恩諾沙星與其他抗菌藥對(duì)雞毒支原體的體外聯(lián)合抑菌試驗(yàn)

劉軼秋，張 媛，薛青紅，徐 磊，張瑞婷，蔣玉文

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

禽類支原體(Avian Mycoplasma)及其引起的疾病已引起國(guó)內(nèi)外的廣泛重視。從Nelson于1935年首先從患有感冒的雞中分離到支原體至今，已從家禽體內(nèi)分離鑒定出19種支原體。這些支原體中，大多數(shù)對(duì)動(dòng)物不致病，對(duì)家禽引起危害的主要有雞毒支原體(Mycoplasma Gallisepticum，MG)、滑液支原體、衣阿華支原體和火雞支原體。其中雞毒支原體是禽類最主要的病原菌之一，它可以引起雞、火雞及其它禽類的慢性呼吸道病(chromic respiratory disease，CRD)。該病最大特點(diǎn)是:發(fā)病率高，病程長(zhǎng)，康復(fù)慢。雞毒支原體病目前在我國(guó)的發(fā)生和流行呈上升趨勢(shì)，幾乎100%的雞場(chǎng)都有此病，雞群最高感染率可達(dá)83.4%，且經(jīng)常與其他病原菌混合感染，引起一些疫病的暴發(fā)和流行，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害很大。所以對(duì)該病的防治，除使用疫苗進(jìn)行預(yù)防外，藥物控制依然是治療該病的有效手段。通過(guò)試驗(yàn)摸索雞毒支原體的敏感藥物及如何聯(lián)合用藥對(duì)臨床治療雞毒支原體病具有一定的指導(dǎo)意義。臨床上治療CRD常用大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、林可胺類和氟喹諾酮類[1]等藥物。恩諾沙星是動(dòng)物專用的氟喹諾酮類藥物，屬于一類廣譜抗菌劑，由于其優(yōu)良的抗菌活性、良好的安全性而受到世界廣泛的關(guān)注[2]。恩諾沙星無(wú)論在試管中還是在雞體內(nèi)，對(duì)雞毒支原體都有強(qiáng)大的抑菌作用，是治療雞毒支原體病的理想藥物[3]。

試驗(yàn)選取恩諾沙星、替米考星、泰樂(lè)菌素、吉他霉素、林可霉素、沃尼妙林、泰妙菌素、氯霉素及氟苯尼考，對(duì)雞毒支原體BG44T株進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，確定藥物的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)，摸索其藥物敏感性并通過(guò)恩諾沙星與其他抗菌藥的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，找到與其協(xié)同或相加的抗菌藥，為防治雞毒支原體病提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藥品 恩諾沙星對(duì)照品，含量99.9%，批號(hào)H0081206;替米考星對(duì)照品，含量93.7%，批號(hào)K0311109;泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)品，每1 mg相當(dāng)于泰樂(lè)菌素1026單位，批號(hào)K0160911;吉他霉素標(biāo)準(zhǔn)品，每1 mg相當(dāng)于吉他霉素1611單位，批號(hào)K0151010;林可霉素對(duì)照品，含量84.9%，批號(hào)K0101003;延胡索酸泰妙菌素對(duì)照品，含量99.7%，批號(hào)K0340808;氯霉素對(duì)照品:含量為99.5%，批號(hào):K0350706;氟苯尼考對(duì)照品:含量為99.3% ，批號(hào):K0301004，均由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。沃尼妙林，含量98.5%，批號(hào)100102，由浙江海正藥業(yè)股份有限公司提供。分別稱取各藥并溶于適宜溶劑中，無(wú)菌操作配制成1280 μg/mL，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 支原體培養(yǎng) 基改良Frey氏液體培養(yǎng)基，參照現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)獸藥典》二〇一〇年版三部[4]上規(guī)定方法配制。

