泰樂(lè)菌素組分穩(wěn)定性研究

王婷，王鴻發(fā)，劉萬(wàn)蓮，馬文軍

(寧夏泰益欣生物科技股份有限公司，寧夏 銀川 750205)

0 引言

泰樂(lè)菌素(Tylosin)，又稱泰樂(lè)星、泰樂(lè)霉素，是由弗氏鏈霉菌產(chǎn)生的十六元大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素。泰樂(lè)菌素是我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)防治支原體疾病的理想藥劑，也是一種優(yōu)良的飼料添加劑。泰樂(lè)菌素主要由4種成分組成[1-2]，分別為泰樂(lè)菌素A、脫碳霉糖泰樂(lè)菌素B、大菌素C和雷洛菌素D。4種生物活性組分的含量是衡量泰樂(lè)菌素發(fā)酵產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)《中國(guó)獸藥藥典》規(guī)定，泰樂(lè)菌素A含量必須達(dá)到80%，總組分含量必須超過(guò)95%才能合格。相關(guān)研究表明，發(fā)酵初期，菌體主要以產(chǎn)泰樂(lè)菌素A為主，后期菌體產(chǎn)物主要是大菌素C[3]。泰樂(lè)菌素的4種組分中，泰樂(lè)菌素A生物活性最強(qiáng)，因此在發(fā)酵后期，需要將大菌素C向泰樂(lè)菌素A定向轉(zhuǎn)化。在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，大菌素C的含量越高，轉(zhuǎn)化時(shí)間越長(zhǎng)，嚴(yán)重影響泰樂(lè)菌素的發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)。如何將泰樂(lè)菌素發(fā)酵液中的大菌素C高效轉(zhuǎn)化使泰樂(lè)菌素的A組分及總組分含量穩(wěn)定提高成為目前急需解決的技術(shù)難關(guān)。

1 儀器與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

豆油、菜籽油、玉米油、花生油、三甲銨乙內(nèi)酯、乙酸鈉、丙酸鈉、丙二酸鈉、檸檬酸鈉、氨基酸，均為工業(yè)級(jí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)中所用儀器如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)儀器

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

泰樂(lè)菌素菌種由寧夏泰益欣生物科技股份有限公司提供。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 碳源對(duì)泰樂(lè)菌素組分含量的影響

以豆油為對(duì)照，同比例玉米油、菜籽油、花生油為實(shí)驗(yàn)組，替代發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，采用HPLC法檢測(cè)泰樂(lè)菌素組分含量。

2.2.2 氮源對(duì)泰樂(lè)菌素組分含量的影響

以補(bǔ)加魚(yú)粉為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組直接補(bǔ)加氨基酸，其添加異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸比例為1.0∶1.5∶2.0，采用HPLC檢測(cè)泰樂(lè)菌素組分含量。

2.2.3 三甲銨乙內(nèi)酯添加時(shí)間對(duì)泰樂(lè)菌素組分含量的影響

從發(fā)酵初期開(kāi)始，設(shè)置時(shí)間梯度，每隔4 h在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加0.20%三甲銨乙內(nèi)酯，以0 h為對(duì)照，采用HPLC法檢測(cè)不同時(shí)間添加三甲胺乙內(nèi)酯的泰樂(lè)菌素組分含量。

2.2.4 前體物質(zhì)對(duì)泰樂(lè)菌素組分含量的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.20%前體物質(zhì)(乙酸鈉、丙酸鈉、丙二酸鈉、檸檬酸鈉)，以不添加任何前體物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)組為對(duì)照，采用HPLC法檢測(cè)泰樂(lè)菌素組分含量。

2.2.5 pH對(duì)泰樂(lè)菌素組分含量的影響

pH值采用pH酸度計(jì)測(cè)定，采用HPLC法檢測(cè)泰樂(lè)菌素組分含量。

2.3 HPLC檢測(cè)方法

色譜柱為ODS柱，流動(dòng)相為0.85 mol/L NaCl、40%乙腈溶液，pH值為2.5，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為290 nm。

