素受體的內(nèi)源性配體，能夠促進(jìn)生長激素分泌，同時(shí)增強(qiáng)食欲，減少脂肪分解，維持能量正平衡。已知饑餓素表達(dá)于大鼠下頜下腺，模擬失重可致大鼠血清和下頜下腺組織中饑餓素水平下降。饑餓素－O－乙酰轉(zhuǎn)移酶（ghrelin－O－acyltransferase，GOAT）是一種能將饑餓素第3位絲氨酸殘基辛?；哪そY(jié)合酶，主要表達(dá)于胃黏膜和胰腺，GOAT是迄今為止惟一能夠乙?；囸I素的酶。本研究觀察GOAT在大鼠下頜下腺的定位與分布，并檢測模擬失重狀態(tài)下大鼠下頜下腺內(nèi)GOAT表達(dá)的變化，為探討航天失重環(huán)境下消化系統(tǒng)功能紊亂的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)資料。采用尾懸吊模擬失重模型，20只SD大鼠分為2W懸吊組（n＝10）和正常對照組（n＝10），用免疫組織化學(xué)方法觀察大鼠下頜下腺組織GOAT的定位與分布；用Western－Bolt法檢測動物下頜下腺組織中GOAT表達(dá)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GOAT免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞主要分布于下頜下腺導(dǎo)管的顆粒曲管、紋狀管、葉間導(dǎo)管和漿液性腺泡細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)，顆粒曲管上皮細(xì)胞陽性反應(yīng)較強(qiáng)。模擬失重組大鼠下頜下腺紋狀管和顆粒曲管上皮細(xì)胞紋狀管GOAT的染色強(qiáng)度低于正常對照組。Western－Bolt蛋白檢測結(jié)果表明，模擬失重組大鼠下頜下腺組織中GOAT表達(dá)水平顯著低于正常對照組。本研究結(jié)果提示，GOAT可能參與模擬失重環(huán)境下消化系統(tǒng)功能紊亂的調(diào)節(jié)（本研究受自然科學(xué)基金項(xiàng)目NSFC81272176資助）。

67.DAD1在小鼠肝臟的表達(dá)與意義 金曉航1劉恒超2姚頌宇2馮瀟1趙潔1第四軍醫(yī)大學(xué)：1人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室；2口腔醫(yī)學(xué)系 西安710032 DAD1（defender against apoptotic cell death，DAD1）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的一個(gè)重要亞基。該基因也被認(rèn)為是抗細(xì)胞凋亡因子，一個(gè)在腫瘤細(xì)胞中被證實(shí)的凋亡抑制基因，因此常被作為凋亡相關(guān)標(biāo)志基因之一。已有文獻(xiàn)報(bào)道，用 Western blot或Northern blot方法證明該基因在肝臟中表達(dá)，但組織學(xué)表達(dá)方式研究甚少。我們通過免疫組織化學(xué)方法對DAD1基因在Balb／c小鼠中的表達(dá)做普查時(shí)發(fā)現(xiàn)，在睪丸、附睪、肺、腎等器官中有明顯陽性染色；而在肝臟的免疫組織化學(xué)染色中，絕大部分肝細(xì)胞不顯色，為陰性信號，僅僅在肝臟的最外緣的肝細(xì)胞中有黃褐色染色，表現(xiàn)為陽性信號。但是用同樣的DAD1抗體以同樣的二抗應(yīng)用Western blot研究Balb／c小鼠肝臟中該基因的表達(dá)，則可以得到較強(qiáng)的陽性信號。這樣似乎矛盾的結(jié)果出現(xiàn)，可能與肝臟的組織學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。肝臟為血液非常豐富的器官，有中央靜脈、小葉間血管及發(fā)達(dá)的血竇，血竇中有大量的血細(xì)胞。在肝臟的免疫組織化學(xué)研究中，血細(xì)胞容易出現(xiàn)黃褐色染色，一般認(rèn)為是假陽性信號，而因?yàn)橥瑯拥脑虺霈F(xiàn)的顯色信號在Western blot中則很難認(rèn)為是假陽性。雖然肝細(xì)胞是功能多樣的細(xì)胞，而且DAD1基因表達(dá)廣泛，但這些結(jié)果顯示DAD1基因在肝組織中絕大多數(shù)肝細(xì)胞并不表達(dá)。因此，目前我們還不能排除在肝癌細(xì)胞中是否有DAD1基因的明確表達(dá)，但是這些結(jié)果提示我們在用DAD1作為肝細(xì)胞凋亡相關(guān)標(biāo)志物時(shí)需要特別謹(jǐn)慎。

68.小鼠大腦急性缺氧后上調(diào)淋巴管及神經(jīng)再生相關(guān)蛋白的表達(dá)促進(jìn)腦新生血管形成 孟繁偉 張彩霞 楊鵬飛 陳丹丹 肖培倫 山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校解剖生理教研室 煙臺264199 為了探討大腦急性缺氧后，腦血管再生的關(guān)鍵分子及機(jī)制，本研究用免疫組織化學(xué)染色法觀察大腦急性缺氧后腦血管再生過程，檢測血管內(nèi)皮生長因子 A（VEGF－A）、VEGF－C、CD34、淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體1（LYVE－1）和神經(jīng)巢蛋白（nestin）的表達(dá)。結(jié)果顯示，急性腦缺血后，新生血管的數(shù)量持續(xù)增加；較大血管及新生毛細(xì)血管均表達(dá)CD34，免疫染色結(jié)果顯示VEGF－A表達(dá)隨CD34的增加也明顯升高，VEGF－A不但在血管內(nèi)皮細(xì)胞及外周細(xì)胞表達(dá)，也分布于大量神經(jīng)元胞體及突起。VEGF－C優(yōu)勢表達(dá)于部分神經(jīng)突起，LYVE－1集中表達(dá)于部分神經(jīng)核團(tuán)中的胞體及纖維束；急性腦缺血后，新生血管則持續(xù)表達(dá)LYVE－1，VEGF－C，血管結(jié)構(gòu)清晰，成熟血管則不表達(dá)LYVE－1，VEGF－C，Cd34呈陽性表達(dá)；急性缺氧后，腦組織中神經(jīng)元呈nestin陽性表達(dá)，且發(fā)現(xiàn)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞也表達(dá)nestin；在急性缺氧后，腦血管重建過程中，VEGF－A，VEGF－C表達(dá)增加對損傷的神經(jīng)元起到保護(hù)作用，同時(shí)也誘導(dǎo)CD34陽性細(xì)胞形成新的毛細(xì)血管；CD34陽性新生小血管均表達(dá)VEGF－C，LYVE－1，nestin，并形成經(jīng)典連續(xù)性毛細(xì)血管；成熟時(shí)，則不再表達(dá) VEGF－C，LYVE－1，nestin。由此說明除了VEGF－A，CD34，還有VEGF－C，LYVE－1及nestin均參與腦組織中新生連續(xù)性毛細(xì)血管的形成。

69.活化型肝星狀細(xì)胞中miRNA下調(diào)gremlin1表達(dá)的調(diào)控機(jī)制研究 曾憲一 王潔 王慧 張艷瓊 柳長柏 吳江鋒 三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院 腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 宜昌443002 miRNA在控制發(fā)育進(jìn)程、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡以及器官發(fā)育等扮演著關(guān)鍵性角色，我們的前期研究確認(rèn)了gremlin1與肝星狀細(xì)胞（HSC）的活化成正相關(guān)，下調(diào)grenlin1可能起到抑制HSC活化的作用。本研究主要篩選HSC－T6中下調(diào)gremlin1表達(dá)的miRNA以及檢測其對HSC活化相關(guān)基因α－SMA和Col1α1表達(dá)的影響。運(yùn)用生物信息學(xué)軟件篩選出可能下調(diào)gremlin1表達(dá)的4種保守miRNA；用熒光素酶報(bào)告基因分析法篩選出下調(diào)gremlin1表達(dá)的miRNA的結(jié)合位點(diǎn)；結(jié)合生物信息學(xué)軟件和熒光素酶報(bào)告基因分析法雙重篩選可能下調(diào)gremlin1表達(dá) 的 保 守 miRNA 有 miR－23a／b、miR－27a／b、miR－181a／b／c／d 和 miR－182；合 成 篩 選 出 的 miRNAMimic，轉(zhuǎn)染 HSC－T6后確定了 miR－23b－3p、miR－27b和 miR－182能下調(diào) HSC－T6中g(shù)remlin1的表達(dá)，miR－181b－1－3p能下 調(diào) Collα1 的 表 達(dá)。由 此 可 見，gremlin1 通 過 調(diào) 節(jié) BMP－7／TGF－β－Smad 信 號 通 路 對HSC－T6細(xì)胞起關(guān)鍵作用，抑制gremlin1的表達(dá)可抑制 HSC－T6細(xì)胞的活化，miR－27b、miR－23b－3p和 miR－182可以抑制Gremlin1和膠原蛋白的表達(dá)，進(jìn)而可能對HSC的活化起著重要作用（本研究受國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目81200307資助）。

70.CRES蛋白抗微生物譜及其機(jī)制研究 王莉 胡燕琴 徐晨 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系 上海市生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海200025 胱蛋白酶抑制劑相關(guān)的附睪精子發(fā)生蛋白（CRES）屬于胱蛋白酶抑制劑超家族中Family 2即cyatatins的一個(gè)成員。CRES特異表達(dá)于雄性生殖系統(tǒng)中，并具有明顯的年齡變化規(guī)律。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)首先CRES具有抗大腸桿菌（E.coli）和溶脲脲原體（Uu）的功能，提示CRES是雄性生殖道的一個(gè)新型抗菌肽，可能具有抗微生物廣譜性。首先，我們采用菌落形成單位法（CFU）檢測了CRES的抗菌譜。結(jié)果顯示，與培養(yǎng)至對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、綠膿桿菌、白念珠菌共孵育，CRES蛋白可抑制其生長，且這種效應(yīng)具有明顯的時(shí)間－劑量依賴性。500ng／ml的LPS刺激原代培養(yǎng)的附睪上皮細(xì)胞24h后，CRES的m RNA水平明顯上升。此外，我們通過雙向電泳，質(zhì)譜分析方法發(fā)現(xiàn)肽酰－脯氨酰－順反式異構(gòu)酶D（Peptidyl－prolyl cis－trans isomerase D，PpiD）可能是CRES作用的關(guān)鍵靶標(biāo)，CRES通過作用于E.coli的間周質(zhì)催化蛋白PpiD，使蛋白質(zhì)折疊過程受阻，不能正確形成，從而引起細(xì)菌死亡。本研究對于CRES蛋白的生物學(xué)功能有了新的發(fā)現(xiàn)，為臨床男性生殖道感染診斷和治療的新靶標(biāo)篩選提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

