P16、P53、Ki-67在食管上皮內(nèi)瘤變中的表達及診斷意義

張文書，王珍玲，肖 海，李偉松

（贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科，江西 贛州 341000）

食管上皮內(nèi)瘤變目前WHO 分為高級別上皮內(nèi)瘤變和低級別上皮內(nèi)瘤變；低級別上皮內(nèi)瘤變是指輕度異型增生的上皮細胞不超過全層的1/2。高級別上皮內(nèi)瘤變是指中重度異型增生的上皮細胞超過全層的1/2。在實際工作中，我們發(fā)現(xiàn)一部分低級別上皮內(nèi)瘤變病例主要表現(xiàn)為高級別核型的異型細胞位于基底層，它的預后不好應視為高級別上皮內(nèi)瘤變來干預處理。目前關于這部分病例還無統(tǒng)一的命名，我們暫時把它稱為食管基底層高級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變，也有學者建議把它稱為基底層鱗狀細胞原位癌。

食管基底層高級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變應作為一個獨特組織學亞型，是指高級核型的上皮細胞不超過全層的1/2，主要位于基底層，一般表現(xiàn)為低級別結(jié)構(gòu)異型性的高級別瘤變（低級別結(jié)構(gòu)異型性高級別細胞異型性細胞層次少，往往集中于下1/2，極性紊亂）。對于這種病變在臨床治療上應按高級別上皮內(nèi)瘤變處理，按現(xiàn)在WHO 的診斷標準只能放在低級別上皮內(nèi)瘤變中，這會導致延誤治療。所以對這種病變的正確認識和診斷非常重要，但這種病變目前由于病理醫(yī)生對其認識不足，病理診斷受病理醫(yī)師主觀影響，可重復性差，易導致臨床漏診或過度治療。為此尋找一組客觀的免疫組化檢查指標顯得非常重要，應用免疫組化標記，為規(guī)范化病理學診斷提供客觀依據(jù)［1-4］。李旭等［5］研究表明P16、Ki-67 在宮頸鱗狀上皮病變分級診斷中具有非常重要的意義。P16 蛋白有抑制細胞增殖、調(diào)節(jié)細胞周期的作用，在腫瘤組織中過表達［2，6］。Ki-67 是一種細胞增殖活性相關抗原，免疫組化染色陽性率高說明細胞增生活躍。P53是一種抑癌基因，賈振軍等［7］研究表明P53 在食管癌的癌旁組織中可檢測到表達，其檢測可發(fā)現(xiàn)早期癌及癌前病變。

1 材料與方法

1.1 材料收集2019 年本院食管黏膜活檢小標本，取確診為食管癌的癌旁組織，標本經(jīng)10% 中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋切片，4 μm 厚切片，HE 染色，顯微鏡下觀察閱片篩查出低級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變25 例和基底層高級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變16 例兩組標本，并全部進行P16、P53、Ki-67 免疫組化染色檢查。

1.2 免疫組化單克隆抗體P16、P53、Ki-67 購自羅氏公司，采用羅氏自動免疫組化染色機（Bench?Mark ULTRA）進行免疫組化染色，實驗步驟參照說明書進行。用已知陽性組織作為陽性對照，采用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判定低級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變表現(xiàn)為病變細胞集中在上皮的下1/3 層，病變細胞極性輕度紊亂，細胞核輕度異型（圖1）?；讓痈呒墑e鱗狀上皮內(nèi)瘤變表現(xiàn)為上皮的基底層和副基底層細胞極性紊亂，細胞核異型明顯（圖2）。P16陽性位于細胞核和細胞質(zhì)，染色模式為彌漫型，顯示相應病變的基底層和副基底層的細胞連續(xù)染色，P16 判讀為（+），鱗狀上皮無染色、孤立細胞或小細胞群的染色（斑駁狀染色）均判定為（-）。P53 陽性定位于細胞核，P53 陽性表達局限于上皮基底層為（-），超過基底層，占全層5%～25%為（+），26%～75%為（++），＞75%為（+++）。Ki-67 陽性定位于細胞核，Ki-67 陽性表達局限于上皮基底層為（-）；超過基底層，占全層10%～25%為（+），26%～75%為（++），＞75%為（+++）。（-）和（+）為陰性，（++）和（+++）為陽性［8-9］。

