腦脊液中轉(zhuǎn)移性腺癌細胞免疫表型的變化

方長清 姜海嬌 李鄉(xiāng)南 李宏強 祝 迪 李建華

（1中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科暨中國醫(yī)科大學病理教研室； 2遼寧中醫(yī)藥大學教學實驗中心，沈陽110001）

腦轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤常見的并發(fā)癥之一，通常約有20%的非小細胞肺癌（NSCLC）患者，50%－80%的小細胞肺癌 （SCLC）患者，15%的乳腺癌患者，20%－50%的惡性黑色素瘤患者，4%的結(jié)直腸癌患者會發(fā)生腦轉(zhuǎn)移［1］。其中，肺癌是最常見的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移性腫瘤［2］?；颊叱Ｒ蝾^痛，惡心，嘔吐，視物模糊等中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為主訴而就診，而無明顯呼吸系統(tǒng)癥狀。通常，在CT引導下行肺部穿刺術(shù)可證實原發(fā)病灶。肺癌生長速度快，且肺組織血供相當豐富，癌細胞易經(jīng)肺靜脈進入體循環(huán)，隨頸動脈或椎基底動脈上行到腦組織后形成轉(zhuǎn)移灶。研究表明，肺癌具有噬神經(jīng)組織的特性，對中樞神經(jīng)組織特別具有親和力［3］。在一些原發(fā)肺癌患者中，顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤先于肺內(nèi)原發(fā)灶被發(fā)現(xiàn)，故稱為“腦先型”。有作者統(tǒng)計，腦轉(zhuǎn)移瘤先于肺癌確診的病例約占5%－10%［4］。因此，腦脊液中檢測癌細胞是臨床診斷腫瘤腦轉(zhuǎn)移的重要方法及可靠依據(jù)。

本文選擇了相對特異及敏感的血管內(nèi)皮標記物CD34，CD105，F(xiàn)Ⅷ，VEGF和淋巴管內(nèi)皮標記物D2＿40及b－FGF在惡性腦脊液中進行免疫細胞化學染色，探討這些因子在肺癌腦轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮的重要作用并證實腦脊液中腺癌細胞具有向脈管樣結(jié)構(gòu)分化生長的潛能，有助于探討轉(zhuǎn)移腫瘤細胞的生物學特性。

材料和方法

1.研究對象

收集中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院2012年1月至2013年6月門診及病房患者腦脊液標本109例，作為研究對象。其中，肺腺癌轉(zhuǎn)移細胞標本107例（包括49例肺癌術(shù)后5年內(nèi)腦轉(zhuǎn)移，58例無肺癌病史直接經(jīng)腦脊液穿刺發(fā)現(xiàn)肺癌腦轉(zhuǎn)移），乳腺癌轉(zhuǎn)移細胞標本2例。另外40例腦脊液（診斷為炎性）、40例肺腺癌組織標本作為對照。男性患者114例，女性患者75例；年齡17－83歲，平均年齡59歲；全部病例經(jīng)病理學診斷及臨床診斷。

2.試驗試劑及方法

兔抗人 CD34，CD105，F(xiàn)Ⅷ，D2＿40，b－FGF，VEGF及Vimentin抗體購自美國Biox公司。采用鏈霉菌抗生物素－過氧化物酶（streptavidin－peroxidase，SP）法，PBS緩沖液代替第一抗體作為空白對照，DAB顯色，蘇木素復染。常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片。

3.TCT涂片及石蠟切片的制備

采用液基細胞薄層方法（TCT）常規(guī)制片、診斷為腺癌細胞后，每份標本制備9張涂片，分別做CK7，TTF－1，CD34，CD105，F(xiàn)Ⅷ，D2＿40，b－FGF，VEGF及vimentin的免疫細胞化學染色。原發(fā)性腺癌術(shù)后標本40例，常規(guī)石蠟組織包埋，石蠟切片4μm，每份標本制備9張切片，分別做CK7，TTF－1，CD34，CD105，F(xiàn)Ⅷ，D2＿40，VEGF，b－FGF及vimentin的免疫組織化學染色。

4.結(jié)果的判定

以細胞出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，陽性程度判斷：細胞無著色或著色細胞數(shù)占總細胞數(shù)＜10%為（－）；陽性著色細胞數(shù)占總細胞數(shù)10%－25%為（＋）；26%－50%為（＋ ＋），≥51%為（＋ ＋ ＋）；陽性表達即＋ ～ ＋ ＋ ＋。每張切片選取10個高倍視野（＊400），對免疫化學染色結(jié)果進行評估。

5.統(tǒng)計學處理

應用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學處理，多組數(shù)據(jù)的陽性率比較采用卡方檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

