泰樂(lè)菌素純化工藝優(yōu)化研究

＊陳東 張曉強(qiáng) 納奇 鎖嘉偉

（寧夏泰益欣生物科技有限公司 寧夏 750205）

泰樂(lè)菌素（Tylosin），亦稱泰農(nóng)、泰樂(lè)霉素，是美國(guó)于1959年從弗氏鏈霉菌（Streptomyces fradiae）的培養(yǎng)液中獲得的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。泰樂(lè)菌素的外觀呈現(xiàn)為一種白色板狀結(jié)晶，在水中的溶解性較低，呈現(xiàn)堿性。主要的產(chǎn)品有酒石酸泰樂(lè)菌素、磷酸泰樂(lè)菌素、鹽酸泰樂(lè)菌素、硫酸泰樂(lè)菌素及乳酸泰樂(lè)菌素，以上鹽在水中的溶解性良好。泰樂(lè)菌素水溶液在25℃、pH5.5～7.5時(shí)可保存3個(gè)月，但是當(dāng)水溶液中含有鐵離子、銅離子等金屬離子時(shí)，會(huì)使泰樂(lè)菌素水溶液失效。

泰樂(lè)菌素是禽畜專用的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其活性組分主要包括ABCD四種，以A組分為主，在動(dòng)物體內(nèi)的活性最強(qiáng)[1]。在2011版英國(guó)藥典（獸藥）中，規(guī)定泰樂(lè)菌素的總組分（A+B+C+D）含量在95%以上，且A組分含量在80%以上[2]。目前，已有報(bào)道顯示泰樂(lè)菌素對(duì)于禽畜類的多種病癥均具有較好的預(yù)防和治療效果。與此同時(shí)，其作為飼料添加劑已經(jīng)被國(guó)際所認(rèn)可，且在國(guó)內(nèi)甚至國(guó)際市場(chǎng)上的需求量都較大[3]。純度較高的泰樂(lè)菌素成品具有廣闊的市場(chǎng)前景，也能帶來(lái)較為良好的經(jīng)濟(jì)效益。隨之而來(lái)的問(wèn)題就是，如何獲得純度較高的泰樂(lè)菌素，這也成為了目前的研究方向和發(fā)展趨勢(shì)。

在生物制藥行業(yè)中，萃取的方法被廣泛應(yīng)用，此種方法可以有效去除泰樂(lè)菌素中大部分水溶性雜質(zhì)及無(wú)機(jī)鹽，將泰樂(lè)菌素的有效成分從水相轉(zhuǎn)移至有機(jī)相，除去水溶性雜質(zhì)，然后通過(guò)二級(jí)反萃取的方式將泰樂(lè)菌素分階段的從有機(jī)相轉(zhuǎn)移至水相，再經(jīng)過(guò)中和精制，得到高純度的泰樂(lè)菌素。達(dá)到降低雜質(zhì)含量，提升泰樂(lè)菌素純度的目的。

圖1 泰樂(lè)菌素結(jié)構(gòu)式

1.實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

(1)儀器

實(shí)驗(yàn)中所需數(shù)顯式恒溫磁力攪拌水浴鍋由天津華鑫儀器提供；低溫恒溫循環(huán)水浴槽由中儀科瑞（鄭州）設(shè)備有限公司提供；酸度計(jì)由梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司提供；高效液相色譜儀由安捷倫科技公司提供；分析天平由上海良平儀器儀表有限公司提供。

(2)試劑

實(shí)驗(yàn)中所需氫氧化鈉、酒石酸、乙酸丁酯全部由天津市承大化學(xué)試劑有限公司提供；氫氧化鈣、甲醇、乙腈全部由天津市大茂化學(xué)試劑有限公司提供。

2.實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法

(1)材料

泰樂(lè)菌素濾液來(lái)源于寧夏泰益欣生物科技股份有限公司。

(2)方法

①實(shí)驗(yàn)方法

取泰樂(lè)菌素濾液以及套用乙酸丁酯，分別設(shè)置濾液:乙酸丁酯=1:1.5；1:1；1:0.8；1:0.4四種比例進(jìn)行混合，置于數(shù)顯恒溫水浴鍋內(nèi)，分別設(shè)置30℃、35℃、40℃、45℃、50℃五個(gè)萃取溫度。設(shè)定萃取時(shí)間分別為20min、25min、30min、35min；分別設(shè)置萃取次數(shù)為一次萃取，兩次萃取，三次萃??；使用濃度為10%～15% NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，最終pH調(diào)節(jié)到9.0～9.4左右；然后再進(jìn)行反萃取，最后進(jìn)行中和精制工藝得到精制液、取樣、待檢。

