牛傳染性鼻氣管炎病毒的分離鑒定與滅活疫苗免疫效果研究

趙 卓，胡義彬，潘延缽，賀亞奇，鄧玉芹，王 力，2(.北京生泰爾生物科技有限公司，北京昌平02206;2.北京華夏興洋生物科技有限公司，北京大興02629)

牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)是引起牛的一種急性熱性接觸性傳染病，以高熱、呼吸困難、鼻炎和上呼吸道炎癥為特征。該病在世界各地普遍存在，主要的經(jīng)濟損失在于延緩肥育牛的生長和增重，患病奶牛產(chǎn)乳量下降，繼發(fā)流產(chǎn)，其流產(chǎn)率有時高達50%，急性發(fā)病期牛死亡率可達10%[1]。文獻報道我國大部分地區(qū)也存在該病的流行，并由疑似病例中成功分離到了IBR病毒[2-4]，但很多牛場仍缺乏對牛傳染性鼻氣管炎病的足夠認識?？刂票静〉闹饕胧┰谟趹靡呙邕M行免疫預防接種。但在我國，目前尚無IBR疫苗產(chǎn)品上市。本研究成功分離到了一株免疫原性良好的牛傳染性鼻氣管炎病毒，并采用該毒株進行了滅活疫苗的初步研究。

1 試驗材料

1.1 病料 疑似發(fā)病牛眼鼻分泌物及生殖道分泌物。

1.2 細胞、抗原及血清 MDBK細胞、IBRV中和試驗抗原、IBR陽性血清均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心。

1.3 試驗動物 1～3月齡IBR中和抗體≤1∶2的健康犢牛25頭，購自北京市北郊奶牛場。體重為

1.5 ～2 kg日本大耳白家兔20只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.4 試劑 DMEM培養(yǎng)基，GBICO公司;胎牛血清，蘭州民海生物工程有限公司;Taq聚合酶，寶生物工程(大連)有限公司;PCR引物，由上海生物工程技術(shù)有限公司合成;疫苗佐劑(603佐劑)，由北京生泰爾生物科技有限公司提供。

1.5 儀器設備 PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀、96孔細胞培養(yǎng)板、CO2細胞培養(yǎng)箱、倒置生物顯微鏡，由北京生泰爾生物科技有限公司提供。

2 試驗方法

2.1 病料采集與處理 選取表現(xiàn)典型IBR臨床癥狀的5頭牛，分別采集鼻腔拭子和生殖道分泌物拭子，放入運輸培養(yǎng)液中(含1000單位/mL青霉素、1000 μg/mL鏈霉素和20%血清的DMEM)，4℃作用過夜。凍融2次后，10000 r/min離心10 min，取上清液用0.22 μm微孔慮膜進行慮過除菌，-20℃保存。

2.2 病毒分離 取上清液1 mL接種于長滿MDBK細胞單層的細胞培養(yǎng)瓶中，37℃吸附1 h，傾去液體，加入維持液(含青霉素200單位/mL、鏈霉素200 μg/mL和2%血清的DMEM)，于37℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細胞病變(CPE)，待70% ～80%細胞出現(xiàn)CPE時收毒，如果細胞不出現(xiàn)CPE，5 d后盲傳，連續(xù)盲傳3代。

2.3 病毒蝕斑克隆純化 將病毒培養(yǎng)液做10倍系列稀釋到10-6，接種長成良好的MDBK細胞單層的6孔細胞培養(yǎng)板;每孔接種病毒稀釋液200 μL，每個稀釋度病毒液接種2孔，置細胞培養(yǎng)箱中吸附1 h，每20 min搖動一次使病毒分布均勻;吸附后棄去6孔板內(nèi)病毒液;然后取細胞培養(yǎng)液加入等量的1%瓊脂(60℃水浴加熱)中，混勻，冷卻到40℃時加入細胞培養(yǎng)板中，每孔加入2～3 mL，凝固后置37℃含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng);待適當稀釋度出現(xiàn)單個蝕斑后，吸取噬斑處瓊脂加入營養(yǎng)液中使其溶解后作為收獲病毒，收獲后的病毒液接種單層MDBK細胞繼續(xù)培養(yǎng)增殖。

2.4 病毒TCID50的測定 待96孔細胞培養(yǎng)板中的MDBK細胞長滿單層后，將病毒做10倍系列稀釋后，每一稀釋度接種8孔，0.1 mL/孔，37℃吸附1小時，補加細胞維持液，0.1 mL/孔。培養(yǎng)板置37℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察7 d后，采用Reed-Muench法，計算IBR病毒TCID50。

2.5 血清中和試驗 將IBRV陽性血清于56℃滅活30 min后，作連續(xù)2倍倍比稀釋后，加入等體積的IBR病毒(200 TCID50/0.1mL)，37℃中和1 h。然后將血清-病毒中和液加入長滿單層MDBK細胞的96孔板中，每個血清稀釋度接種4孔，每孔0.2 mL。于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察細胞病變。