71.褪黑素對幽門螺桿菌感染胃疾病的影響及其與CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg細(xì)胞的關(guān)系 張慧 羅建華 劉卉 宋軍 陳義忠 王日雄周瑞祥 福建醫(yī)科大學(xué)福州350108 胃疾病一直是困擾人們的科學(xué)難題，研究顯示幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是其主要的致病因素。感染Hp可導(dǎo)致胃炎，嚴(yán)重者甚至發(fā)展為胃潰瘍、胃癌。Hp的根治療法效果不佳，且其致病機(jī)制尚不明確，因而提高機(jī)體對Hp感染的免疫效應(yīng)是目前的研究熱點(diǎn)之一。研究證實(shí)CD4＋CD25＋Foxp3＋調(diào)節(jié)性T（Treg）細(xì)胞具有免疫無能和免疫抑制兩大功能；褪黑素具有抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用。本研究旨在探討褪黑素對Hp感染胃疾病的影響及其與CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg細(xì)胞的關(guān)系，為Hp感染胃疾病尋找一條基于神經(jīng)－內(nèi)分泌－免疫網(wǎng)絡(luò)綜合治療模式的新思路。建立Hp感染胃疾病小鼠模型，用不同濃度褪黑素干預(yù)，分別于2w、4w和6w取材，運(yùn)用HE染色檢測胃的病理變化；快速尿素酶檢測Hp的定值程度和番紅染色驗(yàn)證Hp；流式細(xì)胞術(shù)、Real－time PCR檢測胸腺和脾Treg細(xì)胞數(shù)量和Foxp3 mRNA的表達(dá)變化。HE染色顯示Hp感染后小鼠胃黏膜層和黏膜下層存在明顯的炎癥細(xì)胞，且呈彌散性分布；胃組織Hp培養(yǎng)顯示針尖樣菌落，番紅染色可見Hp；褪黑素干預(yù)后下調(diào)胸腺Foxp3 mRNA表達(dá)量及CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果提示，褪黑素具有增強(qiáng)免疫的作用，并在一定程度上減輕小鼠Hp感染胃疾病的嚴(yán)重程度，其機(jī)制可能與下調(diào)CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg細(xì)胞數(shù)量和Foxp3 mRNA表達(dá)水平有關(guān)。

72.Sp1對不同甲基化狀態(tài)下的OY－TES－1啟動子的調(diào)控影響 石蕾 陳芳 張慶梅 羅彬 彭亞 謝小薰廣西醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 南寧530021 癌－睪丸抗原（cancer－testis antigen，CTA）是一類腫瘤相關(guān)性抗原，其特點(diǎn)是能在各種腫瘤組織表達(dá)，而在正常組織（除睪丸、卵巢和胎盤外）基本不表達(dá)。OYTES－1是CTA家族的一員。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞OY－TES－1啟動子呈高甲基化狀態(tài)，且生物信息學(xué)分析顯示OY－TES－1啟動子上含多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合位點(diǎn)，推測Sp1可能參與OY－TES－1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控并與其啟動子甲基化有關(guān)。本研究首先構(gòu)建出4段OY－TES－1啟動子熒光素酶報(bào)告載體，通過雙熒光素酶活性檢測篩選出相對核心啟動子區(qū)域，然后進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：①分別轉(zhuǎn)染過表達(dá)Sp1的細(xì)胞、Sp1表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞及光輝霉素處理過的細(xì)胞，檢測報(bào)告基因活性，從而了解外源性和內(nèi)源性Sp1對OY－TES－1的調(diào)控作用；②用免疫共沉淀驗(yàn)證Sp1是否能與OY－TES－1啟動子結(jié)合；③對OY－TES－1啟動子報(bào)告基因載體進(jìn)行甲基化處理，分別轉(zhuǎn)染Sp1過表達(dá)細(xì)胞及Sp1表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞，檢測報(bào)告基因活性，了解OY－TES－1啟動子甲基化是否會影響Sp1對OY－TES－1啟動子的調(diào)控作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，啟動子序列－213／＋67活性最高，為相對核心啟動子區(qū)域。將這段序列的報(bào)告基因載體與Sp1過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)，OY－YES－1啟動子報(bào)告活性明顯增強(qiáng)，而與Sp1－iRNA共轉(zhuǎn)后，OY－TES－1啟動子報(bào)告活性顯著下降。為了進(jìn)一步了解內(nèi)源性Sp1對OY－TES－1的調(diào)控作用，我們在轉(zhuǎn)染OY－TES－1啟動子報(bào)告載體的細(xì)胞中加入光輝霉素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OYTES－1啟動子報(bào)告活性下降，且與光輝霉素濃度有相關(guān)性。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Sp1對OY－TES－1具有調(diào)控作用，然而，具體的調(diào)控機(jī)制尚需免疫共沉淀的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。OY－TES－1啟動子的甲基化狀態(tài)是否會影響Sp1對它的調(diào)控作用，有待進(jìn)一步探究。

73.比較解剖學(xué)新視野－基于代謝網(wǎng)絡(luò)特征的比較解剖學(xué)及其應(yīng)用 彭謹(jǐn) 四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心組織胚胎學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室 成都610041 比較解剖學(xué)是利用解剖學(xué)的方法對研究不同物種之間的異同進(jìn)行比較的一門古老學(xué)科。隨著現(xiàn)代系統(tǒng)生物學(xué)數(shù)據(jù)庫的積累，越來越多的證據(jù)表明，由于遺傳物質(zhì)不同造成的不同物種之間的差異并不僅僅表現(xiàn)在具體的解剖學(xué)形態(tài)特征上，同時(shí)也會表現(xiàn)在抽象的代謝網(wǎng)絡(luò)特征上。不同物種的代謝網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)特征同樣也是一種可觀察并且應(yīng)用可視化技術(shù)進(jìn)行形態(tài)比較的研究對象。利用現(xiàn)有的已公開的KEGG數(shù)據(jù)庫、Matlab計(jì)算機(jī)語言分析平臺、基于JAVA的可視化工具包，本研究對從大腸桿菌、果蠅、斑馬魚、獼猴以及人類的代謝網(wǎng)絡(luò)特征進(jìn)行了可視化分析，比較其網(wǎng)絡(luò)分布度標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明，隨著生物逐漸進(jìn)化，其代謝網(wǎng)絡(luò)平均加權(quán)度、特征向量中心度、平均聚類系數(shù)并無明顯變化，但是網(wǎng)絡(luò)直徑和網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)密度逐漸增加，Pagerank系數(shù)變得越來越大。在針對人和獼猴的碳水化合物、氨基酸、脂代謝三大代謝通路比較中發(fā)現(xiàn)，即使是親緣關(guān)系較近的兩種動物，在重要的代謝通路中也有部分關(guān)鍵代謝通路節(jié)點(diǎn)在是否連通方面存在不同。在人和獼猴之間糖代謝的主要區(qū)別是獼猴缺乏處理從6－磷酸葡萄糖酸鹽轉(zhuǎn)化為5－磷酸核酮糖這一途徑。對于脂代謝，多個(gè)與長鏈脂肪酸合成的酶學(xué)代謝途徑出現(xiàn)中間環(huán)節(jié)缺失，可能與獼猴對于脂肪的蓄積能力相對較低有關(guān)。對氨基酸代謝，兩種動物則未見明顯差異。本研究提示，利用新的網(wǎng)絡(luò)分析方法，可以對已有的代謝通路研究進(jìn)行高層次的整合，這種表現(xiàn)在拓?fù)鋷缀螌W(xué)上的形態(tài)差異同樣也可以看做是比較解剖學(xué)研究的一部分。

74.通過代謝物指紋圖譜和代謝網(wǎng)絡(luò)分析建立起評估脊髓損傷嚴(yán)重程度的定量研究模型 彭謹(jǐn) 四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心組織胚胎學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室成都610041 脊髓損傷是一種嚴(yán)重危害人群健康的疾病，牽涉多個(gè)生理過程，正確評估脊髓損傷的嚴(yán)重程度具有重要的臨床意義。本研究通過建立基于NMR的創(chuàng)傷代謝指紋圖譜的方法對SD大鼠脊髓損傷的嚴(yán)重程度進(jìn)行分析，并利用O－PLS－DA技術(shù)對大鼠脊髓損傷后代謝指紋圖譜與損傷時(shí)間及損傷的嚴(yán)重程度進(jìn)行相關(guān)分析。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠脊髓損傷的不同評價(jià)體系（損傷嚴(yán)重程度、損傷時(shí)間以及損傷后BBB評分）與NMR代謝指紋圖譜均有相關(guān)性。17種代謝產(chǎn)物與損傷后時(shí)間變化密切相關(guān)，20種物質(zhì)與損傷后傷情的變化密切相關(guān)。利用判別分析發(fā)現(xiàn)，不同的代謝物組合可以表征不同的損傷嚴(yán)重程度和損傷經(jīng)過的時(shí)間。偏最小二乘法擬合發(fā)現(xiàn)，損傷后部分代謝物的變化同大鼠損傷后BBB評分關(guān)系密切。利用KEGG數(shù)據(jù)庫分析表明，催化這些代謝物產(chǎn)生的酶類在代謝通路網(wǎng)絡(luò)上具有特定的聚集特性。與視黃醛代謝、鞘磷脂代謝、乙醇脫氫酶轉(zhuǎn)化通路、酪氨酸代謝以及腐胺－尸胺代謝有關(guān)的10個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)有關(guān)。本研究提示，利用PLS判別分析和PLS回歸可以有效評估大鼠損傷后代謝物表達(dá)模式與損傷嚴(yán)重程度、損傷后BBB評分等的關(guān)系。