使用免疫細胞化學方法對腦脊液TCT涂片進行CK7、TTF－1染色，陽性表達證實為肺腺癌細胞（圖1A、B、C）。在109例惡性腦脊液中，CD34，CD105，F(xiàn)Ⅷ的陽性率分別為64.2%，67.9%，66.9%（圖2 A、B、C）。作為淋巴管特異性內(nèi)皮標記物，D2－40也有表達，有51（46.8%）例結(jié)果為陽性（圖3 A），說明轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞也具有形成淋巴管的潛力。與前幾種抗體相比，b－FGF的陽性率較低，為56.8%（圖3 B）。在109例陽性腦脊液標本中，有70例標本發(fā)現(xiàn)VEGF胞漿陽性，陽性率為70.6%（圖3 C）。vimentin在腦脊液轉(zhuǎn)移腺癌細胞中陽性表達（圖3 D），表達率為88.1%。各標記物在炎性腦脊液對照組中均無陽性表達（圖3 E）。在原發(fā)肺癌標本中，VEGF，CD34，CD105和FⅧ表達較弱或不表達，D2－40在癌中不表達（圖4 C－G）。b－FGF與Vimentin在原發(fā)肺腺癌中的表達率分別為50.1%和29.3%。與對照組相比，各種標記物在腦脊液轉(zhuǎn)移癌中的陽性率明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 A－C：TCT涂片、CK7和TTF－1在腦脊液中腺癌細胞的免疫細胞化學染色陽性表達（×60）Fig.1 A－C：TCT、CK7 and TTF－1 positive expression of adenocarinoma cells in cerebrospinal fluid（×60）

圖2 A－C：CD34、CD105及FⅧ在腦脊液中腺癌細胞化學染色陽性表達（×60））Fig.2 A－C：CD34、CD105 and FⅧpositive expression of adenocarinoma cells in cerebrospinal fluid（×60）

圖3 A－D：D2－40、b－FGF、VEGF及Vimentin在腦脊液中腺癌細胞化學染色陽性表達（×60）E：炎性腦脊液中各因子陰性表達（×60）Fig.3 A－D：D2－40、b－FGF、VEGF and Vimentin positive expression of adenocarinoma cells in cerebrospinal fluid（×60）E：Each factors negative expression of infammatory cerebrospinal fluid（×10）

圖4 在肺穿刺的肺腺癌組織中的免疫組織化學染色，A－B：CK7和TTF－1的陽性表達（×40）；C－E：VEGF、CD34、CD105陰性表達（×40）；F：FⅧ弱陽性表達（×60）；G：D2－40陰性表達（×40）Fig.4 Immunohistochemistry of lung adenocarinoma of lung puncture.A－B：CK7 and TTF－1 positive expression（×40）；C－E：VEGF、CD34、CD105 negative expression（×40）F：FⅧ weakly positive expression（×60）；G：D2－40 negative expression（×40）

討 論

肺癌是腦轉(zhuǎn)移瘤中最常見的原發(fā)瘤，腦轉(zhuǎn)移通常發(fā)生在癌癥的晚期，肺癌腦轉(zhuǎn)移的血行轉(zhuǎn)移過程比較快捷，肺癌細胞可以直接進入動脈循環(huán)，隨血流進入腦部。循環(huán)中存活的肺癌細胞停滯在腦血管床，才有進入腦實質(zhì)存活的可能，而滯留不僅與肺癌細胞的大小有關(guān)，更多的原因是肺癌細胞表面分子“認識”腦血管床內(nèi)皮細胞［5］，這種所謂的“認識”可能是導致肺癌腦轉(zhuǎn)移易發(fā)生的原因之一。

在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中，血管的生成是一個不可缺少的環(huán)節(jié)，它不僅為腫瘤細胞提供血供，而且也是其轉(zhuǎn)移的重要途徑。上世紀70年代初Folkman首先提出了“腫瘤生長依賴血管的形成”的概念，自此，新生血管與腫瘤的關(guān)系引起了廣大學者的高度重視，越來越多研究者致力于腫瘤與新生血管關(guān)系的研究［6］。體積大于l～2mm腫瘤的生長需要新生血管提供氧分和營養(yǎng)，清除代謝產(chǎn)物，腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移需要血管的支持［7］。作者認為，在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的過程中，沒有血管或淋巴管等結(jié)構(gòu)提供營養(yǎng)支持其生存。因此，腫瘤細胞應自身具備形成脈管化的分子生物學功能和特性，不僅能促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移還能維持自我生長需要。在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移到目的部位后，才能逐漸分化成各種管腔結(jié)構(gòu)即腫瘤細胞的血管生成擬態(tài)，方便為其提供養(yǎng)分及進一步轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞具備不同屬性即腫瘤細胞具備異質(zhì)性，在生長和轉(zhuǎn)移等生物學行為過程中承擔不同角色。部分腫瘤細胞具備向血管或淋巴管等管腔內(nèi)皮分化以形成脈管結(jié)構(gòu)的能力，不但增加了與血管的親和力進而促進轉(zhuǎn)移而且具有為其他細胞的生長和轉(zhuǎn)移提供必要的養(yǎng)分和途徑，以達到在轉(zhuǎn)移灶繼續(xù)生長的目的。為了證實該假設，我們利用免疫細胞化學的方法評估了幾種特異性和敏感性較好的內(nèi)皮標記物CD34，CD105，F(xiàn)Ⅷ等在腦脊液轉(zhuǎn)移腺性癌細胞中的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮標記物CD34，CD105，F(xiàn)Ⅷ等在轉(zhuǎn)移性腺癌細胞中表達率均超過50%，其中FⅧ的表達最為明顯。而在原發(fā)腺癌組織中均無表達，說明轉(zhuǎn)移腺癌細胞具有向內(nèi)皮分化的傾向，具有內(nèi)皮細胞的分子生物學特性。

