超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)豬尿中20種β-受體激動(dòng)劑殘留

李 丹，孫 雷，畢言鋒，蘇富琴，徐秉恩，王鶴佳，徐士新

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所國(guó)家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，北京100081)

β-受體激動(dòng)劑(β-agonists)是一類(lèi)化學(xué)合成的苯乙醇胺類(lèi)物質(zhì)，在飼料中添加該類(lèi)藥物給動(dòng)物飼喂后具有營(yíng)養(yǎng)再分配作用，可以明顯提高動(dòng)物的瘦肉率，但是人們食用了這些藥物殘留的畜禽產(chǎn)品后會(huì)出現(xiàn)面色潮紅、頭痛、頭暈、胸悶、心悸、四肢麻木等不良反應(yīng)癥狀[1-2]，嚴(yán)重的可能危及生命。因此國(guó)際上很多國(guó)家先后立法禁止在畜禽生產(chǎn)上使用該類(lèi)藥物，我國(guó)政府也明令禁止其使用。目前，歐盟和我國(guó)都將豬尿、豬肝、牛羊肉等動(dòng)物性食品中該類(lèi)藥物的檢測(cè)判定限定為1 μg/L(μg/kg)。

多年來(lái)，我國(guó)農(nóng)業(yè)部一直通過(guò)豬尿、豬肝和牛羊肉等樣品對(duì)國(guó)內(nèi)畜產(chǎn)品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇等β-受體激動(dòng)劑殘留實(shí)施例行監(jiān)測(cè)和殘留監(jiān)控，以確保我國(guó)動(dòng)物性食品質(zhì)量安全。其中，豬尿樣品相對(duì)于豬肝等動(dòng)物組織樣品，具有宰前檢測(cè)、樣品處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，隨著串聯(lián)四極桿質(zhì)譜和高分辨質(zhì)譜的廣泛應(yīng)用，人們不斷發(fā)現(xiàn)氯丙那林、齊帕特羅和其它種類(lèi)的β-受體激動(dòng)劑在養(yǎng)殖等環(huán)節(jié)非法添加使用，因此農(nóng)業(yè)部2010年1519號(hào)公告又禁止在飼料和動(dòng)物飲水中使用氯丙那林、齊帕特羅一系列新型的β-受體激動(dòng)劑，但農(nóng)業(yè)部現(xiàn)行的1025號(hào)公告-11-2008和1063公告-3-2008僅能對(duì)動(dòng)物尿液中4種和11種β-受體激動(dòng)劑進(jìn)行檢測(cè)，給違禁使用新型β-受體激動(dòng)劑的查處造成不便。本研究旨在研發(fā)一種能快速且準(zhǔn)確地定性定量檢測(cè)豬尿中20種β-受體激動(dòng)劑殘留的UPLC-MS/MS檢測(cè)方法，為行政主管部門(mén)對(duì)市場(chǎng)上已經(jīng)出現(xiàn)和可能出現(xiàn)的其他種類(lèi)新型的β-受體激動(dòng)劑進(jìn)行有效監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器 Acquity UPLC-Quattro premier XETM質(zhì)譜聯(lián)用儀(Waters公司);DKZ-2型電熱恒溫振蕩水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司);Delta 320 pH計(jì)(Mettler Toledo公司);Biofuge Strators高速冷凍離心機(jī)(賀利氏公司);Organomation Associates氮吹儀(Jnc公司);SIR4漩渦混合器(IKA公司)。

1.2 試劑和材料 吡布特羅、西馬特羅、特步他林、齊帕特羅、沙丁胺醇、西布特羅、克倫塞羅、克倫丙羅、羥甲基克侖特羅、氯丙那林、萊克多巴胺、克倫異磅特羅、克倫特羅、妥布特羅、福莫特羅、溴布特羅、克倫潘特、班布特羅、馬布特羅、馬噴特羅，西馬特羅-D7，沙丁胺醇-D3，萊克多巴胺-D3，克侖特羅 -D9，班布特羅 -D9，克倫潘特 -D5，克倫丙羅-D7，溴布特羅-D9純度均大于98.0%(Dr.Ehrenstorfer公司);β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶(Merck公司);乙腈、甲酸為色譜純(Fisher公司);氫氧化鈉、乙酸銨、叔丁醇、叔丁基甲醚均為分析純;所用水為超純水;MCX固相萃取柱(60 mg/3 cc，waters公司)