75.熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)在蛋白質(zhì)定位、相互作用以及動態(tài)追蹤研究中的發(fā)展和應(yīng)用 彭挺 賀軍 李和華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)系 武漢430030 2008年錢永健等3位科學(xué)家因在發(fā)現(xiàn)及發(fā)展綠色熒光蛋白的研究中所做出的重大貢獻(xiàn)，獲得了當(dāng)年的獎諾貝爾化學(xué)獎。隨著更多新型熒光蛋白的相繼發(fā)現(xiàn)，以及對現(xiàn)有熒光蛋白的結(jié)構(gòu)改造和修飾，一系列全新的熒光標(biāo)記方法得以產(chǎn)生。同時(shí)隨著人們對熒光蛋白發(fā)光性質(zhì)的更多了解，誕生了很多新型實(shí)驗(yàn)技術(shù)，將微觀世界中蛋白質(zhì)的分布、運(yùn)動、相互作用、空間構(gòu)象、代謝、活性等變化現(xiàn)象，在活細(xì)胞水平動態(tài)地展現(xiàn)在人們眼前。相對于傳統(tǒng)的熒光染色和免疫熒光技術(shù)，熒光蛋白的標(biāo)記不需要固定和染色，對細(xì)胞毒性小，在活細(xì)胞動態(tài)追蹤過程的應(yīng)用優(yōu)勢尤為明顯。過去我們通常采用酵母雙雜交、GST－pull down、免疫共沉淀等相對間接的實(shí)驗(yàn)方法研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，而這些方法均不能直觀動態(tài)地追蹤到蛋白質(zhì)相互作用的發(fā)生過程。通過將目的基因與不同顏色熒光蛋白基因的重組而構(gòu)建的融合蛋白，可以在活細(xì)胞水平快速準(zhǔn)確地追蹤到兩個(gè)甚至多個(gè)蛋白分子的分布變化以及相互位置關(guān)系。利用激光共聚焦顯微鏡對活細(xì)胞進(jìn)行時(shí)間序列掃描，以及在Z軸步進(jìn)掃描后的三維重建，可以很準(zhǔn)確地判斷出熒光蛋白標(biāo)記分子之間的真實(shí)作用關(guān)系和分布狀態(tài)，克服了由于吸附、重疊等客觀因素造成的假陽性結(jié)果。在構(gòu)建熒光蛋白融合分子的基礎(chǔ)上，利用熒光漂白恢復(fù)（fluorescence recovery after photobleaching，F(xiàn)RAP）技術(shù)，可以觀察到大顆粒物質(zhì)在亞細(xì)胞水平的運(yùn)動趨勢。在"分割－重組"熒光蛋白分子的基礎(chǔ)上而實(shí)現(xiàn)的雙分子熒光互補(bǔ)（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）分析技術(shù)，不但可以直觀地反應(yīng)蛋白質(zhì)之間的相互作用，還可以檢測到結(jié)構(gòu)域之間的相互作用關(guān)系。通過將CFP、YFP與目的結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)線性融合，利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）技術(shù)我們可以深入分子內(nèi)部，量化地檢測到結(jié)構(gòu)域之間的結(jié)合變化過程，以及該相互作用受到外界可變因素的影響情況。近年來在改變熒光蛋白的發(fā)光組合、分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)上科學(xué)家們也進(jìn)行了大量的嘗試。2007年美國科學(xué)家通過隨機(jī)改變不同熒光蛋白在神經(jīng)元中的表達(dá)組合而發(fā)明的腦虹技術(shù)（brainbow technique），讓我們可以在微小的空間中區(qū)分哪怕是來自相鄰兩根軸突間的差別。在細(xì)胞周期的研究中，過去只能通過流式細(xì)胞技術(shù)或者對細(xì)胞周期蛋白水平的檢測來進(jìn)行評估，2008年日本科學(xué)家開發(fā)出熒光泛素化細(xì)胞周期指示劑（fluorescent ubiquitination－based cell－cycle indicator，F(xiàn)UCCI），通過將 RFP、GFP分別與不同的細(xì)胞周期因子融合，利用周期蛋白的代謝降解機(jī)制，動態(tài)觀察細(xì)胞的熒光變化進(jìn)而直觀地判斷出單個(gè)細(xì)胞所處的時(shí)期，以及細(xì)胞群體在周期中所占的比例。利用光激活型綠色熒光蛋白（photoactivatible－GFP，PA－GFP）的發(fā)光特點(diǎn)，我們除了可以觀察到定量的發(fā)光蛋白在空間分布上的變化，還可以根據(jù)時(shí)間軸上熒光值的變化判斷出靶蛋白的代謝趨勢。在胞內(nèi)代謝的研究領(lǐng)域，人們利用RFP、GFP在酸性條件下的穩(wěn)定性差異，通過與LC3分子的線性融合，直觀地檢測到了細(xì)胞自噬及溶酶體系統(tǒng)的激活過程。利用GFP與蛋白酶體降解信號CL－1的直接融合而構(gòu)建的GFP－U蛋白，可以直觀地展示細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體途徑的功能狀態(tài)。在對細(xì)胞的囊泡運(yùn)輸及分泌過程的研究中，通過普通熒光蛋白對特異性分泌蛋白的標(biāo)記，可以追蹤到胞內(nèi)特異性囊泡的定位、分選和運(yùn)輸過程；而通過p H敏感型熒光蛋白突變體的應(yīng)用，可以讓我們動態(tài)觀察囊泡和靶膜的融合瞬間及釋放過程。

76.腫瘤細(xì)胞3維培養(yǎng)模型的體外構(gòu)建及其侵襲與轉(zhuǎn)移特性 張秀珍 劉偉 徐紅 侯亮 路英進(jìn) 李眀赫陳佩佩 郭亞楠 馮迪 王秀麗 大連醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 大連116027 腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移是腫瘤的惡性生物學(xué)性狀之一，也是導(dǎo)致腫瘤患者復(fù)發(fā)及死亡的主要原因，但其發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制仍遠(yuǎn)未被揭示。新近研究表明腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移不僅取決于腫瘤細(xì)胞自身的生物學(xué)特性有關(guān)，而且還與腫瘤所處的微環(huán)境密切相關(guān)。由此，建立可體外模擬腫瘤微環(huán)境的3維腫瘤培養(yǎng)模型將可能成為研究并揭示腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移機(jī)制的重要手段。本實(shí)驗(yàn)采用組織工程技術(shù)手段，以膠原蛋白為支架材料體外嘗試構(gòu)建人卵巢癌細(xì)胞3維培養(yǎng)模型，并分別采用CCK8檢測、活性染色、HE染色以及整封染色等方法對所構(gòu)建模型進(jìn)行形態(tài)學(xué)評價(jià)；同時(shí)分別通過劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、明膠酶譜實(shí)驗(yàn)、實(shí)時(shí)定量PCR以及Western blot方法對所構(gòu)建的模型進(jìn)行基于基因、蛋白以及細(xì)胞水平的功能活性評價(jià)。結(jié)果表明，卵巢癌細(xì)胞在3D膠原支架中具有良好的增殖活性，且多以細(xì)胞團(tuán)形態(tài)散在均勻分布；HE染色顯示其細(xì)胞彼此聚集成團(tuán)，無中心壞死發(fā)生。對比平面培養(yǎng)體系，卵巢癌細(xì)胞在3D培養(yǎng)體系內(nèi)的增殖曲線以及生長形態(tài)均差異顯著。明膠酶譜法檢測結(jié)果顯示，對比平面培養(yǎng)體系，3D培養(yǎng)體系內(nèi)卵巢癌細(xì)胞的MMP－2，MMP－9活性顯著增強(qiáng)。此外，3D培養(yǎng)條件下腫瘤細(xì)胞穿過Transwell小室的數(shù)目顯著增加；基因蛋白水平檢測與腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的相關(guān)標(biāo)記物基因（MMPs家族，VEGF、Vimentin、E－cadherin、β－cadherin、Intergin等）發(fā)現(xiàn)，3維培養(yǎng)可顯著提高卵巢癌細(xì)胞內(nèi)上述基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。綜上，我們已成功構(gòu)建基于3維培養(yǎng)體系的卵巢癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的體外研究模型，為深入闡明腫瘤微環(huán)境與侵襲轉(zhuǎn)移之間的作用及具體機(jī)制研究提供有效的研究工具（本研究受國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目31470952資助）。

77.三維腫瘤微環(huán)境的體外構(gòu)建與腫瘤組織工程 徐紅 劉偉 張秀珍 陳佩佩 馮迪 郭亞楠 王秀麗 大連醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室 大連116044 組織微環(huán)境是調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵因素。應(yīng)用再生醫(yī)學(xué)技術(shù)體外構(gòu)建可模擬體內(nèi)微環(huán)境的3維細(xì)胞培養(yǎng)模型可為發(fā)育生物學(xué)、病理學(xué)以及藥理學(xué)提供有力的研究工具。我們在前期工作中主要圍繞3D微環(huán)境和組織化模型的建立、應(yīng)用及機(jī)制探索，應(yīng)用3維共培養(yǎng)技術(shù)成功構(gòu)建其形態(tài)、功能及藥理活性均與在體乳腺組織高度相似的人乳腺3維組織化模型，為探討微環(huán)境相互作用及其與乳腺發(fā)育與病理轉(zhuǎn)化的關(guān)系，并應(yīng)用于乳腺腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、藥物乳腺毒性及藥效篩選和評價(jià)提供了理想的研究體系。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步通過腫瘤細(xì)胞－基質(zhì)細(xì)胞－細(xì)胞外基質(zhì)支架共培養(yǎng)技術(shù)體外模擬構(gòu)建腫瘤組織微環(huán)境，部分再現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在體的生物學(xué)特性包括其增殖、耐藥，侵襲與轉(zhuǎn)移等，并結(jié)合分子細(xì)胞生物學(xué)及組織學(xué)技術(shù)分別在分子、細(xì)胞以及組織水平對其進(jìn)行表征和評價(jià)。目前我們已在構(gòu)建多藥耐藥腫瘤3維培養(yǎng)模型及體外3維培養(yǎng)條件下模擬腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移方面取得初步進(jìn)展。該研究工作將為深入闡釋腫瘤微環(huán)境與腫瘤生物學(xué)特性的相關(guān)性提供新體系，而且也將為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供理想的篩選與評價(jià)工具（本研究受國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目31470952資助）。

78.多藥耐藥乳腺癌細(xì)胞3維培養(yǎng)模型的體外構(gòu)建與評價(jià) 劉偉 張秀珍 徐紅 侯亮 路英進(jìn) 陳佩佩 郭亞楠 李博文 王秀麗 大連醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室 大連116041 新近研究表明，腫瘤微環(huán)境與腫瘤細(xì)胞多藥耐藥（MDR）的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。受限于傳統(tǒng)的平面培養(yǎng)體系在模擬腫瘤微環(huán)境方面的巨大缺陷，近年來有關(guān)腫瘤3維（3D）模型體外構(gòu)建的研究倍受關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)旨在體外構(gòu)建MDR乳腺癌3D培養(yǎng)模型，以期為乳腺癌MDR產(chǎn)生機(jī)制及其逆轉(zhuǎn)的研究提供有力的研究工具。實(shí)驗(yàn)以MDR細(xì)胞株MCF－7／A及敏感株MCF－7／S為細(xì)胞模型，對照2D培養(yǎng)組，分別考察3D培養(yǎng)組內(nèi)（膠原為培養(yǎng)支架）細(xì)胞的形態(tài)、增殖（CCK－8檢測）、活性（活性染色，HE染色）；同時(shí)檢測各培養(yǎng)組內(nèi)細(xì)胞對阿霉素、紫杉醇、卡鉑、5－氟尿嘧啶的藥物敏感性，通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測 MDR相關(guān)基因p－gp、mrp－2、GST－π、Her－2、TopoⅡ m RNA的表達(dá)水平，并采用 Western blot及免疫熒光檢測耐藥蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3D培養(yǎng)組內(nèi) MCF－7／S和MCF－7／A呈聚團(tuán)生長，細(xì)胞增殖及活性良好。對比2D培養(yǎng)組，3D培養(yǎng)組細(xì)胞對各模式化療藥物的敏感性（IC50）顯著降低，且細(xì)胞內(nèi)阿霉素藥物濃度明顯升高。此外，3D培養(yǎng)組內(nèi)細(xì)胞均顯著高表達(dá)p－gp、mrp2、GST－π等耐藥相關(guān)基因，其中MCF－7／A細(xì)胞的p－gp表達(dá)水平增強(qiáng)48倍。與之相一致，Western blot檢測結(jié)果表明P－gp蛋白表達(dá)水平3D較2D培養(yǎng)組顯著升高。本研究中我們已成功構(gòu)建具有MDR表型及功能的乳腺癌3D培養(yǎng)模型。該模型將可能在模擬在體腫瘤微環(huán)境，以深入闡明MDR發(fā)生機(jī)制并尋求克服MDR的靶向性治療中發(fā)揮巨大潛能（本研究受國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目31470952資助）。