1.3 菌種及菌液制備 雞毒支原體BG44T(CVCC350)株，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。取菌種，通過(guò)復(fù)壯并培養(yǎng)，使顏色變化單位(color change unit，CCU)達(dá)到10-8CCU/mL以上，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 采用試管二倍稀釋法進(jìn)行測(cè)定[5]。每排取無(wú)菌帶膠塞試管10支，將改良Frey氏液體培養(yǎng)基分裝于各管中，每管0.5 mL，取適宜濃度藥液0.5 mL加入第1管充分混合后，取0.5 mL加入第2管，依此方法，進(jìn)行稀釋，至最后一管。取CCU達(dá)10-8CCU/mL的菌液，用改良Frey氏液體培養(yǎng)基稀釋成10-4，于各管中加入0.5 mL。同時(shí)試驗(yàn)設(shè)2種對(duì)照:培養(yǎng)物對(duì)照——接種菌液，不加抗菌藥;培養(yǎng)基對(duì)照——不接種菌液，不加抗菌藥。每次試驗(yàn)重復(fù)3次。所有試驗(yàn)管放置于37℃溫箱中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)物對(duì)照為橘黃色，對(duì)照培養(yǎng)基不發(fā)生顏色變化時(shí)，未發(fā)生顏色變化的最低藥物濃度為該藥物的MIC值。

1.5 體外聯(lián)合抑菌試驗(yàn) 參照戴自英[5]等的棋盤(pán)法進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)已測(cè)得的MIC值，以兩藥MIC值的4倍、2倍、1倍、1/2倍、1/4倍分別聯(lián)合。聯(lián)合藥敏的相互作用以FIC指數(shù)作為判定標(biāo)準(zhǔn)。

FIC=甲藥聯(lián)合時(shí)的MIC/甲藥單用時(shí)的MIC+乙藥聯(lián)合時(shí)的MIC/乙藥單用時(shí)的MIC。判定標(biāo)準(zhǔn):FIC≤0.5為協(xié)同作用;0.5＜FIC≤1為相加作用;1＜FIC≤2為無(wú)關(guān)作用;FIC＞2為拮抗作用。

2 結(jié)果

2.1 恩諾沙星、替米考星、泰樂(lè)菌素、吉他霉素、林可霉素、沃尼妙林、泰妙菌素、氯霉素、氟苯尼考對(duì)雞毒支原體BG44T株的MIC 試驗(yàn)測(cè)定的MIC結(jié)果表明，MG BG44T株對(duì)恩諾沙星、替米考星、泰樂(lè)菌素、吉他霉素、沃尼妙林、泰妙菌素均敏感(表1)。

2.2 恩諾沙星與其他抗菌藥合用對(duì)雞毒支原體BG44T株的聯(lián)合藥敏作用 恩諾沙星分別與替米考星、泰樂(lè)菌素、吉他霉素、林可霉素、沃尼妙林、泰妙菌素聯(lián)合，F(xiàn)IC指數(shù)在0.63～1之間，顯示這6組抗菌藥物聯(lián)用對(duì)MG表現(xiàn)為相加作用;恩諾沙星與氯霉素、氟苯尼考聯(lián)用對(duì)MG表現(xiàn)為拮抗作用(表2-表3)。

表1 9種抗菌藥對(duì)雞毒支原體BG44T株的MIC μg/mL

表2 恩諾沙星與其他抗菌藥合用對(duì)雞毒支原體BG44T株的聯(lián)合藥敏結(jié)果 μg/mL

表3 恩諾沙星與其他抗菌藥合用對(duì)雞毒支原體BG44T株的聯(lián)合藥敏作用

3 討論

3.1 MGBG44T株對(duì)抗菌藥的敏感性 國(guó)內(nèi)外關(guān)于用抗生素測(cè)定雞毒支原體MIC的報(bào)道比較有限。僅有曾振靈[6]用恩諾沙星測(cè)定MG BG44T株MIC(0.025 μg/mL)的報(bào)道，與本試驗(yàn)所測(cè) BG44T株MIC值(0.063 μg/mL)比較，兩值相差不大。曾振靈[6]用泰樂(lè)菌素測(cè)定 MG BG44T株 MIC值(0.00625 μg/mL)與本試驗(yàn)所測(cè)定的 MIC值(0.016 μg/mL);李宏勝[7]用替米考星測(cè)定 MGBG44T株MIC值(＜0.0156 μg/mL)與本試驗(yàn)所測(cè)MIC值(0.004 μg/mL)，由這兩組試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，雖然不同試驗(yàn)者所測(cè)的數(shù)據(jù)有一定差異，但依然可以說(shuō)明BG44T株對(duì)泰樂(lè)菌素、替米考星均敏感，適合臨床用藥。在實(shí)際臨床用藥報(bào)道中，應(yīng)用恩諾沙星[8]、泰樂(lè)菌素[9]、替米考星[10]治療雞毒支原體病均獲得較高治愈率，也直接驗(yàn)證了這些藥的療效。未見(jiàn)用吉他霉素、沃尼妙林、泰妙菌素、林可霉素、氯霉素、氟苯尼考測(cè)定MG BG44T株MIC的報(bào)道。但在對(duì)雞毒支原體其他菌株，如S6株、PG31株、F株和R株MIC測(cè)定的報(bào)道中，發(fā)現(xiàn)這些菌株均對(duì)恩諾沙星、泰樂(lè)菌素、泰妙菌素、林可霉素、替米考星、氟苯尼考敏感，而本試驗(yàn)中BG44T株只對(duì)恩諾沙星、泰樂(lè)菌素、泰妙菌素、替米考星敏感，說(shuō)明雞毒支原體不同菌株對(duì)某些抗生素的敏感性存在差異。

