共表達PRRSV GP5和N蛋白重組桿狀病毒的構(gòu)建與鑒定

楊 雷，漆世華，溫文生，李玉萍，王煥君，謝紅玲

(武漢中博生物股份有限公司，武漢430070)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)主要引起妊娠母豬繁殖障礙和仔豬的呼吸道疾病及免疫抑制和持續(xù)性感染，死亡率不斷升高[1-2]。1996年郭寶清等[3]首次從國內(nèi)疑似豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)感染豬群中分離出PRRSV，從而證實了本病在我國的存在。PRRSV是動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬的單股正鏈RNA病毒。其全基因組長約15 kb，含有9個開放閱讀框(ORFs)，0RFla和0RFlb編碼蛋白聚合酶，ORF 2～7分別編碼結(jié)構(gòu)蛋白GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、M 和 N 蛋白[4]。其中，N蛋白也稱核衣殼蛋白，由0RF7編碼，在病毒粒子中含量較高，N基因高度保守。N蛋白約15 kD，至少有5個抗原決定簇，其中包括兩型的共同決定簇和特異性決定簇，具有一個糖基化位點，但它不是?糖基化蛋白。N蛋白的C端在維持蛋白構(gòu)象上起重要作用。其N端半段是由Arg、Lys、His 3中堿性氨基酸組成，可能和RNA基因組間的相互作用有關。N蛋白之間形成同源二聚體，對病毒的組裝至關重要，可以誘導機體產(chǎn)生細胞免疫作用[5]。GP5蛋白約25 kD，由0RF5編碼，是一個糖基化蛋白，含有4個糖基化位點，且非常不保守，三次跨膜，并有一個70個氨基酸殘基的胞外區(qū)。有6個抗原決定簇，有證據(jù)表明GP5在PRRSV的抗體識別過程中起關鍵作用，是誘導機體產(chǎn)生中和抗體的主要結(jié)構(gòu)蛋白，病毒中和作用與抗GP5抗體效價呈顯著相關性，同時 GP5還可誘導細胞凋亡，是公認的PRRSV的主要保護性抗原[6]。

目前用于預防PRRS的疫苗主要是傳統(tǒng)疫苗——弱毒苗和滅活苗。盡管弱毒疫苗能夠提供較好的免疫保護，但存在毒力返強和散毒的危險[7]。而滅活疫苗誘導產(chǎn)生的抗體水平很低，且極不穩(wěn)定。因此，研發(fā)確實、可靠、高效的新一代疫苗也是未來一個方向。本研究利用桿狀病毒雙表達載體(pFastBacTMDual)同時表達HP-PRRSV GP5蛋白和N蛋白，以期更好的發(fā)揮PRRSV GP5、N抗原活性及協(xié)同作用，為PRRSV基因工程疫苗的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 載體、細胞、菌株與病毒 桿狀病毒載體pFastBacTMDual、昆蟲 Sf9 細胞、E．coli DH10Bac購于美國Invitrogen公司。高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒廣東分離株(PRRSV GD)由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶、PCR相關試劑為TaKaRa公司產(chǎn)品;Cellfectin?ⅡReagent為Invitrogen公司產(chǎn)品;抗PRRSV N蛋白的鼠單克隆抗體為美國VMRD公司，Prod:P080728-004;抗PRRSV GP5蛋白的兔多抗為英國ABCAM公司，Prod:RS-4504R;PRRSV GP5抗體檢測試劑盒為法國LSI公司，Batch:5-VRTPRA-028;PRRSV N抗體檢測試劑盒為美國IDEXX公司，Prod:Z411。

1.3 引物設計和PCR擴增 參照PRRSV GD株(GenBank登錄號:EU109503.1)ORF7和ORF5基因的序列，各設計一對針對PRRSV GD毒株N和GP5蛋白基因的特異性引物，擴增N蛋白基因帶BamHⅠ酶切位點的上游引物 NF:5’-GGATCCATGCCAAATAACAACGGCAAGC-3’和帶 HindⅢ酶切位點的下游引物 NR:5’-AAGCTTTCATGCTGAGGGTGATGCTGTG-3’;擴增 GP5蛋白基因帶XhoⅠ酶切位點的上游引物GP5F:5’-CTCGAGATGTTGGGGAAGTGCTTGACC-3’和帶 KpnⅠ酶切位點的下游引物 GP5R:5’-GGTACCCTAGAGACGACCCCATCGTTC-3’，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

按照TakaR RNA試劑盒說明書提取PRRSV GD株RNA，以oligo(dT)為引物，以M-MLV進行反轉(zhuǎn)錄;然后以cDNA產(chǎn)物為模板，應用PCR技術擴增出PRRSV GD毒株的N和GP5全基因;N和GP5基因的擴增條件均為:94℃ 5 min;94℃ 40 s，60 ℃ 40 s，72℃ 45 s，35個循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳。

1.4 重組桿狀Bac-N-GP5病毒的制備 將PCR擴增的N蛋白基因和GP5蛋白基因通過酶切及酶連接的方式插入桿狀病毒載體pFBD(pFast-BacTMDual的縮寫)中，獲得含有 N蛋白基因和GP5蛋白基因的重組桿狀病毒載體pFBD-NGP5。N蛋白基因通過polyhedrin啟動子調(diào)控，GP5基因由p10啟動子直接調(diào)控，其構(gòu)建示意圖見圖1。

按照Invitrogen說明書將上述重組載體pFBDN-GP5通過 Bac-to-Bac系統(tǒng)(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)轉(zhuǎn)入 DH10Bac E．coli，進行菌內(nèi)同源重組。用卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素篩選獲得重組病毒DNA，PCR鑒定，然后將正確的重組病毒DNA用Cellfectin?ⅡReagent傳染SF9細胞，培養(yǎng)3～4 d，獲得重組的桿狀病毒Bac-N-GP5。