1.3 對(duì)照溶液配制 精密稱(chēng)定適量的吡布特羅、西馬特羅、特步他林、齊帕特羅、沙丁胺醇、西布特羅、克倫塞羅、克倫丙羅、羥甲基克侖特羅、氯丙那林、萊克多巴胺、克倫異磅特羅、克倫特羅、妥布特羅、福莫特羅、溴布特羅、克倫潘特、班布特羅、馬布特羅和馬噴特羅對(duì)照品，用甲醇配制成1 mg/mL的各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取0.1 mL的各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

精密稱(chēng)定適量的西馬特羅-D7，沙丁胺醇-D3，萊克多巴胺 -D3，克倫特羅 -D9，班布特羅 -D9，克倫潘特 -D5，克倫丙羅 -D7和溴布特羅 -D9，用甲醇配制成1 mg/mL的各內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取0.1 mL的各內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液至同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得10 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)工作液。

1.4 樣品前處理 準(zhǔn)確吸取豬尿2 mL于50 mL離心管內(nèi)，加入8種內(nèi)標(biāo)工作液適量，再加入0.2 mol/L乙酸銨緩沖液(pH=5.2)5 mL，β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶50 μL，渦旋混勻，37℃下避光水浴振蕩16 h。酶解后放置至室溫，用10 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至10±0.2，加入叔丁醇和叔丁基甲醚(6+4，V/V)15 mL，中速水平振蕩10 min，5000 r/min離心5 min，將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至另一離心管內(nèi)，50℃下氮?dú)獯抵馏w積小于1 mL，用2%甲酸溶液5 mL充分渦旋溶解，然后過(guò)經(jīng)甲醇和2%甲酸溶液活化好的MCX固相萃取柱，再用2%甲酸溶液和甲醇溶液淋洗，用4%氨水甲醇溶液3 mL洗脫，洗脫液于50℃下氮?dú)獯蹈?，殘余物?0%甲醇溶液0.5 mL溶解，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，供UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.5 儀器分析條件 色譜柱為BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7μm);流動(dòng)相A相為0.1%甲酸乙腈溶液，B相為0.1%甲酸溶液，梯度洗脫:0～1min，維持8%A;1～9 min，8%A線性變化至40%A;9～10 min，維持 8%A;流速為 0.3 mL/min;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。

電噴霧離子源(ESI+);毛細(xì)管電壓為3.2 kV;源溫為110℃;脫溶劑溫度為350℃;脫溶劑氣速為650 L/Hr;錐孔反吹氣速為50 L/Hr。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子情況見(jiàn)表1。

表1 20種β-受體激動(dòng)劑及內(nèi)標(biāo)監(jiān)測(cè)離子對(duì)、對(duì)應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 準(zhǔn)確量取適量的西馬特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、克倫特羅、班布特羅、克倫潘特、克倫丙羅和溴布特羅8種混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和內(nèi)標(biāo)工作液，制得濃度為2、5、10、20、50 μg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(內(nèi)標(biāo)濃度為10 μg/L)，依次上機(jī)測(cè)定，以各藥物定量離子質(zhì)量色譜峰面積與對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)(y)，標(biāo)液濃度為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程(表2)。8種β-受體激動(dòng)劑在2～50 μg/L的系列標(biāo)液濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99。

其他12種β-受體激動(dòng)劑取其混合標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，分別添加到2 mL空白豬尿中，制得濃度為0.5、1.25、5、10、12.5 μg/L 的系列空白添加試料，按1.4項(xiàng)下所述方法進(jìn)行處理，依次上機(jī)測(cè)定。以各藥物定量離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y)，添加濃度為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。可以看出12種β-受體激動(dòng)劑在0.5～12.5 μg/L的系列空白添加濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99(表2)。

表2 20種β-受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

2.2 方法靈敏度 采用空白添加目標(biāo)化合物的方法，依據(jù)特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比S/N＞3為方法檢測(cè)限，S/N＞10為方法定量限，得出吡布特羅、西馬特羅、特步他林、齊帕特羅、沙丁胺醇、西布特羅、克倫塞羅、克倫丙羅、羥甲基克倫特羅、氯丙那林、萊克多巴胺、克倫異磅特羅、克倫特羅、妥布特羅、福莫特羅、溴布特羅、克倫潘特、班布特羅、馬布特羅和馬噴特羅等20種藥物在豬尿中的定量限為0.5 μg/L，檢測(cè)限為0.25 μg/L。

