基于甘草對醋芫花瀉下逐水效應的影響探討反藥組合配伍禁忌機制

余 果，陳艷琰，段金廒，徐 立，陳夏娟，宋宏繡，王 夢，錢大瑋

（南京中醫(yī)藥大學1.江蘇省方劑高技術研究重點實驗室，2.藥物安全性評價中心，江蘇 南京 210046）

藥物之間作用“相反”一詞最早見于《神農本草經》，中藥“十八反”經歷代醫(yī)家增刪，逐漸成為中藥配伍禁忌的代名詞，也是中醫(yī)用藥配伍禁忌的核心內容，但古今醫(yī)家中不乏對其應用者，其是否為絕對的配伍禁忌，一直是臨床研究、實驗研究和文獻研究爭議的焦點。芫花（Flos Genk wa）反甘草（Radix et Rhizo ma Gl ycyrr hizae）是“十八反”的重要組成部分，但迄今為止，對兩藥是否相反尚無實驗論據［1－2］?！吨腥A人民共和國藥典》2010版（下稱《藥典》）中記載，芫花是瀉水逐飲藥，而甘草屬于補益藥，并能調和諸藥，緩解藥物毒性和烈性。古人所說的“相反”，是否可能為甘草對芫花功效的減緩？另一方面，因芫花藥力峻猛，且有毒性，臨床上常用醋炙芫花；《藥典》規(guī)定的醋芫花臨床用量（每次0.6～0.9 g，每天1次）也遠低于生芫花（每次1.5～3 g，每天1次）。本研究旨在遵照臨床用藥習慣考察甘草對芫花藥效的影響。因此，本研究選用醋芫花粉末和甘草水提液，采用析因設計配伍，通過藥效實驗研究和統(tǒng)計學分析（包括傳統(tǒng)的方差分析和重復測量數據的分析），觀察《藥典》等效劑量下醋芫花對水負荷小鼠的利尿和瀉下作用，并比較與甘草配伍后對利尿和瀉下作用的影響，以闡明甘草是否可降低芫花利水瀉下的作用，從而揭示芫花與甘草配伍禁忌的藥效作用特征及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物

芫花產自安徽省六安市吳家店鎮(zhèn)，甘草產自寧夏靈武市美康甘草基地，由南京中醫(yī)藥大學段金廒教授鑒定分別為瑞香科植物芫花（Daphne genk wa Sieb.et Zucc.）的干燥花蕾和豆科植物甘草（Gl ycyrrhiza uralensis Fisch.）的干燥根及根莖，標本收藏于南京中醫(yī)藥大學江蘇省方劑高技術研究重點實驗室樣品室。

醋芫花粉末的制備：取生芫花按照《藥典》2010版附錄ⅡD項下醋炙法炮制后打粉，過100目篩。甘草水提液的制備：甘草加10倍量水，浸漬30 min，回流提取2次，每次2 h，過濾，濾液合并制備至相應濃度。醋芫花粉末甘草水提合并液的制備：根據上述實驗設計臨用前將醋芫花粉末與甘草水提液混合。陽性對照藥選擇氫氯噻嗪（hydrochlorothiazide），江蘇方強制藥廠有限責任公司，批號201109032，臨用前稱取適量粉末，加少量蒸餾水適當研磨后，稀釋至所需濃度。

1.2 動物和儀器

SPF級ICR小鼠，雄性，體質量18～21 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，動物許可證號：SCXK（滬）2007－0005。JM12001型電子天平，浙江省紀銘稱重校驗設備有限公司；ACS6型電子計價秤，凱豐集團有限公司。

1.3 實驗設計

實驗采用2因素4水平（2／4）析因設計分組，因素水平見表1?！端幍洹分幸?guī)定，醋芫花臨床用量為每次0.6～0.9 g，每天1次；甘草臨床用量為每次2～10 g，每天1次。本研究中醋芫花2／4水平的給藥劑量分別對應《藥典》中規(guī)定的等效低限、高限和高限2倍劑量，即0.12，0.18和0.36 g·kg－1；甘草2／4水平的給藥劑量分別對應《藥典》中規(guī)定的甘草等效低限0.5倍、低限和低限2倍劑量，即0.2，0.4和0.8 g·kg－1。

