巖白菜素的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

蔣 坤，潘玉杰，夏 文，李 星，安斯揚(yáng)，孫曉軍，安 巧（貴州百靈企業(yè)集團(tuán)制藥股份有限公司，貴州安順561000）

巖陀為虎耳草科鬼燈檠屬植物西南鬼燈檠Rodgersiasambucifolia Hemsl.的根莖，性味為苦、澀、涼。原植物主產(chǎn)于云南、貴州、四川。其根莖具有收斂、消炎、祛風(fēng)除濕的功效，對(duì)老年性支氣管炎、菌痢、腸炎、感冒頭痛、外傷出血、風(fēng)濕骨痛等常見(jiàn)疾病有較好的療效［1］。其提取物的療效成分為巖白菜素（別名為巖白菜內(nèi)酯、矮茶素、巖白菜寧），具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、催眠及安定作用。巖白菜素為白色疏松的針狀結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，無(wú)臭，味苦，遇光或熱漸變色，在甲醇中溶解，在水或乙醇中微溶。其化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

巖白菜素收載于《中國(guó)藥典》2010年版（一部）［2］，含量測(cè)定方法為紫外分光光度法，但該方法專屬性不強(qiáng)。為使含量測(cè)定專屬性更好、更準(zhǔn)確，筆者采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定巖白菜素含量；同時(shí)，按照《中國(guó)藥典》規(guī)定進(jìn)行性狀觀察、鑒別、檢查等，為巖白菜素的臨床應(yīng)用和研究開(kāi)發(fā)相關(guān)制劑提供依據(jù)。

圖1 巖白菜素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig 1 Chemical structural formula of bergenin

1 儀器與試藥

Agilent Technologies 1200 series 高效液相色譜儀（G1315D DAD 檢測(cè)器）；梅特勒-托利多電子天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；KQ-250DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；電熱恒溫干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

巖白菜素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用，批號(hào)：111532-201302）；巖白菜素（由云南金泰德有限公司、云南康益有限公司、云南玉溪萬(wàn)芳有限公司提供，分別稱為樣1、樣2、樣3）；3批巖白菜素中試樣品（批號(hào)：20130601、20130602、20130603，分別稱為樣4、樣5、樣6），10批巖白菜素樣品（批號(hào)：20130304、20130201、20130202、20130604、20130701、20130102、20130101、20140304、20130303、20130301）均由貴州百靈企業(yè)集團(tuán)制藥股份有限公司生產(chǎn)；甲醇（美國(guó)TEDIA公司）；純凈水（娃哈哈集團(tuán)有限公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀

取巖白菜素對(duì)照品、樣1、樣2、樣3及3批中試樣品（樣4、樣5、樣6），觀察外觀、氣味、光和熱條件下的顏色變化，并進(jìn)行溶解度、比旋度測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 性狀考察結(jié)果Tab 1 Properties of bergenin

試驗(yàn)結(jié)果與《中國(guó)藥典》2010年版（一部）巖白菜素性狀項(xiàng)［2］下一致。

2.2 鑒別

根據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版（一部）巖白菜素鑒別項(xiàng)［2］方法對(duì)巖白菜素對(duì)照品及樣1、2、3、4、5、6 進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果與《中國(guó)藥典》2010年版（一部）巖白菜素鑒別項(xiàng)［2］下一致。

2.3 檢查

2.3.1 干燥失重檢查。取巖白菜素對(duì)照品、樣1、樣2、樣3及3批中試樣品（樣4、樣5、樣6），參照《中國(guó)藥典》2010 年版（一部）巖白菜素鑒別項(xiàng)［2］方法進(jìn)行干燥失重檢查。結(jié)果干燥失重檢查平均值為3.80%，減失重量低于6.0%，符合《中國(guó)藥典》2010年版（一部）巖白菜素干燥失重項(xiàng)［2］下規(guī)定。

2.3.2 熾灼殘?jiān)鼨z查。取巖白菜素樣品根據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版（一部）巖白菜素檢查項(xiàng)［2］方法進(jìn)行熾灼殘?jiān)鼨z查。結(jié)果熾灼殘?jiān)烤禐?.08%，低于0.1%，符合《中國(guó)藥典》2010年版（一部）巖白菜素?zé)胱茪堅(jiān)?xiàng)［2］下規(guī)定。

2.4 含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件［3-4］。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，色譜柱為C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）（北京迪科馬科技有限公司）；流動(dòng)相為甲醇-水（25∶75）；流速為1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm；進(jìn)樣體積為10 μl。理論板數(shù)按巖白菜素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。對(duì)照品及樣品色譜圖見(jiàn)圖2、圖3、圖4。

圖2 巖白菜素對(duì)照品高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of standard bergenin

圖3 巖白菜素（樣4）高效液相色譜圖Fig 3 HPLC chromatogram of bergenin（sample 4）

圖4 溶劑高效液相色譜圖Fig 4 HPLC chromatogram of the solvent

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備。取巖白菜素對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置于10 ml 量瓶，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻；精密量取此溶液1 ml，以甲醇稀釋至10 ml，過(guò)濾，即得0.1 mg/ml的對(duì)照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備。取巖白菜素（樣4）約10 mg，精密稱定，置于10 ml 量瓶，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻；精密量取此溶液1 ml，以甲醇稀釋至10 ml，過(guò)濾，即得供試品溶液。