1 μg/L空白豬尿添加試液中20種β-受體激動(dòng)劑特征離子質(zhì)量色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3 方法精密度與準(zhǔn)確度 在空白豬尿中添加0.5、1、5 μg/L三個(gè)不同濃度的20種β-受體激動(dòng)劑進(jìn)行回收率試驗(yàn)，結(jié)果匯總見(jiàn)表3?？梢钥闯觯?0種β-受體激動(dòng)劑在空白組織中的平均添加回收率為75.7%～110.7%，批內(nèi)批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于20%。

3 討論與小結(jié)

由于沙丁胺醇和萊克多巴胺等部分β-受體激動(dòng)劑在動(dòng)物體內(nèi)代謝過(guò)程中，在葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶、硫酸酯等作用下發(fā)生各種軛合反應(yīng)，生成各種軛合物長(zhǎng)期存在，因此在樣品提取前要通過(guò)對(duì)應(yīng)的酶類(lèi)進(jìn)行水解，使其結(jié)合態(tài)的待測(cè)物解離釋放出來(lái)。有關(guān)酶解的條件、酶的品種、酶用量、酶解時(shí)間均有報(bào)道[3]，本方法采用了2 mL豬尿中添加50 μL β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，避光酶解16 h的方法進(jìn)行。

表3 豬尿中20種β-受體激動(dòng)劑添加回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

為了提取酸性水溶液中成鹽的β-受體激動(dòng)劑，先用濃氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至堿性，使藥物呈游離狀態(tài)，進(jìn)而采用有機(jī)溶劑進(jìn)行液液萃取，把豬尿中殘留的20種β-受體激動(dòng)劑盡可能地提取出來(lái)。針對(duì)20種β-受體激動(dòng)劑，本方法通過(guò)參考相關(guān)文獻(xiàn)，選擇在pH=10條件下進(jìn)行[4-5]。已報(bào)道的提取溶劑選擇有乙酸乙酯、異丙醇、叔丁醇、氯仿、乙醚和叔丁基甲醚等不同溶劑系統(tǒng)組合及不同配比組合[6-7]，本方法為兼顧20種不同性質(zhì)的β-受體激動(dòng)劑，重點(diǎn)考察了乙酸乙酯+叔丁醇和叔丁醇+叔丁基甲醚兩組溶劑系統(tǒng)及其不同配比的提取效果，最終選擇了叔丁醇+叔丁基甲醚(6+4，V/V)從水相中萃取20種β-受體激動(dòng)劑的方法，獲得了滿(mǎn)意的結(jié)果。

本方法通過(guò)對(duì)樣品前處理?xiàng)l件的充分優(yōu)化改進(jìn)，建立了豬尿中20種β-受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè)的UPLC-MS/MS方法，其靈敏度、精確度均能滿(mǎn)足獸藥殘留分析方法的要求，同時(shí)也為我國(guó)市場(chǎng)上已經(jīng)出現(xiàn)和可能出現(xiàn)的其他種類(lèi)新型的β-受體激動(dòng)劑實(shí)施監(jiān)管提供了實(shí)驗(yàn)技術(shù)支撐。

[1]孫 雷，張 驪，朱永林，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)動(dòng)物源食品中9種β-受體激動(dòng)劑殘留[J].色譜，2008，6:709-713.

[2]孫 雷，劉 琪，張 驪，等.豬尿中四種β-受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法研究[J].中國(guó)獸藥雜志，2008，4:15-18.

[3]李俊鎖，邱月明，王 超.獸藥殘留分析[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2002:365.

[4]朱 堅(jiān)，李 波，方曉明，等.氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定肝、腎和肉中11種β-受體激動(dòng)劑殘留量[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2005，26(3):129-137.

[5]孟 娟，邵 兵，吳國(guó)華，等.氣相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定動(dòng)物性食品中8種β-興奮劑的殘留量[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2005，15(6):641-643.

[6]孔 瑩，邱月明，李 鵬，等.固相萃取/氣相色譜-質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定豬肉中4種β-受體激動(dòng)劑類(lèi)藥物殘留量[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2006，25(2):63-70.

[7]吳平谷，陳慧華，王 強(qiáng)，等.氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物組織中殘留的10種 β2-興奮劑[J].色譜，2008，26(1):39-42.