79.發(fā)生發(fā)育小鼠腎石蠟切片制作方法 顧玲 叢敬 林庚 張婕 田瑩瑩 翟效月 中國醫(yī)科大學(xué)組織與胚胎學(xué)教研室沈陽110122 為滿足研究發(fā)生發(fā)育小鼠腎微細(xì)結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生的需要，本實(shí)驗(yàn)室探索出針對不同發(fā)生發(fā)育時(shí)間點(diǎn)腎組織石蠟塊制作的合適條件。4%多聚甲醛浸泡固定（胎鼠全腎）或心臟灌流固定（從生后5天以后的鼠）后，取全腎或腎組織塊，入同種固定液續(xù)固定，逐級乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟及包埋。石蠟切片5μm厚，脫蠟、逐級乙醇梯度水化，以蘇木素或蘇木素－伊紅染色后的形態(tài)觀察作為最佳方案的篩選依據(jù)。反復(fù)實(shí)驗(yàn)后的各時(shí)間點(diǎn)腎組織石蠟塊硬度適宜，較易得到連續(xù)的石蠟切片。經(jīng)形態(tài)學(xué)染色后，低倍光鏡下（20×）可見，腎組織被膜完整，皮髓質(zhì)各區(qū)及各帶結(jié)構(gòu)緊致而清晰，并保持在原位；腎小管及血管管腔開放；高倍光鏡下（40×），發(fā)生發(fā)育腎組織中的成熟的細(xì)胞具有成年小鼠腎各類型細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，而處于發(fā)育階段的未成熟細(xì)胞具有較為合理的核漿比例，核圓且核仁清晰。實(shí)驗(yàn)證明，隨著小鼠發(fā)生發(fā)育，腎組織梯度乙醇脫水時(shí)間逐漸增加，透明時(shí)間逐漸延長，包埋石蠟的硬度從軟到硬，染色時(shí)間也相應(yīng)變化。

80.全層鋪片技術(shù)在消化管Cajal間質(zhì)細(xì)胞研究中的應(yīng)用 孫海梅 楊姝 張國權(quán) 周德山 首都醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 北京100069 消化管壁內(nèi)的Cajal間質(zhì)細(xì)胞（interstitial cells of Cajal，ICC）是胃腸起搏細(xì)胞，并具有傳導(dǎo)神經(jīng)沖動的作用。多種胃腸動力障礙疾病與ICC的分布和形態(tài)異常有關(guān)。直觀、全面地觀察ICC在消化管壁的分布和形態(tài)變化，對于深入研究ICC與胃腸運(yùn)動相關(guān)疾病的關(guān)系具有重要的意義。消化管壁全層鋪片技術(shù)結(jié)合ICC特異性蛋白C－kit免疫熒光染色可以彌補(bǔ)冰凍切片或石蠟切片在顯示ICC實(shí)驗(yàn)中的不足，更好地顯示消化管壁ICC的分布和形態(tài)結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)選擇成年BALB／c小鼠，雌雄不限，實(shí)驗(yàn)前將動物禁食24 h，1%戊巴比妥鈉麻醉動物后處死，快速取出完整胃、部分小腸和結(jié)腸，置于預(yù)冷的0.01mol／L PBS中，反復(fù)沖洗、去除腔內(nèi)容物。結(jié)扎胃的賁門端或者腸管的一端，用注射器將預(yù)冷的丙酮或4%多聚甲醛固定液注入胃或腸腔內(nèi)，使其維持最大充盈狀態(tài)，再結(jié)扎另一端。置入相同固定液中固定24 h。制作全層鋪片前去除結(jié)扎部分，將胃沿小彎側(cè)剪開或?qū)⒛c沿腸系膜緣剪開，取0.5 cm×0.5 cm大小的樣本，置于平皿中，黏膜面向上。在解剖顯微鏡下，用進(jìn)口鐘表鑷依次將黏膜層和黏膜下層去除，再將環(huán)行平滑肌層、縱行平滑肌和漿膜層分離，剪成適當(dāng)大小的標(biāo)本塊，置于預(yù)冷的0.01mol／L PBS中。按常規(guī)免疫熒光染色法對鋪片進(jìn)行C－kit染色，熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，采用消化管壁全層鋪片行免疫熒光c－Kit染色可以更好地顯示ICC的完整形態(tài)和分布，對于深入研究ICC與胃腸運(yùn)動相關(guān)疾病的關(guān)系，具有重要的意義。本技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)：①選擇丙酮固定液效果優(yōu)于4%多聚甲醛固定液；②對消化器官要進(jìn)行充分地充盈固定，這樣使腔壁的肌層變得很薄，易于染色且成片后效果較好；③在胃、小腸和結(jié)腸制備鋪片的難易程度有所差異，同一器官的不同部位制備鋪片也有所區(qū)別。

81.碘化丙啶PI可對尼氏體進(jìn)行標(biāo)記從而用于神經(jīng)元特異性染色和計(jì)數(shù) ?？★w 曾美琪 馮先玲 陳獻(xiàn)雄 沙鷗 深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部醫(yī)學(xué)系 深圳518060 碘化丙啶 （Propidium iodide，PI）是一種實(shí)驗(yàn)室中常用的核酸染料，能夠與RNA和DNA結(jié)合。PI的最大激發(fā)光波長為535nm，最大發(fā)射光的波長為617nm，因此其在激發(fā)條件下呈現(xiàn)紅色熒光。PI常和凋亡早期標(biāo)記物Annexin V共同使用，以對凋亡細(xì)胞進(jìn)行鑒定、分析，而在普通的形態(tài)學(xué)染色實(shí)驗(yàn)中PI常作為細(xì)胞核的襯染試劑。本實(shí)驗(yàn)主要是在大鼠神經(jīng)組織中比較PI和尼氏體染料的染色效果，并提出對神經(jīng)元尼氏體選擇性標(biāo)記的新方法。我們將正常的SD大鼠的不同組織，包括三叉神經(jīng)節(jié)、背根神經(jīng)節(jié)、脊髓、肝臟和小腸的冰凍切片和石蠟切片分別進(jìn)行PI和蘇木素－伊紅（HE）染色；部分切片在進(jìn)行上述染色前，分別進(jìn)行DNA酶或RNA酶的處理，另一部分切片則進(jìn)行PI和尼氏熒光燃料的雙重染色。這些切片通過普通熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡分別進(jìn)行觀察和分析。結(jié)果顯示，所有神經(jīng)組織的神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)具有很強(qiáng)的顆粒狀PI染色信號，而神經(jīng)元細(xì)胞核染色強(qiáng)度較弱；相反，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)PI染色強(qiáng)陽性，而膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿染色不明顯。但是，在使用RNA酶預(yù)處理之后，神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)的PI信號消失。此外，在神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)中的PI信號與尼氏體染料的信號具有一致性。當(dāng)神經(jīng)組織用DNA酶處理之后，PI信號只出現(xiàn)在神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)中，但并不出現(xiàn)在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中。因此，我們的研究表明，當(dāng)神經(jīng)元的特異性標(biāo)記物不易獲得時(shí)，PI可以作為一種經(jīng)濟(jì)快捷的神經(jīng)元標(biāo)記替代物進(jìn)行神經(jīng)元標(biāo)記和計(jì)數(shù)（本研究受國家自然科學(xué)基金NSFC 81171154資助）。

82.教學(xué)切片Ehrlich蘇木精－伊紅的染色質(zhì)控要求 趙熒張栩胤 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系 北京100191 制備一張優(yōu)質(zhì)的教學(xué)切片，更多的關(guān)注于石蠟切片制備的質(zhì)量，如標(biāo)本新鮮性和固定質(zhì)量、標(biāo)本后續(xù)處理是否恰當(dāng)以及切片制備的質(zhì)量等。然而，HE染色質(zhì)量，即組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，染色透明度高，核漿顏色分明，紅藍(lán)色彩匹配適度，也具有同等的重要性。首先，Ehrlich蘇木精質(zhì)量決定著細(xì)胞核染色質(zhì)量。不同配制方法的主要差別在硫酸鋁鉀的計(jì)量上。硫酸鋁鉀的鋁離子與氧化型蘇木精（蘇木紅）螯合生成藍(lán)紫色的鋁－蘇木紅色淀（正電荷），與細(xì)胞核內(nèi)脫氧核糖核酸的磷酸基（負(fù)電荷）結(jié)合而完成染色的。色淀的數(shù)量決定著蘇木精染色效力，硫酸鋁鉀過飽和狀態(tài)可提高鋁－蘇木紅色淀的結(jié)合率。自然氧化最適合Ehrlich蘇木精，陽光照射、環(huán)境溫度、通風(fēng)性、容器空余空間以及攪動染液頻率均可增強(qiáng)其氧化進(jìn)程。對組織切片染色效果的檢驗(yàn)是確定蘇木精成熟與否的唯一標(biāo)準(zhǔn)。第二，Ehrlich蘇木精屬退行性染色，多染多退是其染色特點(diǎn)。分化液推薦使用0.5%鹽酸酒精（70%），酸濃度較低，能更好地把控分化程度，顯微鏡鏡檢以細(xì)胞核染色質(zhì)清晰為藍(lán)色、細(xì)胞質(zhì)及其他成分為淡淡的亮灰色為好。若鏡檢呈現(xiàn)胞核顏色過深或過淺都會影響紅藍(lán)顏色的匹配度。另外，對粘蛋白（軟骨粘多糖）顯示以及酸性脫鈣液處理的骨組織染色細(xì)節(jié)顯示更為Ehrlich蘇木精的染色特點(diǎn)。第三，伊紅染色與蘇木精顏色的相匹配是HE染色的最佳效果。HE染色中，蘇木精染色是基調(diào)，伊紅染色是通過其紅色到粉色的顏色漸變與蘇木精相匹配，可區(qū)分顯示不同類型的細(xì)胞胞質(zhì)以及不同類型纖維和基質(zhì)。在伊紅最佳p H3－4.5范圍染色，能增強(qiáng)其染色性和色彩銳度。第四，脫蠟和水合、脫水和透明兩個(gè)過程對染色的重要性不可忽視。前者可能導(dǎo)致染色不鮮艷、色淺；后者脫水不徹底，導(dǎo)致透明不完全而影響切片的清晰性和透明度。第五，固定劑與HE染色的匹配性。Susa、Zenke、Helly固定劑與Ehrlich蘇木精－伊紅（伊紅Y，1% 水溶液）染色搭配是最佳，為組織細(xì)胞著色提供鮮亮的染色效果，即細(xì)胞核染色質(zhì)呈現(xiàn)強(qiáng)烈著色性，對組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞胞質(zhì)及嗜酸性顆粒產(chǎn)生鮮艷的紅色和粉紅色。

83.肥大細(xì)胞甲苯胺藍(lán)－PAS染色改良法 張祥令 蘇敏 黃悅 洪艷 許愛萍 貴州醫(yī)科大組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 貴陽550004 肥大細(xì)胞是疏松結(jié)締組織中常見的細(xì)胞，其胞質(zhì)中充滿粗大的嗜堿性顆粒，有異染性，顆粒易溶于水，顆粒內(nèi)含有肝素、組胺和嗜堿性粒細(xì)胞趨化因子等 。肥大細(xì)胞染色方法種類很多，常用甲苯胺藍(lán)染色，但普通的甲苯胺藍(lán)染色對于該顆粒的顯示不是十分明顯，對比度不強(qiáng)。為了滿足教學(xué)和科研的需要，我們經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，篩選出甲苯胺藍(lán)－PAS染色法。該方法能夠快速染色，且特異性強(qiáng)，效果穩(wěn)定，并能將肥大細(xì)胞的典型形態(tài)結(jié)構(gòu)清楚顯示，為肥大細(xì)胞的研究提供了一種簡便可行的新的染色方法。取材時(shí)采用拉斷脊柱法處死小鼠，取皮下組織平鋪于載玻片上，風(fēng)干后經(jīng)AFA固定液固定40min；進(jìn)行甲苯胺藍(lán)－PAS染色，其結(jié)果肥大細(xì)胞鋪片沿著小血管3～5成群分布，結(jié)構(gòu)典型清晰，細(xì)胞形態(tài)完整，胞質(zhì)中充滿粗大的異染性紫紅色顆粒，顆粒明顯，核不著色。在制作肥大細(xì)胞時(shí)，可用皮下組織或取腸系膜鋪片，鋪片制作技術(shù)難點(diǎn)主要在于是否得到平展的膜組織；因此組織鋪片時(shí)，不能太用力拉，如果用力太大，細(xì)胞被拉破壞；如果拉力不夠，鋪片太厚，組織不平，細(xì)胞被結(jié)締組織覆蓋，不利于標(biāo)本的鏡下觀察，也不利于組織封片。固定時(shí)應(yīng)適當(dāng)延長固定時(shí)間，在制作過程中為了防止其他雜質(zhì)污染標(biāo)本，固定前要用95%酒精充分洗去皮下組織表面的血液和雜質(zhì)。肥大細(xì)胞的固定，使用AFA固定液，對肥大細(xì)胞的顆粒和核固定較佳，顆粒更清晰可見。作為教學(xué)切片使用的標(biāo)本要求較高，肥大細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)典型，胞質(zhì)內(nèi)嗜堿性顆粒清晰。

