高原環(huán)境影響藥物代謝細(xì)胞色素P450酶活性的研究進展

郝 穎，王 榮，3，謝 華，孫玉環(huán)，3，李文斌，賈正平，3

(蘭州大學(xué)1.生命科學(xué)學(xué)院，3.藥學(xué)院，甘肅 蘭州，730000;2.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院全軍高原損傷防治重點實驗室，甘肅蘭州 730050)

高原具有獨特的環(huán)境特征，其中低氧和低壓是影響人體正常生命活動的主要因素。隨著高原醫(yī)學(xué)和藥理學(xué)的發(fā)展，高原疾病的防治工作，以及高原環(huán)境對藥物代謝的影響等方面的研究已經(jīng)取得了一定進展。但是，高原環(huán)境如何影響藥物代謝，以及相關(guān)機制方面的研究仍處于探索階段，本文對近年來高原環(huán)境對影響藥物代謝的主要酶系—細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP)酶活性的研究現(xiàn)狀做一綜述。

1 高原環(huán)境的特殊性

高原是指海拔高度一般在1000 m以上、面積廣大、地形開闊、周邊以明顯的陡坡為界以及比較完整的大面積隆起地區(qū)［1］。高原有其獨特的環(huán)境特征，首先大氣壓低、含氧量和氧分壓低。在平原地區(qū)，大氣壓為760 mmHg(1 mmHg=133.3 Pa)，氧分壓為159 mmHg，氧分壓大約占大氣壓的20.93%。當(dāng)海拔達到3500 m時，大氣壓和氧分壓分別下降到493 mmHg和103 mmHg，氧分壓與平原地區(qū)相比降低了35%，而海拔達到4500 m時，氧分壓降低40%(91 mmHg)。氧分壓的降低使進入氣管和肺泡的氧氣減少，造成了機體各組織器官的缺氧［2］。其次，高原地區(qū)氣候寒冷和紫外線強。這種特殊的環(huán)境因素容易引起人體一系列的不適反應(yīng)，如頭疼、氣短、惡心、呼吸急促、心跳加快、嘔吐和失眠等［3］。

近些年來，隨著西北大開發(fā)、高原旅游業(yè)的興起及高原突發(fā)事件的增加，使得高原活動日益頻繁，高原急救、治療及高原防護用藥迫在眉睫，高原治療用藥逐漸成為醫(yī)學(xué)和藥學(xué)研究人員關(guān)注的重點，相關(guān)高原環(huán)境下的藥物代謝研究逐漸被重視。另外，鑒于高原的特殊環(huán)境，關(guān)注高原居住人群的個體化用藥，以及高原地區(qū)駐防和救災(zāi)官兵的用藥成為藥學(xué)工作者責(zé)無旁貸的任務(wù)。

2 與藥物代謝相關(guān)的細(xì)胞色素P450酶

2.1 細(xì)胞色素P450酶的分類

在人體各個器官中，肝是藥物代謝的主要器官。而在代謝藥物中起關(guān)鍵作用的酶是位于肝微粒體的CYP酶系。該酶系是由一個龐大的基因家族編碼調(diào)控的混合功能氧化酶系統(tǒng)。CYP酶因自身在還原狀態(tài)下能與CO結(jié)合，在波長為450 nm處有一最大吸收峰而得名。CYP酶參與大部分藥物和外源物的生物氧化，其中包括烷基的羥基化、烷基的環(huán)氧化、羥基的氧化、CYP氨部位上的羥基化和氧化等。涉及大多數(shù)藥物代謝的酶系主要有CYPl，CYP2和CYP3 3個家族，相關(guān)的7種重要的亞基包括:CYP1A2， CYP2A6， CYP2B6， CYP2C， CYP2D6，CYP2E1和CYP3A，它們分別占 CYP總量的13%，4%，0.2%，20%，1% ～2%，7% 和30%［4］。各基因尚存在著大量等位基因，大量等位基因的存在是引起CYP藥物氧化代謝個體差異和種族差異的生化基礎(chǔ)［4-5］。其中CYP3A4是成人肝CYP中最重要的成分，大約50%的藥物是通過CYP3A4代謝的。此外，該酶還參與了部分前致癌物質(zhì)的活化，與之相關(guān)的藥物相互作用亦十分多見。