2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 碳源對(duì)泰樂(lè)菌素組分含量的影響

碳源作為抗生素合成的重要原料之一，主要提供細(xì)菌生長(zhǎng)代謝所需的能量，組成菌體細(xì)胞并生成代謝產(chǎn)物[4]。工業(yè)生產(chǎn)中常以豆油作為泰樂(lè)菌素發(fā)酵的主要碳源，而優(yōu)質(zhì)豆油價(jià)格較高，在泰樂(lè)菌素發(fā)酵成本中占很大比例。為了結(jié)合生產(chǎn)需要、進(jìn)一步控制生產(chǎn)成本，需篩選質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的碳源。以豆油為對(duì)照，玉米油、菜籽油、花生油按同比例作為實(shí)驗(yàn)碳源，研究其對(duì)泰樂(lè)菌素組分含量的影響，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 不同碳源對(duì)泰樂(lè)菌素組分含量的影響

由表2可得，花生油作為泰樂(lè)菌素發(fā)酵碳源時(shí)效果最好，A組分、總組分含量高達(dá)90.05%、93.09%，分別較對(duì)照組高出0.96%、0.94%，C組分含量較對(duì)照組降低0.09%；其次為菜籽油，A組分和總組分含量較對(duì)照組提高0.49%和0.74%，C組分含量較對(duì)照組降低0.04%；玉米油最差，A組分和總組分含量均低于對(duì)照組，C組分含量升高。當(dāng)前原輔料市場(chǎng)中，花生油的售價(jià)遠(yuǎn)高于菜籽油，因此綜合考慮發(fā)酵組分和發(fā)酵成本，采用菜籽油作為泰樂(lè)菌素發(fā)酵所用碳源。

3.2 氮源對(duì)泰樂(lè)菌素組分含量的影響

魚(yú)粉是一種有機(jī)氮源，通常在泰樂(lè)菌素生產(chǎn)過(guò)程中用作培養(yǎng)基氮源，其含有多種游離氨基酸。纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸作為泰樂(lè)菌素合成的目的氨基酸，對(duì)其生物合成起促進(jìn)作用，其余氨基酸不直接參與泰樂(lè)菌素的合成，故對(duì)泰樂(lè)菌素的組分含量無(wú)明顯影響[5]。因此以補(bǔ)加魚(yú)粉為對(duì)照，按1.0∶1.5∶2.0比例補(bǔ)加異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸為實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。具體結(jié)果如表3所示，在培養(yǎng)基中直接補(bǔ)加氨基酸時(shí)，可顯著提升泰樂(lè)菌素A組分及總組分含量，其A組分及總組分含量分別較對(duì)照組高出1.80%、0.76%，C組分含量較對(duì)照組降低0.08%。

表3 不同氮源對(duì)泰樂(lè)菌素組分含量的影響

3.3 三甲銨乙內(nèi)酯對(duì)泰樂(lè)菌素組分含量的影響

三甲銨乙內(nèi)酯是泰樂(lè)菌素生產(chǎn)的重要原料，其含有3個(gè)活性甲基，是有效的甲基供體，為泰樂(lè)酯合成提供前體物質(zhì)，加快泰樂(lè)菌素生物合成。為了研究三甲銨乙內(nèi)酯添加時(shí)間對(duì)泰樂(lè)菌素組分含量的影響，以0 h補(bǔ)加甜菜堿鹽酸鹽的實(shí)驗(yàn)組為對(duì)照，設(shè)置6個(gè)周期梯度，進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4 三甲銨乙內(nèi)酯對(duì)泰樂(lè)菌素組分含量的影響

由表4可知，隨著發(fā)酵周期的延長(zhǎng)，泰樂(lè)菌素組分含量呈先增高后降低趨勢(shì)，在發(fā)酵開(kāi)始4 h補(bǔ)加三甲銨乙內(nèi)酯時(shí)，所得泰樂(lè)菌素C組分含量最低，A組分及總組分含量均達(dá)到最高，分別較對(duì)照組高出2.06%、0.89%，說(shuō)明添加三甲銨乙內(nèi)酯后，可有效提高組分之間的相互轉(zhuǎn)化，促進(jìn)泰樂(lè)菌素A組分的生成。

3.4 前體物質(zhì)對(duì)泰樂(lè)菌素組分含量的影響

在泰樂(lè)菌素生物合成的過(guò)程中，主要以內(nèi)酯環(huán)的合成為主，而內(nèi)酯環(huán)是由短鏈脂肪酸縮合而成[5]。在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.20%前體物質(zhì)(乙酸鈉、丙酸鈉、丙二酸鈉、檸檬酸鈉)，并以不添加任何前體物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)組為對(duì)照，考察不同短鏈脂肪酸對(duì)泰樂(lè)菌素組分含量的影響，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