Tab.1 Factors and levels of Flos Genkwa powder processed by vinegar（FGV）and decoction of Radix et Rhizome Glycyrrhizae（RRG）

1.4 實驗分組、小鼠排尿量、排便量和排便次數的測定

取健康小鼠170只，隨機分為17組，每組10只，分別為析因設計產生的16組（表2）及陽性對照組（氫氯噻嗪40 mg·kg－1）。給藥前禁食24 h，不禁水，實驗前輕壓小鼠下腹部，排盡遺尿后每只小鼠ip給予1.0 ml生理鹽水作水負荷，同時單次ig給藥，給藥體積均為30 ml·kg－1。各鼠分別置于鋪有濾紙的燒杯內進行觀察，燒杯下鋪墊兩層濾紙收集尿液，濾紙下襯培養(yǎng)皿，濾紙上放置隔離裝置，防止小鼠啃噬濾紙。于ig給藥后0～1 h，1～2 h，2～3 h和3～4 h時段分別記錄濾紙的總增重和去除干便后濾紙的增重，記錄小鼠排稀便的時間、排便次數、糞便形狀以及糞便沾污肛門情況。

Tab.2 Mouse grouping and dosages of FGV and RRG

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 醋芫花與甘草配伍對小鼠排尿量的影響

2.1.1 不同時段累積尿量單因素方差分析

對不同時段累積尿量進行單因素方差分析結果表明，陽性對照組0～1 h，1～2 h和1～4 h累積排尿量分別為0.83±0.19，0.76±0.10和（2.20±0.25）g，與正常對照組比較均明顯增加（n＝10，P＜0.01）。由表3可以看出，與正常對照組（組1）比較，醋芫花0.12和0.18 g·kg－1單用組（組2和組3）0～1 h排尿量無明顯變化；醋芫花0.12和0.24 g·kg－1單用組（組2和組4）1～2 h排尿量明 顯增加（P＜0.01），分別增加45%和36%，醋芫花0.18 g·kg－1單用組（組3）1～2 h排尿量無明顯變化；醋芫花0.12和0.24 g·kg－1單用組（組2和組4）0～4 h排尿量明顯增加（P＜0.05）；由此表明，醋芫花具有較強的利尿作用，且起效較迅速。

甘草單用組（組5～組7）與正常對照組比較，各時段及0～4 h累積排尿量均無明顯變化，表明甘草水提液對水負荷小鼠排尿量無明顯影響，提示甘草無明顯利尿作用（表3）。

進一步分析醋芫花與甘草合用對水負荷小鼠排尿量的影響，即醋芫花與甘草配伍組（組8～組16）分別與等劑量醋芫花單用組（組2～組4）進行組間比較。① 醋芫花0.12 g·kg－1與甘草0.2，0.4和0.8 g·kg－1合用（組8～組10），其中醋芫花0.12 g·kg－1與甘草0.8 g·kg－1合用組（組10）小鼠1～2 h排尿量與等劑量醋芫花0.12 g·kg－1單用組（組2）相比明顯下降（P＜0.01），該組芫花與甘草配伍劑量比為1∶6.7。從醋芫花單用和與甘草配伍給藥后各時段小鼠排尿量增長率（相較于正常對照組）曲線來看，原醋芫花單用陡峭的曲線在合用甘草后變得較為平 緩 （圖 1）。② 醋 芫 花 0.18 g·kg－1單用組（組3）除小鼠0～4 h累積排尿量與正常對照組比較增加（P＜0.05）外，其他各時段排尿量與正常對照組比較無明顯差異；醋芫花0.18 g·kg－1與甘草0.2，0.4和0.8 g·kg－1配伍合用（組11～組13），只有醋芫花0.18 g·kg－1與甘草0.2 g·kg－1配伍合用組（組11）0～1 h排尿量與等劑量醋芫花0.18 g·kg－1單用組（組3）比較顯著減少（P＜0.05），其他兩組各時段排尿量與等劑量醋芫花0.18 g·kg－1單用組（組3）比較均無明顯變化。③ 醋芫花0.24 g·kg－1與甘草0.2，0.4和0.8 g·kg－1配伍合用（組14～組16），只有醋芫花0.24 g·kg－1與甘草0.2 g·kg－1配伍合用（組14）小鼠2～3 h排尿量與等劑量醋芫花0.24 g·kg－1單用組 （組 4）比較顯著增加（P＜0.01），其他兩組各時段排尿量無明顯變化。

Fig.1 Curves of increase rate of mouse urination of FGV 0.12 g·kg－1 alone and FGV 0.12 g·kg－1 with RRG 0.2，0.4 and 0.8 g·kg－1 groups compared to nor mal control group.See Tab.3 f or t he mouse treat ment.The increase percentages of t he mouse urination in each hour co mpared to t he nor mal contr ol group were deter mined.