2.2 細(xì)胞色素P450酶的檢測方法

2.2.1 肝微粒體酶蛋白的制備與測定

肝微粒體酶蛋白的制備關(guān)鍵取決于酶活性不被降解。目前常用差速離心與超高速(105 000×g)離心沉淀聯(lián)用的方法制備肝微粒體，并保證緩沖液接近生理狀態(tài)。制備肝微粒體后，進行微粒體蛋白濃度和CYP含量的測定以便為CYP酶活性進一步研究提供可靠依據(jù)。目前常用于肝微粒體總蛋白濃度測定法有Folin-酚試劑法(Lowry法)、紫外吸收法、考馬斯亮藍法，還有近年來廣為應(yīng)用的BCA法;CYP酶含量的測定常用CO差示光譜法［6-8］。

2.2.2 細(xì)胞色素P450酶活性的檢測方法

藥物代謝是由具有催化活性的CYP酶進行的。目前，國外已將CYP及其相關(guān)亞型的測定列入新藥的篩選及代謝研究的必須項目，但我國還處于探索階段，尤其在高原等特殊環(huán)境下的對CYP酶與藥物相互作用的研究還較少，所以應(yīng)倡導(dǎo)該方面的研究，為高原藥物的研發(fā)和篩選提供依據(jù)。

分析檢測CYP酶活性的方法簡述如下。

(1)基因分析法 即采用基因分型的方法直接測定特定的DNA變異來評價藥物代謝酶［9］。CYP酶的遺傳多樣性是該方法的理論基礎(chǔ)。?zdemir等［10］認(rèn)為，CYP3A活性在個體之間的差異，其差異60%～90%是由于基因突變造成的。遺傳多態(tài)性改變酶的表型可能導(dǎo)致藥物代謝在不同個體間的差異。但是由于個體代謝酶基因的變異發(fā)生頻率較低，而且很多變異是非特征性的且基因型檢測費用高，只能定性不能定量等原因都限制了該方法的實際應(yīng)用。

(2)免疫印跡法 蛋白免疫印跡法是分子生物學(xué)中常用的檢測蛋白質(zhì)表達活性的方法。Fradette等［11］用該方法比較了在中度缺氧和空白組中CYP亞型蛋白的表達活性。免疫印跡法需要制備各個亞型的蛋白單體和該蛋白單體的單克隆抗體。該方法只能定性或半定量地說明酶活性蛋白表達的變化，而不能定量說明酶活性的改變程度，可以作為檢測P450酶活性的輔助方法。

(3)探針?biāo)幬锓?表1) 即某些經(jīng)CYP代謝的藥物，以其代謝物和原型藥的比例或速率衡量代謝能力變化的方法。探針?biāo)幬锓ㄖ苯涌疾炝怂幬锎x的酶活性(表現(xiàn)型)，不僅考慮了基因而且還考慮了環(huán)境等其他因素對代謝酶活性的影響。但是，單一探針只能用于一種同工酶的測定，而且個體間變異較大。所以，為此“雞尾酒”(Cocktail)探針?biāo)幬锓ㄖ饾u興起來。該方法通過同時給予多種相對低劑量的探針?biāo)幬?，測定樣本中每個探針?biāo)幬锏拇x率或產(chǎn)物的生成量等指標(biāo)，以期獲得多個代謝酶的表型信息［12］，“Cocktail”法最重要的優(yōu)點在于可以在一次實驗中完成多個代謝酶的評價，并且可以評價多種藥物在體內(nèi)的相互作用。如Schellens等［13］的研究中使用尼非地平、美芬妥英和司巴丁構(gòu)成的“Cocktail”探針，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，服用奎尼丁后司巴丁和尼非地平的代謝被明顯地抑制，推斷這種抑制作用主要是由于共同的藥物代謝酶參與而引起的。

