高效液相色譜法測定金銀花中綠原酸和木犀草苷的含量

劉 琴 ，潘文琴(1．杭州市拱墅區(qū)康橋街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，杭州 3100;．浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，杭州310015)

金銀花化學(xué)成分復(fù)雜，現(xiàn)已鑒別出70 多種。對(duì)金銀花及其枝葉的有效成分綠原酸的含量測定方法較多，但對(duì)木犀草苷的測定報(bào)道較少。使用高效液相色譜(HPLC)法測定金銀花中綠原酸和木犀草苷的鮮有研究。本文探索并優(yōu)化HPLC法，選擇最佳的色譜條件，測定金銀花中綠原酸和木犀草苷這2 個(gè)有效成分的含量。

1 材料

1.1 儀器與試藥

島津LC-10ATvp 高效液相色譜儀;R224CN 電子天平;KQ3200 超聲波清洗器。

1.2 藥品與試劑

綠原酸對(duì)照品(批號(hào):12031401，成都曼思特生物科技有限公司生產(chǎn));木犀草苷對(duì)照品(批號(hào):10122401，成都曼思特生物科技有限公司生產(chǎn));金銀花藥材:為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾及初開的花(華東醫(yī)藥有限公司生產(chǎn))。甲醇(色譜純，TEDIA Company．INC 生產(chǎn));乙睛(色譜純，上海匯普工業(yè)化學(xué)品有限公司生產(chǎn));超純水、冰乙酸(分析純，杭州市北大橋化工區(qū)生產(chǎn));乙醇(色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司生產(chǎn));精密pH 試紙0．45 μm;微孔濾膜。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:依利特Hypersil ODS2(4．6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:0．5% 冰乙 酸-乙腈;線性梯度洗脫:0～20 min(90∶10～78 ∶22)，20～35min(78 ∶22～76 ∶24)，35～37min(76 ∶24～65 ∶35)，37～40 min(65 ∶35～90 ∶10);流 速:1．0 ml/min;檢測波長:綠原酸326 nm，木犀草苷350 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μl。

2.2 溶液的制備

2．2．1 供試品溶液的制備:(1)金銀花供試品溶液的制備:精密稱取金銀花粉末0．5 g，置于錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 ml，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率35 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾。(2)綠原酸供試品溶液的制備:精密移取上述濾液5～25 ml 置容量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻即得。(3)木犀草苷供試品溶液的制備:精密移取上述濾液1～10 ml 置容量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻即得。

2．2．2 對(duì)照品溶液的配制:(1)綠原酸對(duì)照品溶液的制備:精密稱定綠原酸對(duì)照品10．0 mg，用70% 甲醇溶解并轉(zhuǎn)移置100 ml容量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻。(2)木犀草苷對(duì)照品溶液的制備:精密稱定木犀草苷對(duì)照品10．0 mg，用70%甲醇溶液并轉(zhuǎn)移置50 ml 容量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻。精密移取上述溶液1～50 ml 容量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻。(3)流動(dòng)相溶液0．5%冰乙酸的配制:量取2．5 ml 冰乙酸，用重蒸水定容至500 ml，混合均勻，測定pH 值，用0．45 μm微孔濾膜過濾，并超聲脫氣20 min，備用。

2.3 色譜條件的選擇

2．3．1 綠原酸檢測波長的確定:進(jìn)綠原酸對(duì)照品溶液10 μl，掃描波長，結(jié)果顯示，在波峰達(dá)100 mAV 時(shí)，綠原酸的檢測波長范圍在300～340 nm，最佳檢測波長為326 nm。

2．3．2 木犀草苷檢測波長的確定:進(jìn)木犀草苷對(duì)照品溶液10 μl，掃描波長，結(jié)果顯示，在波峰達(dá)175 mAU 時(shí)，木犀草苷的檢測波長范圍在245～270 nm/330～360 nm，最佳檢測波長為350 nm。