Tab.3 Effect of mixed decoction of FGV and RRG on mouse urination

2.1.2 重復測量方差分析

對小鼠0～4 h排尿量采用重復測量數據的方差分析進行檢驗，以4次不同時段重復測量的排尿量作為個體內因素（wit hin－subject factor），以不同的給藥方案作為個體間因素（bet ween－subject factor）。結果表明，各組在不同時段即0～1 h，1～2 h，2～3 h和3～4 h以及不同組別之間小鼠排尿量有顯著性差異（P＜0.01），并且給藥組與測量時間存在交互作用（P＜0.01）。經組間多重比較，醋芫花0.12和0.18 g·kg－1單用組（組2和組3）與正常對照組比較明顯增加（P＜0.05）。與甘草0.2，0.4和0.8 g·kg－1配伍合用，配伍組與等劑量單藥組比較無顯著性差異。

2.1.3 析因設計方差分析

醋芫花與甘草的交互作用采用重復測量數據的雙因素析因方差分析進行檢驗，以4次不同時段重復測量的排尿量作為個體內因素，再以醋芫花與甘草的給藥劑量分別作為兩種不同的處理因素，選為個體間因素。分析結果表明，醋芫花可使小鼠的排尿量顯著增加（P＜0.05），甘草對此無明顯影響，醋芫花與甘草無交互作用，但P值接近0.05（P＝0.074）。

2.2 醋芫花與甘草配伍對小鼠排便的影響

觀察醋芫花對小鼠排便量和排便次數的影響（表4和表5），并觀察有無稀便。結果表明，醋芫花0.18 g·kg－1單用組（組3）0～1 h排便量和0～4 h總排便量較正常對照組顯著增加（P＜0.01和P＜0.05），醋芫花0.12和0.24 g·kg－1單用組（組2和組4）0～4 h總排便量較正常對照組比較無明顯變化，僅分別在0～1 h和2～3 h時段明顯增加（P＜0.05），但未見明顯排稀便的現象，僅出現便軟、便多，說明醋芫花具有輕微的瀉下作用。甘草給藥后排便量及排便次數均無明顯變化。

進一步考察醋芫花與甘草配伍合用對小鼠瀉下作用的影響。將醋芫花與甘草配伍合用組（組8～組16）分別與等劑量的醋芫花單用組（組2～組4）進行比較，其中僅醋芫花0.12 g·kg－1與甘草0.4 g·kg－1配伍組（組9）2～3 h排便量與等劑量醋芫花0.12 g·kg－1單用組（組2）比較顯著減少（P＜0.05），但總排便量和排便次數無明顯變化；醋芫花0.18和0.36 g·kg－1與甘草0.2，0.4和0.8 g·kg－1配伍合用組分別與等劑量醋芫花單用組比較小鼠總排便量和排便次數均無明顯變化，表明甘草對醋芫花的瀉下作用無明顯影響。

Tab.4 Effect of mixed decoction of FGV and RRG on mouse feces weight

Tab.5 Effect of mixed decoction of FGV and RRG on defecation numbers of mouse

3 討論

芫花為傳統(tǒng)的瀉水逐飲藥，現代藥理研究表明芫花在一定劑量范圍具有利尿和促進瀉下作用［3，5］。本研究結果表明，在《藥典》等效劑量范圍內，醋芫花粉末具有利尿和瀉下的作用，并以利尿作用為主，瀉下作用較輕微，其中《藥典》低限和高限等效劑量（0.12和0.18 g·kg－1）單用組小鼠0～1 h排尿量與正常對照組相比增長率均為13%，各劑量組1～2 h排尿量均明顯增加，其中醋芫花0.12和0.24 g·kg－1單用組與正常對照組比較明顯增加，增長率分別為45%和36%，表明醋芫花具有較強的利尿作用，且起效較迅速。