84.卵巢癌SKOV3、SKOV3／DDP細(xì)胞中胞質(zhì)及線粒體鈣離子含量的激光共聚焦顯微鏡術(shù)檢測 劉師兵1于洋1李松巖1田洪艷2李質(zhì)馨2徐冶1吉林醫(yī)藥學(xué)院1醫(yī)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)室；2組胚教研室 吉林132013為了檢測卵巢癌SKOV3（順鉑敏感）和SKOV3／DDP（順鉑耐受）細(xì)胞對鈣離子激動劑（ATP、thapsigargin）反應(yīng)的差異，我們采用鈣離子敏感的熒光探針Fluor－4／AM（檢測胞質(zhì)鈣）和Rhod－2／AM（檢測線粒體鈣）進(jìn)行檢測。細(xì)胞提前一天鋪24孔板，鈣離子探針負(fù)載完成后，將24孔板放置于共聚焦顯微鏡載物臺上，加藥前采集圖像1－2 min，再于采圖區(qū)加入藥物50μl，然后檢測鈣離子含量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SKOV3細(xì)胞在加入ATP（200μmol／L）后，胞質(zhì)鈣離子含量急劇上升然后緩慢下降，在加藥約180s后恢復(fù)到基礎(chǔ)水平，而線粒體鈣離子含量在加藥后出現(xiàn)快速升高，在加藥約20 s后達(dá)到峰值，并持續(xù)處于高水平；SKOV3／DDP細(xì)胞在加入ATP后，胞質(zhì)鈣離子表現(xiàn)為大幅度劇烈震蕩，持續(xù)約160 s后恢復(fù)到基礎(chǔ)水平，而其線粒體鈣離子含量在加藥后出現(xiàn)短暫小幅升高，很快恢復(fù)，與加藥前相比變化不明顯。我們采用毒胡蘿卜內(nèi)脂（thapsigargin，TG）作用于兩種細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在SKOV3細(xì)胞，加入TG（10μmol／L）后，胞質(zhì)鈣離子迅速出現(xiàn)上升峰（持續(xù)約5 min），恢復(fù)至基礎(chǔ)水平然后持續(xù)增加，而線粒體鈣離子在加藥后出現(xiàn)快速劇烈的上升峰（持續(xù)約10 min），然后恢復(fù)至基礎(chǔ)水平并維持60 min后，逐漸持續(xù)升高；而在SKOV3／DDP細(xì)胞，加入TG后胞質(zhì)鈣離子出現(xiàn)快速劇烈上升峰（持續(xù)約3 min），然后恢復(fù)至基礎(chǔ)水平，表現(xiàn)為低幅波動，而其線粒體鈣離子在加藥后出現(xiàn)低幅周期性震蕩，沒有明顯升高。以上結(jié)果表明，對順鉑敏感性差異顯著的兩種卵巢癌細(xì)胞SKOV3，其對鈣離子激動劑的反應(yīng)性存在顯著差異，順鉑敏感的SKOV3細(xì)胞對鈣離子激動劑敏感，其胞質(zhì)和線粒體鈣離子隨著藥物作用而明顯升高；而順鉑耐受的SKOV3／DDP細(xì)胞對鈣離子激動劑不敏感，其胞質(zhì)和線粒體鈣離子在藥物作用后能夠很快恢復(fù)至基礎(chǔ)水平（本研究受國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目81372793資助）。

85.常規(guī)石蠟制片中脫水透明流程的改進(jìn)及其應(yīng)用 鄭翔 周雪 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)專業(yè)實(shí)驗(yàn)室 成都610041 常規(guī)石蠟制片是組織學(xué)與病理學(xué)的核心技術(shù)之一，目前乙醇－二甲苯、乙醇－三氯甲烷或乙醇－丁醇流程為標(biāo)本脫水透明所采用的主要流程。標(biāo)本易硬化和嚴(yán)重收縮是乙醇－二甲苯流程的缺點(diǎn)，而后兩種方法耗時(shí)較長，且標(biāo)本仍有明顯收縮。在70%乙醇浸透后，改用70%－四氫呋喃1：1（v／v）液和2份純四氫呋喃依次脫水，然后常規(guī)浸蠟。對于厚度不超過5 mm的標(biāo)本，各步脫水時(shí)間約為30 min。改進(jìn)后，標(biāo)本無收縮，鏡下結(jié)構(gòu)真實(shí)、精細(xì)；即使浸泡過夜也不會出現(xiàn)過度硬化，切片操作難度小。脫水透明全過程耗時(shí)一般不超過4 h，遠(yuǎn)快于乙醇－二甲苯流程。四氫呋喃毒性很低，對人體危害??；其揮發(fā)性強(qiáng)，易于從石蠟中清除，提高了包埋蠟的回收效率。在免疫染色、原位雜交等實(shí)驗(yàn)中，乙醇－四氫呋喃流程的效果與傳統(tǒng)方法相當(dāng)，不會影響檢測結(jié)果。新的乙醇－四氫呋喃流程應(yīng)用于研究與教學(xué)，可大大提升質(zhì)量與效率。比如，采用新流程后，快速制作整齊美觀的陣列片成為可能。陣列片一方面可用于教學(xué)和考試，另一方面也可制作科研對照切片，確保染色結(jié)果的可比性和準(zhǔn)確性。又如，繪制腦定位圖譜時(shí)某些動物大尺寸的腦標(biāo)本難以進(jìn)行石蠟切片；如果分割包埋，因標(biāo)本收縮會造成極大的定位誤差。乙醇－四氫呋喃流程中標(biāo)本不收縮，可分割包埋，切片連續(xù)性好，定位尺寸準(zhǔn)確。此外，借助搖床可將脫水透明流程的耗時(shí)縮短到90 min以內(nèi)，有助于開展顯微制片技術(shù)課程的教學(xué)。綜上，乙醇－四氫呋喃脫水流程具有無收縮、不硬化、速度快等顯著優(yōu)勢，可取代現(xiàn)有流程應(yīng)用到石蠟顯微制片的日常工作中。

86.虛擬切片和數(shù)碼互動在組織學(xué)中的應(yīng)用 馮先玲 沙鷗 王曉梅 劉健華 深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系 深圳518060 傳統(tǒng)的組織學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)主要是學(xué)生利用顯微鏡觀察玻璃切片，而這種教學(xué)模式存在諸多弊端，如切片制作繁瑣、成本高、易破損、易褪色以及玻璃切片觀察對顯微鏡的依賴，使得學(xué)生學(xué)習(xí)受到空間和時(shí)間的限制。隨著信息技術(shù)和數(shù)字化的發(fā)展，探索玻璃切片轉(zhuǎn)換為虛擬數(shù)字切片，建立數(shù)字切片庫，成為當(dāng)前組織學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的主要內(nèi)容。深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部初步建成了虛擬顯微鏡數(shù)字切片庫及遠(yuǎn)程訪問系統(tǒng)，在本院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)生中采用了傳統(tǒng)玻璃切片結(jié)合數(shù)字切片觀察的實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式，并聯(lián)合應(yīng)用顯微鏡數(shù)碼互動系統(tǒng)和遠(yuǎn)程訪問系統(tǒng)進(jìn)行授課。課程結(jié)束后，對參與該實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式教學(xué)的學(xué)生進(jìn)行問卷調(diào)查，結(jié)果顯示，大多數(shù)學(xué)生都認(rèn)為虛擬顯微鏡數(shù)字切片與傳統(tǒng)玻璃切片相比有一定的優(yōu)越性。數(shù)字切片高效仿真模擬顯微鏡功能，圖像清晰且可以根據(jù)需要放大縮小，更重要的是學(xué)生可以借助網(wǎng)絡(luò)遠(yuǎn)程訪問數(shù)字切片庫，打破了實(shí)驗(yàn)教學(xué)在時(shí)間和空間的局限性，使學(xué)生在有效的時(shí)間內(nèi)獲得更多的知識。與此同時(shí)，數(shù)碼互動系統(tǒng)所展現(xiàn)出的便捷、直觀，以及強(qiáng)大的示教和雙向溝通能力，很大程度上提高了形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的效果，并被師生廣泛的認(rèn)可和接受，目前已廣泛應(yīng)用于形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中。數(shù)字切片與顯微鏡數(shù)碼互動聯(lián)合應(yīng)用于傳統(tǒng)的組織學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，實(shí)現(xiàn)了數(shù)字化顯微實(shí)驗(yàn)互動教學(xué)和遠(yuǎn)程服務(wù)，提高了教學(xué)效果，得到了廣大師生肯定和支持。但現(xiàn)階段，數(shù)字切片庫仍在不斷地完善中，數(shù)字切片完全取代玻璃切片進(jìn)行教學(xué)的條件尚不成熟。在不久的將來，數(shù)字切片將克服現(xiàn)階段的不足，并將逐漸廣泛的應(yīng)用到形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中。

87.基于網(wǎng)絡(luò)的虛擬顯微鏡系統(tǒng)輔助教學(xué)平臺的應(yīng)用 田衍平 李成仁 劉運(yùn)來 秦茂林 肖嵐 李紅麗第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 發(fā)育生物學(xué)教研室 重慶400038 由于學(xué)生的數(shù)量大，師資短缺和教學(xué)設(shè)備的限制，國內(nèi)組織學(xué)課程的教學(xué)常使用傳統(tǒng)的課件講授、傳統(tǒng)教材和光學(xué)顯微鏡的方式進(jìn)行教學(xué)。該方式在傳授知識方面是一種很好的方法，但不利于學(xué)生主動學(xué)習(xí)和問題解決能力的培養(yǎng)。研究顯示，基于網(wǎng)絡(luò)的虛擬顯微鏡（virtual microscopy，VM）系統(tǒng)是一種有效的教育策略。本研究描述我校VM系統(tǒng)在本科生組織學(xué)與胚胎學(xué)教學(xué)中的應(yīng)用，并評估該策略促進(jìn)學(xué)生主動學(xué)習(xí)和問題解決能力的效果。以我校229名大學(xué)二年級學(xué)生為研究對象，分成VM組和光學(xué)顯微鏡組（light microscopy，LM）兩組進(jìn)行教學(xué)。VM組使用虛擬顯微鏡系統(tǒng)進(jìn)行教學(xué)，通過案例分析，自主學(xué)習(xí)并進(jìn)行學(xué)生間討論，線上線下與教員交流等形式進(jìn)行學(xué)習(xí)，LM組采用傳統(tǒng)教學(xué)方式進(jìn)行。教學(xué)完成后對學(xué)習(xí)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在基礎(chǔ)知識得分方面兩組沒有顯著性差異；然而在案例分析題和組織結(jié)構(gòu)的鑒別方面，VM組平均得分顯著高于LM組。問卷調(diào)查結(jié)果顯示，在使用VM系統(tǒng)學(xué)習(xí)過程中，學(xué)生的學(xué)習(xí)效率和問題解決的能力得到顯著提高。此外，學(xué)生在課外資源獲取能力，批判性思維和自信心方面也得到很好的鍛煉。因此，基于網(wǎng)絡(luò)的虛擬顯微鏡系統(tǒng)作為一個(gè)有效的輔助教學(xué)平臺，在組織學(xué)與胚胎學(xué)教學(xué)的應(yīng)用能促進(jìn)學(xué)生主動學(xué)習(xí)和問題解決的能力。