表5 前體物質(zhì)對(duì)泰樂(lè)菌素組分含量的影響

由表5可知，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加4種前體物質(zhì)均提高了泰樂(lè)菌素A組分、總組分含量，其中添加丙二酸鈉對(duì)泰樂(lè)菌素組分含量影響最為顯著，A組分、總組分含量高達(dá)90.65%、93.78%，較對(duì)照組高出1.61%、1.41%，C組分含量相比對(duì)照組降低0.15%。

放線菌產(chǎn)素過(guò)程中，發(fā)酵前期產(chǎn)生的初級(jí)代謝產(chǎn)物用于維持菌體生長(zhǎng)和代謝，到發(fā)酵中后期才會(huì)大量合成并積累抗生素[6]。因此設(shè)置時(shí)間梯度進(jìn)一步分析前體物質(zhì)對(duì)泰樂(lè)菌素組分含量的影響。如表6所示，在發(fā)酵12 h添加丙二酸鈉時(shí)，泰樂(lè)菌素總組分含量高達(dá)92.94%，較對(duì)照組提高0.78%，A組分含量較對(duì)照組提高1.77%，C組分含量較對(duì)照組降低0.12%，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，添加丙二酸鈉后A組分和總組分含量呈降低趨勢(shì)，相應(yīng)的C組分含量升高。

表6 前體物質(zhì)添加時(shí)間對(duì)泰樂(lè)菌素組分含量的影響

3.5 pH值對(duì)泰樂(lè)菌素組分含量的影響

發(fā)酵液pH值會(huì)影響菌體的酶活性，進(jìn)而影響菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成[7]。如表7所示，泰樂(lè)菌素A組分含量隨發(fā)酵液pH值的升高呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，大菌素C含量變化趨勢(shì)相反，當(dāng)pH值為7.0時(shí)，泰樂(lè)菌素A組分、總組分含量最高，達(dá)到90.40%、92.79%，當(dāng)泰樂(lè)菌素發(fā)酵pH值控制在7.0～7.2范圍時(shí)，泰樂(lè)菌素A組分及總組分含量相對(duì)穩(wěn)定。

表7 pH 值對(duì)泰樂(lè)菌素組分含量的影響

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)泰樂(lè)菌素發(fā)酵培養(yǎng)基的主要碳源、氮源、前體物質(zhì)種類(lèi)及工藝條件等進(jìn)行優(yōu)化，探討發(fā)酵培養(yǎng)基成分對(duì)泰樂(lè)菌素組分含量的影響，結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵液pH值為7.0時(shí)，可明顯促進(jìn)大菌素C向泰樂(lè)菌素A轉(zhuǎn)化，泰樂(lè)菌素A含量明顯增高；花生油為碳源時(shí)，泰樂(lè)菌素A及總組分含量最高，大菌素C含量降低，其次為菜籽油，玉米油最差，因花生油的售價(jià)昂貴，因此選擇質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的菜籽油為泰樂(lè)菌素發(fā)酵所用碳源；異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸按1.0∶1.5∶2.0比例作為氮源補(bǔ)料時(shí)，泰樂(lè)菌素A組分及總組分含量較對(duì)照組明顯增高，大菌素C含量相應(yīng)降低，證明直接補(bǔ)加3種氨基酸可明顯促進(jìn)泰樂(lè)菌素的合成；在發(fā)酵開(kāi)始4 h向發(fā)酵液補(bǔ)加0.15%的三甲銨乙內(nèi)酯、12 h后添加0.20%的丙二酸鈉，泰樂(lè)菌素A組分、總組分均出現(xiàn)了不同程度的增高，大菌素C含量降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明發(fā)酵培養(yǎng)基中的基礎(chǔ)成分主要用于滿足菌體生長(zhǎng)，而前體物質(zhì)和代謝中間體的添加可促進(jìn)菌株的代謝向泰樂(lè)菌素合成的方向移動(dòng)，進(jìn)而促進(jìn)泰樂(lè)菌素A的生成，有效控制組分C的含量，使總組分含量達(dá)到穩(wěn)定。