2.4 流動(dòng)相的確定

2．4．1 流動(dòng)相配比:流動(dòng)相為:0．5%冰乙酸-乙腈(A-B)。實(shí)驗(yàn)以洗脫時(shí)間為因素，經(jīng)15 次無機(jī)相和有機(jī)相配比調(diào)整，得綠原酸和木犀草苷色譜圖。觀察兩者分離效果。結(jié)果表明:最佳的流動(dòng)相配比為:0～20 min(90∶10～78∶22)，20～35 min(78∶22～76∶24)，35～37 min(76∶24～65∶35)，37～40 min(65∶35～90∶10)，該流動(dòng)相分離效果好，峰形好，且峰高和峰面積較高。第13 個(gè)流動(dòng)相色譜圖見圖1，其他14 個(gè)配比流動(dòng)相比例的分離效果均不理想。

圖1 綠原酸和木犀草苷色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of Chlorogenic acid and Luteoloside

2．4．2 其他條件的確定:多次試驗(yàn)驗(yàn)證，柱溫為30 ℃、流速為1．0 ml/min 時(shí)，金銀花中綠原酸和木犀草苷的分離效果良好。

2.5 線性關(guān)系考察試驗(yàn)

分別精密移取綠原酸對(duì)照品溶液2、4、6、8、10 ml 置10 ml容量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻。各取10 μl 進(jìn)樣，得綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y= 26 347 606．481 5X- 76 704．900 0(R2=0．999 0)，線性區(qū)間為0．021 6～0．108 0 mg/ml。分別精密移取木犀草苷對(duì)照品溶液1、2、3、4、5 ml 置10 ml 容量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻。各取10 μl 進(jìn)樣，得木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=28 566 947．115 4X+22．150 0(R2=0．999 1)，線性區(qū)間為0．000 416～0．002 080 mg/ml。

2.6 儀器精密度考察試驗(yàn)

各取綠原酸和木犀草苷對(duì)照溶液10 μl，分別連續(xù)進(jìn)樣，綠原酸進(jìn)樣5 次、木犀草苷進(jìn)樣6 次。綠原酸對(duì)照品峰面積為1 545 705、1 595 679、1 591 407、1 591 079、1 599 343，RSD為1．39%;木犀草苷對(duì)照品峰面積為59 965、60 026、60 136、59 872、60 042、60 338，RSD為0．267%，結(jié)果表示精密度均良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

各取綠原酸和木犀草苷對(duì)照溶液樣品10 μl，分別連續(xù)進(jìn)樣6 次。綠原酸對(duì)照品峰面積為1 892 130、1 891 252、1 883 133、1 884 348、1 874 805、1 878 004，RSD為0．368%;木犀草苷峰面積為31 823、31 789、31 944、31 825、32 045、32 313，RSD為0．632%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.8 重現(xiàn)性試驗(yàn)

精密稱取同一批金銀花粉末6 份，每份0．5 g，按供試品方法分別制備供試品溶液6 份，分別進(jìn)樣10 μl。得綠原酸峰面積為1 585 941、1 600 474、1 649 284、1 628 870、1 505 830、1 513 773，RSD 為3．746%;得木犀草苷峰面積為33 561、33 732、35 696、35 559、35 526、35 908，RSD為3．018%。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取同一批金銀花粉末3 份，每份0．5 g，按供試品方法分別制備供試品溶液分別進(jìn)樣10 μl。結(jié)果表明，該方法具有良好的回收率，見表1。

表1 綠原酸和木犀草苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of recovery test on chlorogenic acid and luteoloside

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2．10．1 綠原酸穩(wěn)定性試驗(yàn):精密移取綠原酸對(duì)照品溶液2、10 ml，分別加70%的甲醇至10 ml，搖勻，綠原酸在0、6、12、24、48 h 進(jìn)樣。低濃度(0．019 8 mg/ml)的綠原酸在各時(shí)間段的峰面積為610 754．5、621 798、628 247、625 951、671 158;高濃度(0．099 0 mg/ml)的綠原酸在各時(shí)間段的峰面積為3 105 036、3 180 842、3 242 950、3 323 039、3 861 145。結(jié)果表明，綠原酸對(duì)照品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定，綠原酸峰面積的RSD分別為1．25%和2．88%;綠原酸在48 h 內(nèi)不穩(wěn)定。