88.組織學(xué)數(shù)字化教學(xué)與自主學(xué)習(xí)平臺建設(shè) 劉向前 王小麗 李和 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 武漢430030 隨著計(jì)算機(jī)和網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的快速發(fā)展，各種數(shù)字化教學(xué)資源不斷涌現(xiàn)。數(shù)字切片，也稱虛擬顯微鏡或虛擬切片，是上世紀(jì)末才逐漸發(fā)展起來的一種新技術(shù)，近年已廣泛應(yīng)用于病理診斷、形態(tài)學(xué)教學(xué)與醫(yī)學(xué)研究等方面。我校于2008年就建設(shè)了數(shù)字切片庫用于各形態(tài)學(xué)科，特別是醫(yī)學(xué)組織學(xué)的實(shí)驗(yàn)課教學(xué)，取得了良好的效果。為了進(jìn)一步深化教學(xué)改革，方便學(xué)生自主學(xué)習(xí)和開展"翻轉(zhuǎn)課堂"教學(xué)，我們與山東易創(chuàng)電子有限公司合作，更新完善了組織學(xué)數(shù)字切片網(wǎng)絡(luò)平臺，并新增了課件管理、考試系統(tǒng)和統(tǒng)計(jì)分析等欄目。課件管理將組織學(xué)基本理論知識與數(shù)字切片實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)教程集于一體，一方面，教師可將其用作組織學(xué)理論課與實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)課件；另一方面，可以避免學(xué)生在學(xué)習(xí)過程常常將理論課與實(shí)驗(yàn)課相脫節(jié)的錯(cuò)誤學(xué)習(xí)方式，從而加深對組織學(xué)各知識點(diǎn)的理解和掌握，提高學(xué)習(xí)效率?？荚囅到y(tǒng)包括題庫建設(shè)、試卷管理、考試管理和成績統(tǒng)計(jì)等，除了用于學(xué)生對組織學(xué)理論與實(shí)驗(yàn)知識的自我測試，從而查漏補(bǔ)缺，也可用于教師隨時(shí)掌握學(xué)生的學(xué)習(xí)情況，進(jìn)行及時(shí)輔導(dǎo)，還可用于教師進(jìn)行快速的出題組卷。此外，欄目中還設(shè)置了老師問答、內(nèi)容討論等師生互動部分，從而極大地拓展了數(shù)字切片網(wǎng)絡(luò)平臺的教學(xué)功能。

89.專業(yè)化社會化的網(wǎng)絡(luò)學(xué)科導(dǎo)航平臺為醫(yī)學(xué)教育體系保駕 林冬靜1徐冶2田洪艷1李質(zhì)馨1劉忠平1竇肇華1吉林醫(yī)藥學(xué)院1組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室；2基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室中心 吉林132013 《中國醫(yī)學(xué)教育改革和發(fā)展綱要》明確指出我國的醫(yī)學(xué)教育事業(yè)初步建立了包括學(xué)?；A(chǔ)教育、畢業(yè)后教育、繼續(xù)教育的連續(xù)統(tǒng)一的醫(yī)學(xué)教育體系。目前，醫(yī)學(xué)教育的規(guī)模、質(zhì)量、效益有了明顯提高。為了更加有效的改革醫(yī)學(xué)教育專業(yè)口徑過窄、素質(zhì)教育薄弱、教學(xué)模式單一、教學(xué)內(nèi)容陳舊、教學(xué)方法過死等狀況，高等醫(yī)學(xué)教育實(shí)施了一系列改革計(jì)劃，注重醫(yī)學(xué)生基礎(chǔ)理論、基本知識、基本技能的培養(yǎng)，促進(jìn)了醫(yī)學(xué)生在知識、能力、綜合素質(zhì)和創(chuàng)新思維等方面的發(fā)展，使醫(yī)學(xué)教育質(zhì)量穩(wěn)步提高。本文通過分析和整合國內(nèi)、外專業(yè)化社會化的網(wǎng)絡(luò)學(xué)科導(dǎo)航，其中涵蓋國家精品課程共享服務(wù)信息平臺、醫(yī)藥生命科學(xué)專業(yè)網(wǎng)站、專業(yè)性科技工作者的學(xué)術(shù)團(tuán)體三大領(lǐng)域，以及利用這些信息化設(shè)備進(jìn)行教學(xué)的便攜式電子書包，為各體系人員的學(xué)習(xí)提供一個(gè)分享、下載的拓寬資源。借助整合這些信息資源，輔以培養(yǎng)學(xué)生和相關(guān)從業(yè)人員的自學(xué)能力、獲取知識的能力和創(chuàng)新能力，其目的性強(qiáng)、針對性強(qiáng)、省時(shí)省力，達(dá)到事半功倍的教學(xué)功能。

90.中山大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)慕課教學(xué)平臺的建立及實(shí)踐 馮英 丁英 曾園山 中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院組胚教研室 廣州510080 在網(wǎng)絡(luò)時(shí)代，知識的學(xué)習(xí)和傳播方式本身正在發(fā)生變化。而現(xiàn)有的知識生產(chǎn)和傳播媒介（如大學(xué)、媒體等）從制度體系上不能完全適應(yīng)這種變革，因而導(dǎo)致了慕課傳媒課堂的渴求現(xiàn)象。慕課是順應(yīng)這一大變革而產(chǎn)生的動態(tài)知識建構(gòu)模式，是更多元的知識傳播途徑和更人性化學(xué)習(xí)過程，一定程度上促進(jìn)了知識傳播及收到網(wǎng)絡(luò)時(shí)代下學(xué)生的歡迎。中山大學(xué)《組織學(xué)與胚胎學(xué)》課程通過搭建慕課教學(xué)平臺，以最小的成本、最快的速度，建起功能完備、有創(chuàng)新研究意義、具備中國特色的新型教學(xué)平臺。該平臺的建立從一定程度上克服了傳統(tǒng)教學(xué)來源不一、難度參差及內(nèi)容重疊、缺乏連貫的缺點(diǎn)，使學(xué)生可以通過注冊"在線云課堂"加入自己感興趣的課程，制定自己的學(xué)習(xí)計(jì)劃，然后進(jìn)行在線學(xué)習(xí)、練習(xí)、討論和自我測試，從而達(dá)到提升學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣、師生互動和個(gè)性化學(xué)習(xí)及終生學(xué)習(xí)的良好作用，并對教學(xué)觀念及方法、學(xué)習(xí)方法的改變產(chǎn)生巨大影響，而且提升了各學(xué)科整體的教學(xué)水平，并能與其他學(xué)校、其他專業(yè)進(jìn)行教學(xué)資源的共享。在此基礎(chǔ)上，我們將繼續(xù)完善并推廣本學(xué)科慕課教學(xué)平臺，充分發(fā)揮其大規(guī)模、開放、在線課程的特征，結(jié)合本專業(yè)本身教學(xué)特點(diǎn)，解決實(shí)際教學(xué)問題，從而進(jìn)一步提升我們的專業(yè)教學(xué)效果，為組織學(xué)與胚胎學(xué)這門基礎(chǔ)課程的教學(xué)改革及實(shí)踐做出應(yīng)有的貢獻(xiàn)，充分調(diào)動廣大師生的教學(xué)及學(xué)習(xí)積極性。

91.人體組織學(xué)數(shù)字化切片視聽課程的構(gòu)建及探索 馮樹梅1廖禮彬1秦紋1李甜1郭瓊1李艷1白生賓1海米提1李秀梅1夏潮涌2鐘近潔11新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 烏魯木齊8300112暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 廣州510632 為在互聯(lián)網(wǎng)時(shí)代全面提升教學(xué)水平，拓展多元化學(xué)習(xí)方式，建立全新的數(shù)字化教學(xué)模式。我教研室以自制人體組織學(xué)石蠟切片為基礎(chǔ)，建立了全套人體組織學(xué)全景數(shù)字化掃描切片庫，并通過數(shù)字化切片的無縫觀察，同步人聲講解，視頻錄播、圖像編輯、字幕顯示等技術(shù)方法，制作出人體組織學(xué)數(shù)字化切片視聽課程。該視聽課程上傳至互聯(lián)網(wǎng)后，可提供在不同倍數(shù)下數(shù)字化切片瀏覽，并配有專業(yè)教師講解及字幕顯示，可供學(xué)生在課前課后隨機(jī)進(jìn)行學(xué)習(xí)，實(shí)現(xiàn)虛擬化教學(xué)和移動學(xué)習(xí)，同時(shí)人體組織學(xué)數(shù)字化視聽課程是對傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的有益補(bǔ)充，是對數(shù)字化切片的進(jìn)一步提升，也是對數(shù)字化教學(xué)模式的大膽嘗試。

92.創(chuàng)新型教學(xué)模式在人體發(fā)生學(xué)教學(xué)中的嘗試 吳巖 賽恒 李斌 劉曉峰 吳迪 呂鵬 張雪梅 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室 呼和浩特010059 本研究嘗試將“翻轉(zhuǎn)課堂”和CBL教學(xué)模式引入人體發(fā)生學(xué)教學(xué)，探討該方法在研究生選修課教學(xué)實(shí)踐中的優(yōu)勢。選擇2014級選修人體發(fā)生學(xué)課程的研究生作為研究對象，應(yīng)用“翻轉(zhuǎn)課堂”結(jié)合CBL教學(xué)模式展開教學(xué)。教學(xué)前進(jìn)行充分的準(zhǔn)備工作；課堂上教師通過結(jié)合微視頻等進(jìn)行知識回顧，通過現(xiàn)場答疑和病例討論對重點(diǎn)問題分層次多形式講解；在教學(xué)過程中隨時(shí)與學(xué)生溝通，征求學(xué)生意見，課程結(jié)束后，對學(xué)生進(jìn)行問卷調(diào)查并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。由于將教學(xué)安排重新規(guī)劃，將知識傳遞放在課前完成，學(xué)生能夠自己掌握學(xué)習(xí)內(nèi)容和學(xué)習(xí)進(jìn)度。在課堂內(nèi)大量應(yīng)用短小視頻，增加了師生互動和討論，爭取最大程度將學(xué)生普遍反應(yīng)的難點(diǎn)問題來進(jìn)行知識的建構(gòu)和內(nèi)化。老師把課堂讓位于學(xué)生，由課堂內(nèi)容的傳授者變?yōu)閷W(xué)習(xí)過程的指導(dǎo)者與促進(jìn)者，學(xué)生則由被動接受的聽眾轉(zhuǎn)變?yōu)榉e極主動的參與者。通過聯(lián)系臨床實(shí)際的案例及與其密切聯(lián)系的一系列提問，既聯(lián)系教學(xué)內(nèi)容又具有啟發(fā)性和針對性，學(xué)生的注意力能迅速集中到課堂內(nèi)容上，使學(xué)生作為課堂的主體能積極主動參與到案例問題的分析討論之中，形成自主性研究問題的思維，進(jìn)而推進(jìn)課堂研討的氛圍，同時(shí)又鍛煉和提高了學(xué)生解決實(shí)際問題和綜合分析問題能力。學(xué)生對于知識的理解和教學(xué)效果的認(rèn)可優(yōu)于傳統(tǒng)教學(xué)。研究生人體發(fā)生學(xué)教學(xué)中"翻轉(zhuǎn)課堂"結(jié)合CBL的教學(xué)模式被證明是一種深受學(xué)生歡迎、取得顯著教學(xué)效果的一次成功創(chuàng)新嘗試可以在本科教學(xué)中加以推廣。