3.2 幾種抗菌藥聯(lián)合應(yīng)用對(duì)MGBG44T株的體外抑菌作用 王春華等[11]聯(lián)合恩諾沙星與替米考星治療雞毒支原體病，顯示效果顯著。有文獻(xiàn)報(bào)道氟喹諾酮類和林可霉素聯(lián)用可用于治療雞支原體合并大腸桿菌感染[12]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)MGBG44T株的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，從理論上驗(yàn)證了恩諾沙星+替米考星、恩諾沙星+林可霉素的聯(lián)合作用，說(shuō)明可用于治療雞毒支原體病。未見(jiàn)恩諾沙星與其他4種藥臨床應(yīng)用效果的報(bào)道，但從試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，因表現(xiàn)為相加作用，故為能更加有效的防治支原體與其他病原菌的混合感染，臨床上可考慮聯(lián)合應(yīng)用。恩諾沙星-氯霉素聯(lián)合、恩諾沙星-氟苯尼考聯(lián)合，F(xiàn)IC指數(shù)均為2.5，表現(xiàn)為拮抗作用，提示在臨床應(yīng)用上應(yīng)避免同時(shí)使用這兩種藥，以免失去藥效。有報(bào)道指出氟喹諾酮類抗菌藥物不能與氯霉素等合用，因合用后可導(dǎo)致效用降低，同時(shí)會(huì)影響肝腎功能及神經(jīng)系統(tǒng)[13]。劉瑞安[14]也指出喹諾酮類藥物與氯霉素類聯(lián)用可能會(huì)出現(xiàn)無(wú)關(guān)或拮抗作用，所以在臨床使用中應(yīng)避免此種方式聯(lián)合。但陳忠良[15]卻提出了另一種用藥方式可避免此種聯(lián)合的拮抗作用，他指出對(duì)于先使用過(guò)氯霉素的畜禽，需過(guò)48h后再用恩諾沙星，可避免減效。

3.3 應(yīng)用抗生素治療仍是防治雞毒支原體病的主要手段 雞毒支原體是引起雞呼吸道病的主要病原微生物，感染后可造成雞肉品質(zhì)下降，雞群產(chǎn)蛋量減少，經(jīng)濟(jì)損失明顯。因雞毒支原體常與多種細(xì)菌、病毒混合造成感染，且MG不同菌株對(duì)抗生素敏感性和抗藥性存在差異，為保證藥物療效，防止和減緩耐藥菌株的形成，臨床上多采用藥物聯(lián)合或交替使用的方式[16]。目前對(duì)雞毒支原體病的防治，雖然更多的是先進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)臨床用藥，但藥物聯(lián)合作用于機(jī)體后，對(duì)機(jī)體及生產(chǎn)性能產(chǎn)生何種影響，是否有不良反應(yīng)等，這些更需要研究人員密切關(guān)注，進(jìn)一步研究確證。

研究通過(guò)幾種抗菌藥物對(duì)MGBG44T株的體外抑菌試驗(yàn)，初步了解了恩諾沙星與某些藥物聯(lián)用的作用，為雞毒支原體病的防治提供了一些參考。但要真正了解雞毒支原體對(duì)哪些藥物敏感及如何聯(lián)合用藥，還需要進(jìn)行更深入的研究，以期對(duì)雞毒支原體病的防治更加科學(xué)、合理。

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