CD34、CD105等為 MVD的常用標記物。CD34因在大多數(shù)內(nèi)皮細胞上呈陽性表達而被定名為泛內(nèi)皮細胞標志物，與FⅧ一起用于檢測腫瘤新生血管微血管密度，與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［8］。CD105是一種同型二聚體細胞膜糖蛋白，分子質(zhì)量為180KD，是轉(zhuǎn)化生長因子TGF－β的配體，它可調(diào)節(jié)細胞對TGF－β的反應，促進血管生成，參與腫瘤分化、生長、轉(zhuǎn)移和復發(fā)［9］。其中，CD34對內(nèi)皮細胞更敏感，而CD105在新生毛細血管的內(nèi)皮細胞即增殖的內(nèi)皮細胞表達率更高，是目前衡量內(nèi)皮增殖狀態(tài)較準確的指標［10］。

D2－40是一種相對特異的淋巴管內(nèi)皮標記物，僅在淋巴內(nèi)皮細胞中表達，而在血管內(nèi)皮細胞內(nèi)呈陰性反應，是敏感性和特異性均較高的淋巴管內(nèi)皮特異性標記物。D2－40在淋巴管瘤中呈陽性表達，而在良性的血管腫瘤中呈陰性表達。雖然有報道D2－40在鱗狀上皮的基底細胞有陽性表達，但卻不表達于血管內(nèi)皮。所以具有高度特異性、敏感性的淋巴管標記物D2－40可以廣泛用于腫瘤新生淋巴管的研究。已有學者用其分析乳腺癌及黑色素瘤中的微淋巴密度，認為D2－40的敏感性和特異性是現(xiàn)有淋巴管內(nèi)皮標記物中最好的［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，D2－40在腦脊液中的轉(zhuǎn)移腺癌中陽性表達，說明轉(zhuǎn)移腺癌細胞能夠分泌新生淋巴管的相關(guān)蛋白，具有向腫瘤淋巴管分化的潛能。

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），早期亦稱作血管通透因子（vascular permeability factor，VPF），是血管內(nèi)皮細胞特異性的肝素結(jié)合生長因子（heparin－binding growth factor），可在體內(nèi)誘導血管新生（induce angiogenesis in vivo）。VEGF的陽性表達，有力地證明了腦脊液中腺癌細胞具備血管內(nèi)皮的分子生物學活性。有研究表明，VEGF家族的一些成員不僅可以促進血管生成同樣可以促進淋巴管的發(fā)生。這些新生成的血管和淋巴管比正常脈管更適宜于腫瘤的侵襲［12］。VEGF的表達可以增強肺癌細胞對腦的親和性，可使腫瘤細胞易于通過腦組織內(nèi)血管內(nèi)皮細胞層進而促成腦轉(zhuǎn)移［13］。

堿性成纖維細胞生長因子能夠誘導上皮、間質(zhì)及神經(jīng)源性細胞廣泛增殖和分化，且與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移關(guān)系密相關(guān)［14－17］。b－FGF 具有較強的促進血管內(nèi)皮細胞分裂、增加內(nèi)皮細胞的化學趨向性等作用。此外，vimentin陽性表達說明腫瘤細胞具備向間質(zhì)轉(zhuǎn)化的特征，發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的腫瘤細胞增強了侵襲、轉(zhuǎn)移的能力。

通過對99例腦脊液中腺癌細胞的研究發(fā)現(xiàn)，CD34、CD105等血管內(nèi)皮細胞標記物及淋巴管內(nèi)皮標記物D2－40和成纖維生長因子均有表達，且與炎性腦脊液中的炎性細胞相比其陽性率具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。這一結(jié)果從一定程度證明了作者的假設，研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)移的肺腺癌腫瘤細胞能夠表達不同的血管生長因子，從而具備內(nèi)皮細胞的特性，一方面有助于增強腫瘤細胞通過血道轉(zhuǎn)移的能力，具有形成脈管結(jié)構(gòu)的潛能，而并不需要建立血管的支持。另一方面彌補了血管供血不足的缺點，致使在缺氧的條件下仍然能夠生長，增強自我生存的能力。

近年來在腫瘤領(lǐng)域研究的重大進展之一就是確立了腫瘤血管生成在腫瘤發(fā)展中的重要地位與抗血管生成治療腫瘤的意義，腫瘤生成依賴血管形成，腫瘤的生長、局部浸潤及轉(zhuǎn)移必須以適宜的血液供應為前提。因此，腫瘤細胞的多種血管和淋巴管標記物的表達對于進一步研究腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的機制有著十分重要的意義。

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