2.4.4 線性范圍考察。精密稱取巖白菜素對(duì)照品10.39 mg，置于10 ml量瓶，制得質(zhì)量濃度為1.039 mg/ml的母液；精密吸取該母液1 ml 分別稀釋至25、15、10、7.5、5 ml，制得質(zhì)量濃度分別為0.041 56、0.069 26、0.103 90、0.138 50、0.207 80 mg/ml 的對(duì)照品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y＝8.191 7+6 300.3x（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，巖白菜素質(zhì)量濃度在0.041 56～0.207 80 mg/ml（進(jìn)樣量為0.416～2.078 μg）時(shí)，與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

2.4.5 精密度試驗(yàn)。精密稱取巖白菜素對(duì)照品5.46 mg，置于50 ml量瓶，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻；精密量取1 ml，以甲醇稀釋至10 ml，過(guò)濾。按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得其峰面積積分值RSD為0.72%，表明儀器精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取巖白菜素（樣4）10.70 mg，置于10 ml量瓶，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻；精密量取1 ml，用甲醇稀釋至10 ml，過(guò)濾，作為供試溶液。按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，于0、2、4、6、8、24 h 分別進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得其峰面積積分值的RSD為1.14%，表明巖白菜素供試溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.7 耐用性試驗(yàn)。取巖白菜素（樣4）10.75 mg，置于10 ml量瓶，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻；精密量取1 ml，用甲醇稀釋至10 ml，過(guò)濾，作為供試溶液。采用不同流速、不同比例、不同廠牌的色譜柱、不同柱溫，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 耐用性試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of serviceability test

由表2結(jié)果可知，在選用不同比例流動(dòng)相、流速、色譜柱廠家、柱溫后，峰面積RSD＝2.7%，表明本方法的耐用性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn)。精密稱取巖白菜素（樣4）約2.59 mg共9份，分別置于50 ml量瓶，再精密稱取相當(dāng)于樣品含量80%、100%、120%的巖白菜素對(duì)照品各3 份加入上述量瓶中，以甲醇溶解并定容至50 ml，得到低、中、高濃度的供試溶液各3份。按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Results of recovery test

由表3 可見(jiàn)，加樣回收率平均值為100.4%，RSD 為1.04%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.4.9 檢測(cè)限及定量限。精密稱取巖白菜素對(duì)照品5.14 mg，置于100 ml 量瓶，加甲醇溶解并定容；精密吸取1 ml 稀釋至25 ml，得質(zhì)量濃度為0.002 056 mg/ml 的對(duì)照品溶液，過(guò)濾，進(jìn)樣1 μl。進(jìn)一針空白溶劑觀察基線。經(jīng)計(jì)算，當(dāng)信噪比為3時(shí)，檢測(cè)限為0.284 ng；當(dāng)信噪比為10時(shí)，定量限為0.945 ng。

2.4.10 含量測(cè)定結(jié)果。采用筆者擬訂的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案中HPLC法與《中國(guó)藥典》2010年版（一部）巖白菜素項(xiàng)下的紫外-可見(jiàn)分光光度法，分別對(duì)10批樣品進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 兩種方法測(cè)定10批樣品的含量結(jié)果（%）Tab 4 Contents of 10 batches of samples determined by two methods（%）

由表4結(jié)果可見(jiàn)，按干燥品計(jì)算，采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定，巖白菜素（C14H16O9）含量為97.0%～103.0%；采用HPLC 法測(cè)定，可將巖白菜素標(biāo)示量定為98.0%～102.0%，故采用HPLC法更方便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定。

2.5 貯藏

與《中國(guó)藥典》2010年版（一部）巖白菜素貯藏項(xiàng)［2］一致。

2.6 用法與用量

與《中國(guó)藥典》2010年版（一部）巖白菜素用法與用量項(xiàng)［2］一致。

2.7 適應(yīng)證

與《中國(guó)藥典》2010年版（一部）巖白菜素適應(yīng)證項(xiàng)［2］一致。

3 討論

本文為巖白菜素質(zhì)量建立了專屬性、準(zhǔn)確性更強(qiáng)的含量測(cè)定方法，并進(jìn)行了方法學(xué)考察，采用原標(biāo)準(zhǔn)中的紫外-可見(jiàn)分光光度法與HPLC 法對(duì)10 批巖白菜素樣品進(jìn)行了含量測(cè)定，并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，HPLC 法更為簡(jiǎn)便、快速、可靠、準(zhǔn)確，提升了巖白菜素的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，增加了巖陀提取物質(zhì)量的可控性。

［1］ 史彥斌，胡振英，董鵬程，等.中草藥鬼燈檠的現(xiàn)代研究進(jìn)展［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2004，15（9）：621-622.

［2］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部［S］.2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：384.

［3］ 王燕，鮑家科，金楊，等.巖陀藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（10）：85-88.

［4］ 陳文文，黃勤挽，蘭雁，等.HPLC測(cè)定民族藥巖陀藥材中巖白菜素的含量［J］.華西藥學(xué)雜志，2007，22（2）：210-212.