2．10．2 木犀草苷穩(wěn)定性試驗(yàn):精密移取木犀草苷對(duì)照品溶液1、5 ml 加70%甲醇至10 ml，搖勻，在0、6、12、24、48 h、6 d進(jìn)樣。低濃度(0．000 416 mg/ml)的木犀草苷在各時(shí)間段的峰面積為11 905．5、12 114、12 105、11 967、12 696、13 964;高濃度(0．002 080 mg/ml)木犀草苷在各時(shí)間段的峰面積為59 918．5、60 392、61 026、60 547、68 433、70 342。結(jié)果表明，木犀草苷對(duì)照品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定，木犀草苷峰面積的RSD分別為2．62%和0．755%;木犀草苷在6 d 內(nèi)不穩(wěn)定。

2.11 樣品含量測定

不同提取方法的含量測定結(jié)果見表2。比較4 種提取樣品中綠原酸和木犀草苷含量的方法，考慮提取方法操作的方便性和經(jīng)濟(jì)性，本實(shí)驗(yàn)選擇提取方法為“70%甲醇50 ml，超聲處理30 min”。

3 討論

3.1 檢測波長的適應(yīng)性

對(duì)綠原酸與木犀草苷紫外掃描圖可知，綠原酸的檢測波長范圍在300～340 nm，最佳檢測波長為326 nm，與《中華人民共和國藥典》推薦的檢測波長327 nm 基本一致［1］;木犀草苷的檢測波長范圍在245～270 nm/330～360 nm，最佳檢測波長為350 nm。兩者共同吸收的波長范圍還是較寬，兩者重疊波長在300～340 nm，與黃海俠的結(jié)論基本一致，與《中華人民共和國藥典》推薦的檢測波長350 nm 和張?jiān)獙?shí)驗(yàn)結(jié)果有些出入［2-3］。同時(shí)測定綠原酸與木犀草苷時(shí)，可根據(jù)具體情況選擇最佳波長。

表2 不同提取方法樣品中綠原酸和木犀草苷的含量Tab 2 Contents of chlorogenic acid and luteoloside extracted by different extraction method

3.2 最佳色譜條件的選擇

綠原酸與木犀草苷極性相差大，且樣品中兩者含量差別也大，一般等度洗脫不能將兩者分離，須選擇最佳色譜條件，方可取得滿意的提取效果。經(jīng)考察，最終確定HPLC 法測定金銀花中2 種成分含量的最佳色譜條件即流動(dòng)相:0．5%冰乙酸-乙腈，線性梯度洗脫:0～20 min(90∶10～78∶22)，20～35 min(78∶22～76∶24)，35～37 min(76∶24～65∶35)，37～40 min(65∶35～90∶10);流速:1．0 ml/min;檢測波長:綠原酸326 nm，木犀草苷350 nm;柱溫:30 ℃;色譜柱:依利特Hypersil ODS2(4．6 mm×250 mm，5 μm);進(jìn)樣量:10 μl。在此色譜條件下2 種成分完全分離。

3.3 金銀花有效成分提取方法

比較了不同提取方法的提取率，最優(yōu)的提取方法為精密稱取金銀花粉末0．5 g，置于錐形瓶中，加入70%甲醇50 ml，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率35 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過［4］。測得的綠原酸和木犀草苷的含量分別為3．416%、0．124%。該方法提取時(shí)間短，方法簡、效果好。

［1］ 國家藥典委員會(huì)．中華人民共和國藥典： 一部［S］．2010 年版．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:595-596．

［2］ 王海俠，汪瑋鑫，時(shí)維靜，等．金銀花中綠原酸和木犀草苷的同時(shí)提取及測定研究［J］．安微科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，25(5):37-41．

［3］ 張?jiān)?，李進(jìn)，陳濤，等．高效液相色譜法同時(shí)測定金銀花中綠原酸和木犀草苷的含量［J］．天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，30(2):107-109．

［4］ 許哲，朱國慶．金銀花提取工藝研究［J］．黑龍江醫(yī)藥，2010，23(3):396-398．