②檢測(cè)方法

用高效液相色譜儀進(jìn)行含量檢測(cè)，檢測(cè)方法按照泰樂(lè)菌素組分檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（USP）進(jìn)行。

色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠作為填充劑；以200g/L高氯酸鈉溶液-乙腈（60:40）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為290nm；色譜柱型號(hào)為：4.6mm×25cm，粒徑5um；流速設(shè)定為1.0ml/min；柱箱溫度設(shè)定為35℃。

流動(dòng)相具體配制方法為：200g/L高氯酸鈉溶液與乙腈按照體積比為60:40進(jìn)行配制，混合均勻之后進(jìn)行過(guò)濾，用超聲波清洗器除去流動(dòng)相中的氣泡，即得。

供試品溶液配制方法為：準(zhǔn)確稱取供試品20mg，置100ml容量瓶中，加入乙腈-水（1:1）進(jìn)行溶解并稀釋，準(zhǔn)確定容至刻度線，搖勻，即得。

對(duì)照品溶液配制方法為：稱取泰樂(lè)菌素對(duì)照品（USP）20mg，精密稱定，置100ml容量瓶中，加乙腈-水（1:1）進(jìn)行溶解并稀釋，準(zhǔn)確定容至刻度線，搖勻，即得。

3.結(jié)果與分析

(1)濾液與乙酸丁酯的加量對(duì)泰樂(lè)菌素A組分含量的影響

在萃取這一工序中，萃取劑的用量對(duì)萃取的效果會(huì)產(chǎn)生極大地作用。萃取劑使用過(guò)量可能會(huì)加大試劑的浪費(fèi)，導(dǎo)致生產(chǎn)成本過(guò)高；而萃取劑使用量減少會(huì)導(dǎo)致萃取不徹底，從而造成泰樂(lè)菌素的損失。因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)置四種投料比例進(jìn)行驗(yàn)證，分別為1:0.4，1:0.8；1:1；1:1.5；其余條件固定不變，考察對(duì)泰樂(lè)菌素A組分含量的影響。具體結(jié)果由表1所示。

表1 加量比例對(duì)泰樂(lè)菌素A組分含量的影響

由表1和圖2可知，隨著投料比例的改變，泰樂(lè)菌素A組分含量為一個(gè)先增加后降低的改變趨勢(shì)，當(dāng)加量比例設(shè)置為1:0.8時(shí)，得到的泰樂(lè)菌素A組分含量為最高。

圖2 加量比例對(duì)泰樂(lè)菌素A組分含量的影響

(2)萃取溫度對(duì)泰樂(lè)菌素A組分含量的影響

一般來(lái)說(shuō)，隨著溫度的升高，溶質(zhì)在水相及萃取劑中的溶解度都會(huì)有所提高，而且在萃取劑中的溶解度比在溶質(zhì)中的溶解度大，所以利于萃取的進(jìn)行。除此之外，溫度升高，溶液的黏度降低，也便于萃取劑與水的分離。但是當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致萃取劑的損失增多。因此設(shè)置不同萃取溫度進(jìn)行驗(yàn)證，分別為30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，保持其余條件不變，考察對(duì)泰樂(lè)菌素A組分含量的影響。具體結(jié)果由表2所示。

表2 萃取溫度對(duì)泰樂(lè)菌素A組分含量的影響

由表2和圖3可知，隨著萃取溫度的逐漸增加時(shí)，泰樂(lè)菌素A組分含量變化為先增加后降低，當(dāng)萃取溫度為45℃時(shí)，泰樂(lè)菌素A組分的含量達(dá)到最佳。此后再升高溫度時(shí)泰樂(lè)菌素A組分含量開(kāi)始降低，綜合來(lái)看，當(dāng)萃取溫度為45℃時(shí)，泰樂(lè)菌素A組分含量最佳。