93.胚胎學(xué)教學(xué)內(nèi)容的改進(jìn) 馬征來 暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室廣州510632 目前醫(yī)學(xué)院校組織學(xué)與胚胎學(xué)教育過程中所存在一些不足，教學(xué)內(nèi)容枯燥乏味，僅僅簡略地用一些破舊的教具講述三胚層分化、顏面部的分化、模式圖化了的心臟外形變化以及各腔室的分隔，不形象、不具體、不生動；內(nèi)容枯燥乏味，氣氛缺乏活力，學(xué)生厭學(xué)老師厭講。為了使胚胎學(xué)教學(xué)內(nèi)容變的豐富，生動，所以改變胚胎學(xué)教學(xué)的這一現(xiàn)狀迫在眉睫。通過對傳統(tǒng)的骨骼染色方法進(jìn)行創(chuàng)新改進(jìn)，我們首創(chuàng)"水晶骨骼藝術(shù)"，運(yùn)用獨(dú)特的方法對骨骼染色后可使骨骼達(dá)到裸眼4D－Xray的視覺效果，讓觀賞者既有很強(qiáng)視覺沖擊力，又可以達(dá)到探索、認(rèn)識和感受大自然的目的。通過骨骼染色，一改傳統(tǒng)的模式圖的教學(xué)模式，可以清晰的顯示胚胎時(shí)期軟骨內(nèi)成骨、膜內(nèi)成骨、以及混合成骨方式；同時(shí)意外的收獲是：發(fā)現(xiàn)胚胎時(shí)期心臟流出道的觀察方法（以雞胚為模型），即不同時(shí)期的胚胎95%酒精固定過夜，去皮稍稍去內(nèi)臟，95%酒精繼續(xù)浸泡4天，1%氫氧化鉀軟化至半透明，隨后梯度甘油透明，心臟的流出道可以清晰的展示出來。如此既可以用于心血管發(fā)生的教學(xué)也可以用于科學(xué)研究。目前我們已經(jīng)創(chuàng)作出一些具有代表意義的作品，如骨骼發(fā)生、心臟發(fā)生、眼睛發(fā)生、神經(jīng)發(fā)生的等，下一步計(jì)劃做更多的作品，豐富胚胎學(xué)教學(xué)內(nèi)容，提高教學(xué)質(zhì)量，充分激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性。

94.組織學(xué)與胚胎學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中融入生理學(xué)知識的TBL教學(xué)模式的探索 張標(biāo) 陳東 葉曉霞 馬瑗鍰衣艷梅 吳民華 廣東醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 湛江524023 傳統(tǒng)的組織學(xué)與胚胎學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)融入生理學(xué)知識采用以授課為基礎(chǔ)的學(xué)習(xí)（lecture－based learning，LBL）模式，在此過程中，學(xué)生處于被動接受知識，按照實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)機(jī)械地觀察切片中的形態(tài)結(jié)構(gòu)，沒有認(rèn)真思考結(jié)構(gòu)和功能的聯(lián)系，因此教學(xué)效果并不理想。以團(tuán)隊(duì)為基礎(chǔ)的學(xué)習(xí)（team－based learning，TBL）是以學(xué)生為主體，以團(tuán)隊(duì)為基礎(chǔ)，提倡學(xué)生自主學(xué)習(xí)的新型教學(xué)模式。能否采用TBL教學(xué)模式提高組織學(xué)與胚胎學(xué)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)的效果呢？廣東醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室在臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)進(jìn)行了組織學(xué)與胚胎學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中應(yīng)用TBL教學(xué)模式融入生理學(xué)知識的探索。實(shí)踐證明，與傳統(tǒng)的LBL教學(xué)模式相比較，TBL教學(xué)模式極大激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，變被動學(xué)習(xí)到主動探究，提高了學(xué)生學(xué)習(xí)的主動性和積極性，增強(qiáng)了學(xué)生靈活運(yùn)用理論知識分析問題和解決問題的能力，學(xué)生的綜合素質(zhì)有了一定的提升。對采用TBL教學(xué)模式的學(xué)生問卷調(diào)查分析，100%的學(xué)生表示喜歡該教學(xué)模式；90.3%的學(xué)生認(rèn)為組織學(xué)與胚胎學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)融入生理學(xué)知識很好；93.5%的學(xué)生認(rèn)為通過自主學(xué)習(xí)、團(tuán)隊(duì)合作及師生互動提高了自身分析和解決問題的能力。通過統(tǒng)一命題、統(tǒng)一考試、統(tǒng)一閱卷，實(shí)驗(yàn)課考試成績TBL教學(xué)班及格率100%，平均成績85.8分；LBL教學(xué)班及格率為90.2%，平均成績?yōu)?0.0分。期末總評成績，TBL教學(xué)班及格率100%，平均成績72.4分；LBL教學(xué)班及格率為81.3%，平均成績?yōu)?8.9分。由此可見，采用TBL教學(xué)模式，將結(jié)構(gòu)和功能相結(jié)合，有利于提高組織學(xué)與胚胎學(xué)的教學(xué)效果。

95.組織學(xué)與胚胎學(xué)實(shí)驗(yàn)課創(chuàng)新性教學(xué)模式的探討 吳迪吳巖李斌賽恒劉曉峰 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室 呼和浩特010059 組織學(xué)與胚胎學(xué)知識結(jié)構(gòu)涉及平面與立體、局部與整體相結(jié)合的特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)課成為組織學(xué)與胚胎學(xué)教學(xué)的必要環(huán)節(jié)。改進(jìn)實(shí)驗(yàn)課教學(xué)方法，激活學(xué)生的思維能力，培養(yǎng)學(xué)生的觀察能力，增強(qiáng)學(xué)生的動手能力，是組織學(xué)與胚胎學(xué)教學(xué)一直在探索的方向。本研究對象為2014級本科口腔班29人。授課方式由教師提前一周將實(shí)驗(yàn)內(nèi)容發(fā)給學(xué)生，要求學(xué)生完成對相關(guān)理論知識的討論和學(xué)習(xí)，并針對實(shí)驗(yàn)課觀察切片內(nèi)容制成PPT。實(shí)驗(yàn)課上，最初15分鐘由教師提出學(xué)習(xí)要求、提出問題，之后由學(xué)生報(bào)告準(zhǔn)備的PPT，教師進(jìn)行點(diǎn)評。然后，學(xué)生自行觀察切片并繪制光鏡圖，并可利用現(xiàn)代教學(xué)互動平臺拍攝收集自制組織學(xué)圖譜。最后，教師根據(jù)學(xué)生的學(xué)習(xí)情況，再提出問題，引導(dǎo)學(xué)生思考或補(bǔ)充講解，針對實(shí)驗(yàn)課內(nèi)容進(jìn)行總結(jié)分析。通過應(yīng)用這種教學(xué)模式，調(diào)動了學(xué)生的學(xué)習(xí)主動性和自覺性，增強(qiáng)了學(xué)生學(xué)習(xí)興趣，學(xué)生的學(xué)習(xí)能力普遍提高。這種教學(xué)模式以學(xué)生為主體，課下學(xué)生參與備課，課上學(xué)習(xí)環(huán)節(jié)以討論交流為主，教師引導(dǎo)、鼓勵(lì)學(xué)生主動提問和積極參與，不僅有利于學(xué)生對知識的深化掌握，也有助學(xué)生語言表達(dá)能力、交流能力和思考能力的提高（本研究受內(nèi)蒙古自治區(qū)高等教育科學(xué)研究"十二五"規(guī)劃立項(xiàng)課題NGJGH2014034資助）。

96.2013級臨床本科組織學(xué)與胚胎學(xué)課程全英教學(xué)體會 陳鸛霏1馮先玲1馬保華2管又飛1謝苗1范新民1馬曉松1沙鷗11深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部醫(yī)學(xué)系 深圳518000，2山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室 濟(jì)南250012 全英教學(xué)是當(dāng)今中國高校面對時(shí)代發(fā)展而產(chǎn)生的新的教學(xué)模式，是勢在必行的重要措施。在醫(yī)學(xué)教育中推行全英教學(xué)有利于培養(yǎng)具有國際競爭力的高級醫(yī)學(xué)人才。深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部本著"高端、精英、超前、精湛"的辦學(xué)理念，學(xué)部引進(jìn)的絕大多數(shù)教師均具有海外留學(xué)背景，英語口語流利；錄取的學(xué)生則要通過面試擇優(yōu)錄取英語水平佳的同學(xué)，使得全英教學(xué)成為可能。臨床醫(yī)學(xué)本科專業(yè)組織學(xué)與胚胎學(xué)課程一直使用全英教學(xué)改革模式。教師課前編寫合適的英文課件和教學(xué)計(jì)劃在每次課前發(fā)給學(xué)生予以預(yù)習(xí)，課堂中用通俗的語言反復(fù)解釋重點(diǎn)知識點(diǎn)，加強(qiáng)互動等方式提高學(xué)生對全英課程的興趣。本文對30名2013級臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)生進(jìn)行了反饋意見調(diào)查分析。結(jié)果顯示，絕大部分同學(xué)對組織學(xué)與胚胎學(xué)全英教學(xué)持贊同態(tài)度，組織學(xué)與胚胎學(xué)課程中采用全英教學(xué)教學(xué)效果良好。當(dāng)然，組織學(xué)與胚胎學(xué)全英教學(xué)也面臨著諸多問題。英語水平相對較差的同學(xué)，要在理解抽象的專業(yè)知識的基礎(chǔ)上，同時(shí)掌握大量復(fù)雜生僻的醫(yī)學(xué)專業(yè)詞匯，難免會在上課時(shí)產(chǎn)生抵觸情緒；額外占用大量時(shí)間記憶專業(yè)詞匯，導(dǎo)致學(xué)生對書本知識的廣度和深度挖掘受到影響；缺少合適的英文教材，也在學(xué)習(xí)時(shí)也給同學(xué)們造成了困擾。我們要正確看待教學(xué)過程中產(chǎn)生的問題，設(shè)法克服困難，在借鑒國內(nèi)外先進(jìn)的教學(xué)理論與經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合自身實(shí)際，創(chuàng)造性的探求全英教學(xué)的出路，培養(yǎng)高素質(zhì)高層次的醫(yī)學(xué)人才。相信經(jīng)過不斷努力，不斷實(shí)踐，全英教學(xué)會取得更優(yōu)異的成果。

