結(jié)締組織鋪片脂肪組織油紅染色在組織學實驗教學中的應用

王俊梅 平蘇寧 汪 泓 黃錦桃 陳大堤 李朝紅

（中山大學中山醫(yī)學院組織胚胎學教研室，廣州510080）

疏松結(jié)締組織平鋪片制作與觀察是我們組織學與胚胎學實驗教學中學生們動手做的一個傳統(tǒng)實驗項目，過去常常使用甲苯胺蘭染色，可以把結(jié)締組織中的肥大細胞清晰顯示，其它多數(shù)細胞核以及纖維的分布和數(shù)量亦可進行大概的了解，但結(jié)締組織中的脂肪細胞卻只是呈現(xiàn)空泡狀，學生很難想象細胞內(nèi)脂滴的形態(tài)和分布。由于脂肪組織在基礎和臨床研究中占越來越重要的位置，讓學生們在短的時間內(nèi)同時掌握結(jié)締組織與脂肪組織的染色，并觀察不同來源地的結(jié)締組織中脂肪組織的分布，對于后續(xù)課程的學習以及科研思維培養(yǎng)具有重要意義。本研究對這一實驗方法進行初步探討，建立穩(wěn)定的實驗條件，使之具有制作快速、方法簡易、結(jié)果穩(wěn)定，可操作性強等特點，方便日后推廣。

材料和方法

1.材料

小鼠疏松結(jié)締組織，實驗用解剖撥針，眼科剪刀，眼科鑷子，載玻片，蓋玻片等。

2.儀器

帶數(shù)字攝影的光學顯微鏡。

3.試劑與配置

①油紅o染色液：油紅o 0.5g，50%乙醇100ml。將油紅o溶于乙醇內(nèi)，且不斷攪拌至完全溶解即可［1］。配制好的染液置磨口瓶內(nèi)保存?zhèn)溆?。?.3%甲苯胺藍液：甲苯胺藍0.3g，50%乙醇100 ml。③0.5%伊紅染色液：伊紅0.5g，50%乙醇100ml。

4.動物的處理和取材

健康成年小鼠1只，體重30～50g，斷頭處死，將腸系膜剪下，放置于干凈的載玻片上，用解剖撥針將腸系膜輕輕薄層展開，借助于組織液黏附于載玻片上，使腸系膜展平繃緊?？諝飧稍?min。

5.染色步驟

①切片干燥后入50%乙醇稍洗；油紅o乙醇染液作用8min［2］；②50%乙醇分化，自來水終止分化；③室溫下加入甲苯胺藍液到載玻片的結(jié)締組織上，浸染10min；蒸餾水速洗；④室溫下加入伊紅染色液到載玻片的結(jié)締組織上，染色30s，蒸餾水沖洗［3］；⑤甘油封片。

結(jié) 果

鏡下可見通過甲苯胺藍－伊紅－油紅o染色的疏松結(jié)締組織平鋪片呈現(xiàn)藍色和紅色染色（圖1B），細胞和纖維均可清晰呈現(xiàn)，而單獨用甲苯胺藍染色主要呈現(xiàn)藍色（圖1A）。

細胞：兩種染色方法均可清楚顯示肥大細胞（圖1A，1B）。肥大細胞成群分布，胞質(zhì)紫紅色，細胞漿內(nèi)紫紅色顆粒粗大而均勻分布，胞核淡染。除此之外，甲苯胺蘭－伊紅－油紅o三色染色（圖1B）還可以清楚顯示紅染的脂肪細胞（圖1B左下角）。脂肪細胞成群分布，胞內(nèi)含深度紅染的脂滴。脂肪細胞大小不一，細胞內(nèi)含脂滴大小也不一。比如，有些脂肪組織中央細胞胞漿內(nèi)含有較大脂滴，而周邊有些脂肪細胞脂滴含量很少，有些甚至胞漿中沒有脂滴，該結(jié)果提示脂肪細胞具有不同的細胞表型。結(jié)締組織細胞胞核清晰。

圖1 甲苯胺蘭－伊紅－油紅o三色染色結(jié)締組織平鋪片A圖示肥大細胞，B圖右上角紫紅色染色的是肥大細胞，左下角為脂肪組織。放大倍數(shù)：物鏡／目鏡＝10×／10×。C圖為A圖局部放大，示肥大細胞，D圖紫紅色染色的是肥大細胞，紅染為脂滴。放大倍數(shù)：物鏡／目鏡＝10X／40XFig.1 Oil red－toluidine blue－eosin triple staining of loose connective tissueFig.A shows the mast cells and the dark blue stained cells on the top of right side in Fig.B are mast cells，while the fat tissue lies on the bottom of the left side.10×10.Fig.C enlarge the mast cells in Fig.A and the fat droplets are red stained in Fig.D.10×40