圖3 萃取溫度對(duì)泰樂(lè)菌素A組分含量的影響

(3)萃取次數(shù)對(duì)泰樂(lè)菌素A組分含量的影響

萃取是提純的手段之一，而萃取次數(shù)也至關(guān)重要。單次萃取效率遠(yuǎn)低于多次萃取，而隨著萃取次數(shù)的增加，濾液中泰樂(lè)菌素的有效成分會(huì)逐漸降低，此時(shí)繼續(xù)增加萃取次數(shù)，泰樂(lè)菌素A含量降低，還會(huì)造成萃取劑的浪費(fèi)，導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加。因此設(shè)置不同萃取次數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，分別為一次萃取、兩次萃取、三次萃取，保持其余條件不變，考察對(duì)泰樂(lè)菌素A組分含量的影響。具體結(jié)果由表3所示。

表3 萃取次數(shù)對(duì)泰樂(lè)菌素A組分含量的影響

由表3和圖4可知，當(dāng)萃取次數(shù)的逐漸增加時(shí)，泰樂(lè)菌素A組分含量逐漸降低，萃取次數(shù)越多，泰樂(lè)菌素A組分含量越低，但一次萃取顯然無(wú)法將絕大多數(shù)有效成分萃取出來(lái)，綜合生產(chǎn)成本與萃取效率，當(dāng)萃取次數(shù)為兩次時(shí)，既能盡可能多的將泰樂(lè)菌素A組分萃取完全，又能節(jié)約成本，因此確定萃取次數(shù)為兩次。

圖4 萃取次數(shù)對(duì)泰樂(lè)菌素A組分含量的影響

(4)萃取時(shí)間對(duì)泰樂(lè)菌素A組分含量的影響

在進(jìn)行萃取工序時(shí)，萃取時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)萃取效率的影響也極為重要。萃取時(shí)間過(guò)短，會(huì)導(dǎo)致泰樂(lè)菌素有效成分萃取不完全，從而導(dǎo)致泰樂(lè)菌素A組分降低；而當(dāng)萃取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，不僅對(duì)萃取效率起不到明顯的促進(jìn)作用，反而會(huì)造成預(yù)料之外的浪費(fèi)。因此設(shè)置20min、25min、30min、35min、40min等不同萃取時(shí)間，保持其它條件不改變，考察對(duì)泰樂(lè)菌素A組分含量的影響。具體結(jié)果由表4所示。

表4 萃取時(shí)間對(duì)泰樂(lè)菌素A組分含量的影響

由表4可知，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，泰樂(lè)菌素A組分含量增加，當(dāng)萃取時(shí)間在25～30min這一范圍內(nèi)時(shí)，泰樂(lè)菌素A組分含量基本保持不變且為最佳，而后萃取時(shí)間繼續(xù)增加，泰樂(lè)菌素A組分含量變化不大，綜合生產(chǎn)時(shí)間來(lái)看，當(dāng)萃取時(shí)間為25～30min時(shí)，所得泰樂(lè)菌素A組分含量是最高的。

(5)最優(yōu)條件下的平行實(shí)驗(yàn)

通過(guò)單因素試驗(yàn)，獲得最優(yōu)參數(shù)，組合成為最優(yōu)的泰樂(lè)菌素萃取工藝條件，具體參數(shù)如下：泰樂(lè)菌素濾液加量:乙酸丁酯加量=1:0.8、萃取溫度為45℃、進(jìn)行兩次萃取、萃取時(shí)間控制為25～30min。以此組合工藝條件進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證此工藝條件的穩(wěn)定性，結(jié)果如表5所示。

表5 平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證數(shù)據(jù)

由表5可知，三組實(shí)驗(yàn)中所得到的泰樂(lè)菌素A組分平均含量為89.6%。

4.結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)泰樂(lè)菌素濾液與乙酸丁酯投料比例、萃取溫度、萃取次數(shù)、萃取時(shí)間等工藝參數(shù)分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：當(dāng)投料比例為1:0.8、萃取溫度為45℃、萃取次數(shù)為兩次萃取、萃取時(shí)間控制為25～30min時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果最優(yōu)，并驗(yàn)證最優(yōu)參數(shù)組合工藝對(duì)泰樂(lè)菌素的萃取具有顯著的影響，為泰樂(lè)菌素的A組分含量的提升提供了有力的支撐，依據(jù)此工藝可繼續(xù)進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。