圖1 重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

1.5 IFA檢測重組桿狀病毒Bac-N-GP5的表達

重組桿狀病毒Bac-N-GP5接種Sf9細胞72 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞兩次，80%(V/V)冷丙酮固定細胞 20 min，PBS洗三次，加鼠抗PRRSV N/兔抗PRRSV GP5抗體 (1∶100)37℃作用1 h，PBS洗三次，F(xiàn)ITC標記羊抗鼠二抗/羊抗兔二抗(1∶500)37 ℃作用1 h，PBS 洗三次，50%(V/V)甘油封片，熒光顯微鏡觀察。

1.6 Western blot檢測 將感染重組桿狀病毒的細胞裂解液通過12%SDS-PAGE電泳分離蛋白，采用半干轉(zhuǎn)移(Bio-Rad)轉(zhuǎn)印硝酸纖維膜，并設細胞裂解液作為空白對照。用含5%脫脂乳的PBST封閉過夜，分別以 N和 GP5蛋白的抗體為一抗，1∶1000稀釋，室溫孵育1 h;辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG和羊抗兔IgG為二抗，1∶1000稀釋，室溫孵肓1 h。用DAB顯色液進行顯色作用。

1.7 重組桿狀病毒在小鼠中的免疫原性測定 用感染重組桿狀病毒的細胞裂解液以鋁佐劑為佐劑，于0和14 d免疫小鼠，于免疫后7、14、21、28 d采集小鼠血清，用ELISA測定抗N蛋白和抗GP5蛋白的抗體水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組桿狀病毒Bac-N-GP5的構(gòu)建與鑒定

通過RT-PCR擴增得到了ORF7和ORF5基因，將其克隆入桿狀病毒表達載體pFBD中，獲得重組質(zhì)粒pFBD-N-GP5。經(jīng)PCR鑒定表明基因N和GP5克隆到桿狀病毒表達載體pFBD中(圖2)，測序表明該重組質(zhì)粒的讀碼框正確。

圖2 PCR檢測重組質(zhì)粒pFBD-N-GP5

2.2 IFA鑒定重組桿狀病毒的表達 用針對PRRSVN和GP5蛋白的抗體進行IFA試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組桿狀病毒感染的細胞出現(xiàn)明顯的熒光，而對照組則看不到熒光(圖3)。證明N蛋白和GP5蛋白可以在重組桿狀病毒中共同表達。

2.3 重組桿狀病毒W(wǎng)estern blot分析 重組桿狀病毒感染Sf9細胞后經(jīng)Western blot檢測，結(jié)果見圖4?？筃蛋白抗體和抗GP5蛋白的抗體分別檢測到約為15 kD的N蛋白和25 kD的GP5蛋白條帶。證實N和GP5重組蛋白在Sf9細胞中表達成功。

2.4 重組桿狀病毒在小鼠中的免疫原性測定 用感染重組桿狀病毒的細胞裂解液以鋁佐劑為佐劑，于0和14 d免疫小鼠，于免疫后7、14、21、28 d采集小鼠血清，分別用抗PRRSV N蛋白和GP5蛋白的抗體ELISA檢測試劑盒對免疫后的血清中的N蛋白產(chǎn)生的抗體和GP5蛋白產(chǎn)生的抗體進行測定，結(jié)果表明免疫組血清抗N蛋白和抗GP5蛋白的抗體在14 d開始升高，21和28 d的抗體值明顯高于對照組(圖5、圖6)，說明重組桿狀病毒表達的N和GP5蛋白對小鼠能夠產(chǎn)生很好免疫原性。關于重組桿狀病毒對本屬動物豬的免疫和攻毒保護效果還有待于進一步研究。

圖3 重組桿狀病毒表達N和GP5蛋白的間接免疫熒光檢測

3 討論

目前PRRS的防治主要依靠傳統(tǒng)疫苗，即弱毒疫苗和滅活苗，但由于這些疫苗均存在不同程度的缺陷，主要是免疫效果不理想。此外，活疫苗還存在毒力返強和散毒的危險等。因此國內(nèi)外許多研究者都在努力探索各種形式的基因工程疫苗，使用不同的表達系統(tǒng)來表達主要免疫原PRRSV中的GP5、N和M蛋白基因及一些細胞因子。其中桿狀病毒一昆蟲細胞表達系統(tǒng)是目前較好的真核表達系統(tǒng)，此系統(tǒng)能夠提高外源蛋白產(chǎn)量，并且表達的蛋白能夠經(jīng)過正確的翻譯后修飾加工，更接近天然蛋白的構(gòu)象和活性，因此該系統(tǒng)被應用于很多外源蛋白的表達。

本試驗將PRRSV的ORF7基因和ORF5基因分別插入到polyhedrin啟動子和p10啟動子下，構(gòu)建重組桿狀病毒。結(jié)果表明，用重組病毒Bac-N-GP5感染Sf9細胞后，經(jīng)IFA和Western blot檢測，能夠在細胞中檢測到N和GP5蛋白的共表達。動物免疫試驗表明，重組桿狀病毒免疫小鼠后血清中N和GP5蛋白的抗體水平明顯高于對照組，說明重組蛋白能夠引發(fā)小鼠較強的體液免疫反應。本試驗利用桿狀病毒雙表達系統(tǒng)同時在Sf9細胞中表達PRRSV N蛋白和GP5蛋白，為下一步應用重組桿狀病毒作為PRRSV亞單位疫苗奠定了基礎。

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