討 論

此研究有三個特點：一是在傳統(tǒng)實驗的基礎上增加了新內(nèi)容；二是增加了學生親自動手做實驗的分量；三是把科學研究的一些新的實驗方法和新進展引入到本科實驗教學中。

疏松結(jié)締組織平鋪片及復合染色是組織學與胚胎學教學的傳統(tǒng)實驗方法，學生可以自制標本并染色，可在30分鐘內(nèi)完成此實驗，并獲得實驗結(jié)果。這是我們實驗室實驗教學中一直延續(xù)的做法。由于所用染料主要是甲苯胺蘭，鋪片中肥大細胞清晰可見。鋪片中的脂肪細胞卻呈空泡狀，脂肪細胞形態(tài)十分不明。油紅o為脂溶性染料，在脂肪內(nèi)能高度溶解，可特異性的使組織內(nèi)甘油三酯等中性脂肪著色，脂肪滴呈紅色，細胞核藍色［1］。并且在配置油紅o時進行技術改進，改用乙醇作為溶劑，可與甲苯胺蘭的溶劑相同，使得兩種染料趨于同性，可以很方便地獲得了理想結(jié)果。因此，學生們只是在原先親自動手做實驗的基礎上稍微增加了10分鐘的時間，就可獲得更多更美觀的實驗結(jié)果。更為重要的是，本方法的引入是由于參與教學的老師基于其課題研究所用的基本方法之一。李朝紅教授［4］長期以來從事心血管重構分子機制與防治研究的課題，涉及到動脈粥樣硬化等課題，其中有高血壓、高血糖、高脂血癥和肥胖等相關課題，油紅o染色是其學科組常用實驗研究方法之一。將其引入到本實驗中供學生親自動做，可行性強，無實驗風險。此外，脂肪組織的研究近年來已呈現(xiàn)活躍的趨勢，如脂肪干細胞、肥胖、高脂血癥脂質(zhì)代謝異常等均會涉及到此相關內(nèi)容［5］。學生們通過親自動手染色并觀察結(jié)果，既可掌握了一種重要的科研實驗方法為后續(xù)研究打下基礎，更是通過對脂肪組織的染色和觀察，在引導學生們學習正常的組織結(jié)構和功能的同時，增加學生們對臨床相關學科的科研興趣和現(xiàn)代最新知識的掌握，可謂是一舉多得。本實驗的預實驗工作是在課題組研究生的幫助下實施完成的，這樣既可提高研究生的帶教水平，同時使得我們師資隊伍得到了很好的補充，把教研室科研和教學工作連為一體，把年輕老師、研究生以及資深老教師科研工作緊密連接一體。使得人人熱心投入到教學改革工作中來，真正做到教學科研相輔相成，達到學生最終受益的目的。

組織學新增實驗必須考慮的一個重要事項就是所增加的實驗必須要求在短時內(nèi)能夠完成，保證在有限的實驗課時間內(nèi)完成實驗并獲得結(jié)果。我們把新增的實驗內(nèi)容始終是放在從屬位置，一定是要在保證完成最基本的實驗要求的條件下去實施。實驗是三個學時，至少兩個學時用做驗證性實驗切片的觀察，余下一個學時用于探索性實驗。這樣既可保證最基本的課程知識的掌握，又能在有限的時間內(nèi)拓展相關知識和技能。因此，實驗設計的好壞是決定能否最終成效顯著的關鍵，而這又完全有賴于老師對教學改革工作的熱愛、教學內(nèi)容的熟練和關注程度。

［1］唐海林，唐榮軍，宋穎等.一種改良的脂肪染色法.診斷病理學雜志，2006，13（2）：153－154

［2］周劍莉，胡檢生.脂肪染色法在臨床專業(yè)病理實驗教學中的應用.山東醫(yī)學高等?？茖W校學報，2011，33（1）：55－56

［3］劉同慎，李冰，殷彥君.疏松結(jié)締組織鋪片染色新法.濱州醫(yī)學院學報，2001，24（5）：519－520

［4］李朝紅.生物機械力對血管重構的影響及機制.中國動脈硬化雜志，2012，20（1）：1－5

［5］Padilla J，Jenkins NT，Vieira－Potter VJ，et al.Divergent phenotype of rat thoracic and abdominal perivascular adipose tissues.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2013 Apr 1，304（7）：R543－552