97.從2014年IFAA國際解剖學(xué)工作者協(xié)會聯(lián)合會議看基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教學(xué)改革現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢 鄭蔓茵梁怡琳謝天順牛俊飛曾美琪管又飛謝苗劉志剛范新民沙鷗 深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部醫(yī)學(xué)系深圳518060 國際解剖學(xué)工作者協(xié)會聯(lián)合會議（IFAA）第18屆大會暨中國解剖學(xué)會第30屆學(xué)術(shù)會議于2014年8月在北京國際會議中心順利召開，深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部部分老師和學(xué)生有幸參加了此次學(xué)術(shù)盛會，并在會議期間就基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)，包括解剖學(xué)和組織胚胎學(xué)的教學(xué)改革現(xiàn)狀以及發(fā)展趨勢進(jìn)行了現(xiàn)場問卷分析。本文就此次會議交流內(nèi)容、問卷調(diào)查結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)和分析，發(fā)現(xiàn)各地區(qū)醫(yī)學(xué)院校在會議交流內(nèi)容、課程設(shè)置、教學(xué)改革狀況等方面均存在一定差異和距離，特在此與各位同行進(jìn)行分析和探討。本調(diào)查結(jié)果顯示，①國內(nèi)外各地區(qū)醫(yī)學(xué)院校的局部解剖學(xué)實(shí)踐課平均學(xué)時(shí)（實(shí)體解剖課）占總學(xué)時(shí)比例均超過百分之五十；②國內(nèi)有63%的院校引入虛擬切片，并結(jié)合傳統(tǒng)的玻璃切片進(jìn)行實(shí)踐教學(xué)；③以問題為中心的體系和按照器官系統(tǒng)進(jìn)行綜合教育的體系正逐漸在國內(nèi)的開展，并且隨著學(xué)生自主學(xué)習(xí)能力的提高，有可能占據(jù)教學(xué)體系的重心。此調(diào)查結(jié)果也表明，解剖學(xué)教育中強(qiáng)調(diào)的理論與實(shí)踐相結(jié)合的觀點(diǎn)深入人心；在醫(yī)學(xué)解剖學(xué)教學(xué)中，虛擬現(xiàn)實(shí)技術(shù)不會取代實(shí)體操作教學(xué)，兩者結(jié)合是解剖學(xué)教學(xué)的可能趨勢；隨著虛擬現(xiàn)實(shí)技術(shù)的提高，成本的控制和觀念上的更新，虛擬現(xiàn)實(shí)切片教學(xué)將會進(jìn)一步在全球普及開來，最終替代傳統(tǒng)的玻璃切片教學(xué)，這是組織學(xué)與胚胎學(xué)教學(xué)發(fā)展的可能趨勢；國內(nèi)醫(yī)學(xué)教學(xué)方法將逐漸發(fā)展為以學(xué)生為中心，培養(yǎng)學(xué)生自主學(xué)習(xí)，自主討論和自主解決問題的能力，使學(xué)生早期接觸臨床，樹立獨(dú)立創(chuàng)新意識和自主精神的啟發(fā)式教育模式。

98.人體解剖學(xué)教學(xué)中多種教學(xué)手段的運(yùn)用 安東 蔣吉英 濰坊醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室 濰坊261053 解剖學(xué)的內(nèi)容多、概念多、系統(tǒng)性和實(shí)踐性強(qiáng)，很多同學(xué)感覺難以理解和記憶，針對這些特點(diǎn)，現(xiàn)在出現(xiàn)了傳統(tǒng)教學(xué)模式、CBL、PBL、RBL等多種教學(xué)模式，但每一種教學(xué)模式都有很大優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，也存在一定的不足。如何 合理地使用不同的教學(xué)方法，以提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，培養(yǎng)學(xué)生分析問題和解決問題的能力，增強(qiáng)學(xué)生的創(chuàng)新能力和合作交流的能力，值得我們?nèi)ニ伎己吞接?。本研究針對每一堂課的內(nèi)容，將不同的教學(xué)方法結(jié)合起來，取長補(bǔ)短，同時(shí)也根據(jù)不同教學(xué)方法的不足而提出我們自己的方法，比如畫圖法等。不僅使課堂內(nèi)容非常充實(shí)，而且可以讓學(xué)生更好的理解要學(xué)習(xí)的內(nèi)容，能夠鍛煉學(xué)生的主動學(xué)習(xí)的能力和創(chuàng)新的思維，激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)的興趣，真正做到教學(xué)互動，提高教學(xué)質(zhì)量，真正能夠體現(xiàn)教學(xué)改革的要義。

99.地方醫(yī)學(xué)院局部解剖學(xué)“翻轉(zhuǎn)課堂”教學(xué)模式初探 王曉萃 蔣吉英 王益光 濰坊醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室 濰坊261053 以培養(yǎng)創(chuàng)新能力的醫(yī)學(xué)生為導(dǎo)向，局部解剖學(xué)翻轉(zhuǎn)課堂為目標(biāo)（學(xué)生自己制作課件講授內(nèi)容、教師當(dāng)堂補(bǔ)充、答疑），構(gòu)建一個(gè)科學(xué)合理的評價(jià)體系。獲得評價(jià)反饋信息，從而為進(jìn)行醫(yī)學(xué)專業(yè)課程或教學(xué)模式等改革提供方向和指導(dǎo)，進(jìn)而全面提高基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教育教學(xué)的質(zhì)量。此種教學(xué)改革改變了傳統(tǒng)"滿堂灌"式教育，充分調(diào)動學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性、主動性和創(chuàng)造性，注重培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立思考、主動探索知識的能力，拓寬學(xué)生的視野，充分發(fā)揮學(xué)生的專業(yè)熱情和創(chuàng)新意識。

100.關(guān)于人體解剖學(xué)研究生創(chuàng)新素質(zhì)培養(yǎng)的思考 梁翠宏 蔣吉英 于樹娜 濰坊醫(yī)學(xué)院解剖教研室濰坊261053 研究生的創(chuàng)新素質(zhì)是指研究生的創(chuàng)新意識、創(chuàng)新思維、創(chuàng)新能力等方面，是決定著研究生培養(yǎng)質(zhì)量的關(guān)鍵。人體解剖學(xué)作為一門基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)課程，其研究生的創(chuàng)新素質(zhì)培養(yǎng)現(xiàn)狀向來令人堪憂。影響解剖學(xué)研究生創(chuàng)新素質(zhì)培養(yǎng)的原因除了相對滯后的教學(xué)方法和教學(xué)內(nèi)容之外，解剖學(xué)研究生導(dǎo)師數(shù)量匱乏及學(xué)術(shù)水平參差不齊、擴(kuò)招導(dǎo)致部分濫竽充數(shù)的學(xué)生混入研究生隊(duì)伍之中、以及研究生本身缺乏創(chuàng)新的意識和動力等原因都不可忽視。因此，在適當(dāng)?shù)恼邇A斜以及加強(qiáng)導(dǎo)師自身素養(yǎng)的前提下，建立健全科學(xué)的評價(jià)機(jī)制、教學(xué)機(jī)制及課程體系，推進(jìn)各學(xué)科間的交叉和融合，將有助于解剖學(xué)研究生創(chuàng)新素質(zhì)的培養(yǎng)。

101.混合式翻轉(zhuǎn)課堂及其在組織學(xué)教學(xué)中的應(yīng)用 董為人 黃文華 王華峰 張琳 南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)管理中心 廣州510515 基于混合式學(xué)習(xí)理念，我們設(shè)計(jì)了集小組討論、自主學(xué)習(xí)、問題導(dǎo)向?qū)W習(xí)、慕課等為一體的混合式翻轉(zhuǎn)課堂，并將其應(yīng)用于人體組織學(xué)教學(xué)。該方案基于大量的網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)資源，分為課前準(zhǔn)備（個(gè)人學(xué)習(xí)和小組討論）、課堂辯論（問題演示、組間辯論）、教師總結(jié)（案例或問題）三個(gè)階段，每個(gè)階段都有相應(yīng)的評價(jià)量表。該方案刺激了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，培養(yǎng)團(tuán)隊(duì)精神，提升了自主學(xué)習(xí)能力，深受學(xué)生歡迎，并已在國內(nèi)推廣中。

102.南方醫(yī)科大學(xué)“移動／云桌面”體系的構(gòu)建 董為人1王華峰1薛翔1黃文華1柯志勇1金春華1羅深秋1莊國威21南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)管理中心 廣州510515；2三盟公司 廣州510000 傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室桌面電腦存在缺乏移動性、管理維護(hù)成本高等缺陷。隨著信息技術(shù)尤其是云技術(shù)的發(fā)展，移動學(xué)習(xí)、環(huán)保節(jié)約已成未來實(shí)驗(yàn)室建設(shè)的新趨勢。本研究擬建立可移動性或云桌面實(shí)訓(xùn)體系。與三盟科技有限公司合作，購置服務(wù)器、交換機(jī)、瘦客戶機(jī)等，安裝桌面虛擬化操作系統(tǒng)VMware，將實(shí)驗(yàn)平臺的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容虛擬到云；增加移動學(xué)習(xí)等功能。建成1個(gè)云桌面實(shí)訓(xùn)實(shí)驗(yàn)室（含1個(gè)教師端，32個(gè)學(xué)生端），通過桌面云端漫游訪問實(shí)驗(yàn)內(nèi)容；可用可移動設(shè)備實(shí)現(xiàn)云桌面瘦客戶機(jī)的所有功能。校企合作共建云桌面，實(shí)現(xiàn)可移動性學(xué)習(xí)是可行的。

103.南方醫(yī)科大學(xué)“器官－系統(tǒng)為中心”的醫(yī)學(xué)整合課程體系的構(gòu)建 董為人 薛翔 黃文華 黃巧冰 王華峰 謝小燕 南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)管理中心 廣州510515 在廣泛調(diào)研的基礎(chǔ)上，南方醫(yī)科大學(xué)采用以器官系統(tǒng)為中心，將基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)課程進(jìn)行融通整合輔以問題導(dǎo)向?qū)W習(xí)的整合課程體系。共分為14個(gè)模塊，即醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)引論、神經(jīng)科學(xué)、感染與免疫、內(nèi)分泌系統(tǒng)與代謝、循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、血液系統(tǒng)與腫瘤、運(yùn)動系統(tǒng)與皮膚、生殖與發(fā)育、五官科學(xué)、人文與社會醫(yī)學(xué)和臨床技能。每個(gè)模塊一般按照系統(tǒng)發(fā)生、結(jié)構(gòu)、功能及其調(diào)節(jié)，系統(tǒng)疾病的病理基礎(chǔ)、系統(tǒng)疾病的藥理學(xué)基礎(chǔ)、系統(tǒng)疾病的輔助檢查、系統(tǒng)疾病的診療等排序。每個(gè)模塊穿插2－3個(gè)案例，使各學(xué)科內(nèi)容融會貫通，使學(xué)生早期接觸臨床，強(qiáng)化臨床思維，同時(shí)培養(yǎng)學(xué)生多方面的能力，尤其是自主學(xué)習(xí)、批判性思維、問題探究及解決、人文素養(yǎng)等。