為了比較各給藥方案對排尿量有無顯著性影響，4次不同時段重復測量的排尿量有無顯著性差異，以及給藥組與測量時間的交互作用，本研究同時采用重復測量數據的單因素方差分析進行檢驗。結果顯示，醋芫花《藥典》低限和高限劑量組與正常對照組比較有統(tǒng)計學差異，與傳統(tǒng)的單因素方差分析統(tǒng)計結果基本一致。

本研究重點考察了醋芫花與甘草合用后對水負荷小鼠排尿量的影響。結果顯示，醋芫花0.12 g·kg－1使1～2 h排尿量明顯增加；與甘草0.2，0.4和0.8 g·kg－1配伍合用，0～1 h排尿量無明顯變化，1～2 h排尿量與等劑量醋芫花0.12 g·kg－1單用組明顯減少，表明甘草可明顯抑制醋芫花的利尿作用。從醋芫花與甘草配伍用藥后各時段尿量增長率曲線來看，原醋芫花單用陡峭的曲線在配伍甘草后變得較為平緩，表明甘草可減緩醋芫花利水的作用。

從析因設計方差分析結果來看，醋芫花對小鼠的排尿量有顯著作用，甘草無影響，醋芫花與甘草有交互作用的趨勢，雖然沒有統(tǒng)計學意義，但P值接近0.05（P＝0.074），同樣提示甘草有拮抗醋芫花對排尿量影響的趨勢，這有助于今后進一步的機制研究。

在本研究中還發(fā)現，甘草對醋芫花利尿作用的影響與用量和配伍比例有關。當醋芫花劑量大于甘草劑量，且醋芫花和甘草的劑量均非《藥典》劑量范圍內時，未體現出抑制作用，相反有一定程度的增加。本研究結果表明，在《藥典》劑量范圍內，醋芫花甘草配伍比例接近于1∶1，1∶2，1∶3和1∶7時，甘草對醋芫花的利尿作用均顯示出不同程度的抑制作用。從對單時段小鼠排尿量的影響來看，醋芫花甘草配伍比例為1∶6.7時甘草對醋芫花利尿作用的抑制率最高；從對0～4 h累積尿量的影響來看，經過重復測量方差分析，醋芫花甘草配伍比例為1∶3.3時甘草對醋芫花利尿作用的抑制作用最強。本課題組前期研究表明，芫花與甘草配伍比例為1∶3.3時，一定劑量范圍內芫花與甘草反藥組合可顯著抑制小鼠的自發(fā)活動［4］，該配伍比例亦符合《藥典》醋芫花低限劑量與甘草低限劑量的比值，是臨床常用的配伍比例，提示在臨床用藥時芫花與甘草配伍易產生“兩藥相反”的作用。

一般認為芫花中的油脂狀物對黏膜有強烈的刺激作用，其中二萜原酸酯類如芫花酯甲為芫花利水作用的活性成分，但其在芫花中的含量尚不足萬分之一，如劑量高則具有較強的毒性［5－7］。此外，芫花中的黃酮類化合物如芫花素和木犀草素等，可治療“痰、咳、喘和炎”四癥，亦具有“瀉水逐飲”的作用［5，7］。甘草含有甘草酸和甘草次酸，甘草酸是甘草中含量最高的苷類化合物，其在體內可代謝為甘草次酸，甘草具有鹽皮質激素樣作用，即醛固酮樣作用。實驗和臨床研究表明，甘草酸和甘草次酸均能使人和實驗動物尿量和鈉排出減少，鉀排出增多，從而引起水腫，具抗利尿作用［8］，兩者在“瀉水逐飲”這方面的作用可能是其“相反”的機制之一。同時，也從另一角度驗證了甘草“甘緩守中”的藥性可減緩芫花“利水”的作用，這可能是芫花與甘草配伍禁忌的原因之一。

本研究結果表明，醋芫花的利尿作用與給藥劑量有關，超出《藥典》劑量范圍，0～4 h累積排尿量并未明顯增加，相反0～1 h尿量有所減少，推測可能由于其毒性成分增加，對心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和中樞神經系統(tǒng)產生影響。相關毒性作用尚待深入研究。

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