2.6 PCR檢測

2.6.1 引物設計與合成 根據(jù)Genbank中公布的IBRV全基因序列，選取gB蛋白全基因組序列，利用Primer Premier 5軟件設計如下引物序列進行目的基因片段的擴增:

gb-F:5’-CGAGGAAGAGGAGGAGTTTGACG-3’

gb-R:5’-GCACCCGAACTGCCCATACATAG-3’

2.6.2 病毒DNA的提取 將病毒培養(yǎng)物凍融2～3 次后，取560 μL 加入30 μL 100 g/L SDS和3 μL 20 g/L蛋白酶K，37℃水浴60 min，先后以酚/氯仿和氯仿各抽提1次，0.8倍體積異丙醇沉淀，700 mL/L乙醇洗滌，干燥后加適量無核酸酶水溶解。

2.6.3 PCR擴增 50 μL反應體系中加入10×Ex Taq buffer 5 μL、dNTP(各 2.5 mmol/L)4 μL、MgCl2(25 mmol/L)4 μL、引物(20 μmol/L)各0.5 μL、Ex TaqTM 酶 0.25 μL、病毒 DNA 2 μL、ddH2O至50 μL。瞬間離心后進行PCR擴增。同時設MDBK細胞DNA和無DNA的空白對照。擴增條件為:95℃預變性5 min，95℃ 1 min，65℃45 s，72 ℃ 45 s，10 個循環(huán);95 ℃ 1 min，54 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，15個循環(huán);95 ℃ 1 min，60 ℃ 45 s，72 ℃45 s，10個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果。

2.6.4 目的片段測序 將PCR擴增產(chǎn)物回收后進行序列測定，根據(jù)測序結(jié)果做進一步驗證。

2.7 動物回歸試驗 選用IBR抗體陰性牛5頭，其中3頭采用滴鼻和噴霧的方式共接種IBRV液10 mL(含107.3TCID50)，每天測定體溫，觀察臨床癥狀。另2頭作為空白對照組，試驗組與對照組隔離飼養(yǎng)。試驗牛出現(xiàn)典型的臨床癥狀時，采集眼鼻或陰道分泌物進行病毒分離和PCR檢測，發(fā)病后3～5 d撲殺作病理解剖學觀察。

2.8 疫苗的制備 將IBRV進行增殖培養(yǎng)后，進行病毒含量測定和無菌檢驗，檢驗合格后進行病毒滅活。然后將病毒滅活液與603佐劑按照2∶1的比例混合、攪拌均勻。

2.9 疫苗的檢驗

2.9.1 常規(guī)檢驗 按照現(xiàn)行《中國獸藥典》的方法分別進行無菌檢驗、穩(wěn)定性檢驗、黏度檢驗、甲醛殘留檢驗[5]。

2.9.2 小白鼠安全性檢驗 每批疫苗經(jīng)背部皮下接種IBR滅活疫苗0.3 mL，每組10只，觀察14 d，記錄小白鼠的死亡情況及全身和局部的不良反應。

2.9.3 效力檢驗 每批IBR滅活疫苗免疫接種5頭牛，每頭牛肌肉注射2 mL，21 d加強免疫一次。同時每批疫苗免疫接種家兔5只，每只肌肉注射0.5 mL，21 d以同樣劑量加強免疫一次。二免后14 d采血，分離血清，進行血清中和抗體測定。

2.9.4 攻毒保護試驗 IBR滅活疫苗二免后14 d進行采血后，隨即連同對照牛進行攻毒，每頭牛采用滴鼻的方法接種F4代牛傳染性鼻氣管炎病毒10 mL(含107.3TCID50)，攻毒后每天觀察臨床癥狀和體溫變化，觀察15 d。根據(jù)牛的發(fā)病情況計算免疫牛的攻毒保護率。

3 結(jié)果

3.1 病毒分離和TCID50測定 采集疑似發(fā)病牛鼻腔拭子和生殖道分泌物拭子樣品接種MDBK細胞后，其中1份樣品在第1代的第3天出現(xiàn)死亡細胞明顯增多的現(xiàn)象，而對照細胞生長良好(圖1);傳至第2代，在第2天觀察到特異性CPE，表現(xiàn)為細胞圓縮，聚集，在單層細胞上形成空洞，之后細胞脫落(圖2)，第3天70% ～80%細胞出現(xiàn)CPE，細胞圓縮、死亡、脫落。病毒培養(yǎng)物經(jīng)蝕斑純化后連續(xù)傳3代，CPE出現(xiàn)的時間和病變特征與前幾代相似。收獲蝕斑純化后的第3代病毒培養(yǎng)物，凍融1次，分裝，經(jīng)TCID50測定，病毒毒價為107.7TCID50/mL。