1.4 統(tǒng)計學分析應用SPSS 15.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用χ2檢驗對計數(shù)資料進行統(tǒng)計分析，相關性采用Spearman 等級相關分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 食管低級別上皮內(nèi)瘤變形態(tài)學觀察（HE染色，×200）

圖2 食管高級別上皮內(nèi)瘤變形態(tài)學觀察（HE染色，×200）

2 結(jié) 果

2.1 P16、P53和Ki-67在食管低級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變和基底層高級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變的陽性表達P16在兩組中的表達差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.288 281，P=0.591 324）；P53 的表達在基底層高級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變組明顯高于低級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變組，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=7.427 250，P=0.006 424）；Ki-67 的表達在基底層高級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變組明顯高于低級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變組，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.879 822，P=0.008 717）（圖3、表1）。

圖3 食管基底層高級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變免疫組化表達（羅氏自動免疫組化染色機染色，×200）

表1 P16、P53、Ki-67 在食管低級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變中的表達情況/n（%）

2.2 P53 與Ki-67 的關 聯(lián) 性P53 和Ki-67 在食 管低級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變和基底層高級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變的陽性表達呈正相關（r=0.6875，P＜0.05）。見表2。

表2 P53與Ki-67的關聯(lián)性/n

3 討 論

P16 是一種抑癌基因，導致細胞增殖失調(diào)，在腫瘤組織中過表達［2-4］，其陽性表達率在宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變中隨著級別的升高增強，呈垂直性分布。在本次研究中發(fā)現(xiàn)P16在食管低級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變與基底層高級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變中表達無差異，這可能跟它們各自主要的病因不同有關系，子宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變其主要的病因是人乳頭狀瘤病毒的感染。而食管鱗狀上皮內(nèi)瘤變主要跟患者的飲食習慣、長期的慢性炎癥刺激以及遺傳因素有關。

Ki-67是一種細胞增殖活性相關抗原，是惡性腫瘤預后的重要參考指標之一。Ki-67蛋白質(zhì)定位于細胞核內(nèi)，在增殖細胞的G1、S、G2和M期表達，G0期不表達［10］。本研究發(fā)現(xiàn)Ki-67 在食管低級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變與基底層高級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變中表達存在差異，在基底層高級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變Ki-67的表達高達75%，提示基底層高級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變的異型上皮增殖率較高，說明Ki-67蛋白的表達在食管基底層高級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變的診斷中有參考意義。

P53是一種重要的抑癌基因，主要是阻止G1/G0期，使細胞不能進入S 期，進而抑制細胞的增殖，與人類惡性腫瘤相關性很高。P53 異常出現(xiàn)在腫瘤的早期和癌前病變中，因此認為P53 是一種常見的遺傳事件。研究發(fā)現(xiàn)P53在食管癌的癌旁組織中也可檢測到表達，其檢測可發(fā)現(xiàn)早期癌及癌前病變［7］，陳麗霞等［11］研究發(fā)現(xiàn)P53蛋白在正常食管黏膜組織中未見陽性表達，在輕度不典型增生、中度不典型增生、重度不典型增生以及癌組織中表達率分別為13.3%、31.2%、62.6%、68.0%，在食管癌組織中的表達可達100%。本次研究顯示P53 在食管低級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變中表現(xiàn)為病變的鱗狀上皮細胞散在細胞核陽性，在基底層高級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變中表現(xiàn)為基底層和副基底層病變細胞核彌漫陽性。P53 在食管低級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變和基底層高級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變的陽性率分別為16%、62.5%，P53的表達明顯增加（P＜0.05），提示P53基因突變在食管的鱗狀上皮內(nèi)瘤變得不斷進展過程中可能起一定的作用。

綜上所述，食管鱗狀上皮內(nèi)瘤變的發(fā)生、發(fā)展是多因素參與的復雜過程，P16 的表達在診斷低級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變和基底層高級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變的區(qū)別上沒有明顯的差異，不具有診斷參考價值。P53和Ki-67 的表達在食管低級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變和基底層高級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變的區(qū)別上具有明顯的差異，結(jié)合兩者的檢測和組織細胞形態(tài)特點有助于降低基底層高級別鱗狀上皮內(nèi)瘤變的漏診率。