3.2 病毒蝕斑克隆純化 將第2代病毒培養(yǎng)物進行病毒蝕斑純化，結(jié)果在第4天即可看到典型的病毒蝕斑(圖3)，吸取蝕斑處瓊脂收獲病毒，收獲后的病毒液接種單層 MDBK細胞繼續(xù)培養(yǎng)增殖，在MDBK單層細胞上仍可出現(xiàn)典型的細胞病變效應。

3.3 血清中和試驗 陽性血清做1∶16倍稀釋后可以與IBR病毒培養(yǎng)物完全中和，MDBK細胞對照無細胞病變產(chǎn)生。而32倍稀釋的血清與病毒中和后有1/4孔細胞出現(xiàn)細胞病變，細胞呈現(xiàn)園縮聚集成團，細胞間出現(xiàn)空洞，最后圓縮脫落。

3.4 PCR擴增 圖4結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)物和IBRV標準株均能擴增出與目的基因片段大小一致的特異性條帶。

圖4 IBRV特異性片斷基因擴增結(jié)果

3.5 擴增產(chǎn)物測序 將PCR擴增產(chǎn)物回收后送上海生物工程技術(shù)有限公司進行測序。測序結(jié)果采用序列分析軟件分析，并將測序序列與GenBank中的牛IBR病毒基因序列進行Blast比對，基因序列同源性達99%。

3.6 動物回歸試驗 3頭犢牛在攻毒后24 h出現(xiàn)發(fā)熱，溫度達到40.9℃;攻毒后3 d，3頭牛均出現(xiàn)鼻鏡潮紅，流淚，精神萎靡，食欲減退的癥狀;觀察至第5天，牛的鼻腔及眼角有多量的濃性分泌物，出現(xiàn)咳嗽、拒食、發(fā)熱等典型癥狀，與IBR臨床癥狀相符。其中1頭牛在攻毒后20 d臨床癥狀逐漸減輕，食欲逐漸恢復。另外一頭牛進行剖檢觀察，可見氣管出血，粘膜脫落，牛鼻腔中充滿了膿性分泌物，堵塞整個鼻道。

3.7 病毒分離與PCR檢測 結(jié)果顯示，分離物在MDBK細胞上能產(chǎn)生典型細胞病變效應，病毒培養(yǎng)物PCR檢測結(jié)果呈陽性，確診為IBR病毒感染發(fā)病。

3.8 疫苗的制備和檢驗 將實驗室制備的三批IBR滅活疫苗分別進行各項檢驗。表1結(jié)果表明，采用603佐劑制備的IBR滅活疫苗性狀良好、穩(wěn)定性好、黏度低、對小白鼠安全。

3.9 疫苗效力檢驗 將制備的三批滅活疫苗分別免疫抗體陰性牛，并對免疫牛進行IBR病毒攻毒試驗和中和抗體效檢測定。表2結(jié)果表明，免疫后IBR中和抗體效價較高，抗體效價幾何平均值可達1∶41以上，攻毒后免疫組牛均無IBR臨床癥狀，可達5/5保護。而對照組牛出現(xiàn)不同程度的發(fā)熱，持續(xù)高溫3 d以上，鼻鏡潮紅，流淚，眼睛有濃性分泌物，食欲減退等癥狀，剖檢后觀察可見對照組牛的鼻腔內(nèi)有膿性分泌物，靠近肺端氣管有大量的白色泡沫等病理變化。免疫家兔后抗體效價幾何平均值也可達1∶42以上，初步表明牛和家兔二者抗體效價存在一定的平行性。

表1 三批IBR滅活疫苗各項檢驗結(jié)果

表2 三批IBR滅活疫苗免疫效力試驗結(jié)果

4 小結(jié)

本研究采用MDBK細胞成功從疑似病例牛的鼻腔分泌物、陰道分泌物拭子中分離出IBR病毒。病毒在MDBK細胞上可產(chǎn)生明顯的細胞病變效應，且能被IBR陽性血清完全中和。采用特異性引物進行PCR檢測，可擴增出特異性目的片段，擴增產(chǎn)物經(jīng)測序與已發(fā)表的IBRV基因組序列一致。結(jié)果表明分離株為IBR病毒，從而也進一步證實了本病在我國的存在。

國外采用IBR滅活疫苗防控本病取得了很好的效果[6-7]，但在國內(nèi)該疫苗的研制尚處于實驗室研究階段[8]。本研究制備的IBR滅活疫苗免疫抗體陰性牛，中和抗體效價平均值可達1∶41以上，高于美國聯(lián)邦法規(guī)(9CFR)標準(≥1∶8)，證明疫苗免疫效果理想，為下一步開展IBR滅活疫苗新產(chǎn)品研發(fā)奠定了基礎。

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[4]徐曉琴，冷 血，李真光，等.牛傳染性 鼻氣管炎病毒IBRV-LN01/08株的分離鑒定[J].中國獸醫(yī)科學，2010，40(4):352-356.

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[8]冷 血，趙炳武，郭 利，等.牛傳染性鼻氣管炎滅活疫苗的安全性和免疫保護效果[J].中國獸醫(yī)科學，2010，40(11):1161-1165.