表1 細(xì)胞色素P450(CYP)酶主要亞型的常用探針?biāo)幬锛捌浯x產(chǎn)物

探針?biāo)幬锓ǖ挠行?yīng)用需要借助高通量和精確的分析手段，目前常用的是高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS)等方法檢測哺乳動物探針?biāo)幬镌谘逯械拇x率或清除率。王丹等［14］用HPLC-MS/MS的方法同時測定了6種探針?biāo)幬锏拇x率并建立了快速評價CYP同工酶活性的方法。HPLC-MS/MS方法穩(wěn)定，具有較高的靈敏度和分辨率，在探針?biāo)幬锏臋z測方面具有很大的應(yīng)用潛力。

3 高原環(huán)境對細(xì)胞色素P450酶系的影響

3.1 急性缺氧對肝生物轉(zhuǎn)化外源物能力的影響

目前已有多種方法考察了急性缺氧對肝生物轉(zhuǎn)化外源物能力的影響。當(dāng)動脈血氧分壓(arterial partial pressure of oxygen，PaO2)降低時，大鼠肝中環(huán)己巴比妥代謝率下降。PaO2的急性降低造成了環(huán)己巴比妥代謝的急劇減少，相當(dāng)于吸入一氧化碳后血紅蛋白脫飽和。小鼠連續(xù)5 d暴露在5500 m的高海拔環(huán)境下，腦中的環(huán)己烯巴比妥水平和環(huán)己巴比妥睡眠時間減少。這些動物表現(xiàn)出微粒體部分催化能力的增加，氯苯唑胺(zoxazolamine)和巴比妥的在體研究也得出類似的結(jié)果［15］。相反，模擬5500 m海拔高原低氧環(huán)境，飼養(yǎng)大鼠3個月，其CYP的總量減少，肝組織勻漿的抗氧化酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶同樣減少［16］。這些實驗表明，缺氧改變了一些外源性物質(zhì)的動力學(xué)，但沒有給出足夠證據(jù)說明其改變的原因。

3.2 缺氧環(huán)境下通過細(xì)胞色素P450酶催化的藥物代謝動力學(xué)的變化

近期研究通過動物體內(nèi)模型闡明血氧不足對CYP活性的影響。將家兔置于低濃度氧環(huán)境中9.5 h，使PaO2穩(wěn)定于50 mmHg附近，茶堿的清除率從 1.57±0.05下降到(1.16 ±0.09)ml·min-1·kg-1(P ＜0.05)。有趣的是，高碳酸血癥酸中毒(PaCO2≈57 mmHg，pH≈7.25)使茶堿的清除率降低為(1.21 ±0.12)ml·min-1·kg-1，但代謝性酸中毒(pH≈7.26)沒有這種現(xiàn)象。低氧血癥和高碳酸血癥結(jié)合可進一步降低茶堿的清除率達到(1.13 ±0.05)ml·min-1·kg-1。大鼠間歇性缺氧也降低了茶堿的清除率［17］。

在體實驗中，以呼吸室內(nèi)空氣的家兔作為對照組，急性中度低氧血癥〔PaO2=(51±1)mmHg〕，高碳酸血癥〔PaCO2=(68±1)mmHg〕，或低氧血癥和高碳酸血癥相結(jié)合〔PaO2=(53±1)和PaCO2=(61±1)mmHg〕組沒有改變注射利多卡因的清除率。此外，清醒的比格犬在8%FiO2的環(huán)境中生存6 d，保持PaO2為45 mmHg，雖然引起血漿中單乙基甘油二甲基苯胺和甘氨酸二甲代苯胺濃度增加，但利多卡因的清除率沒有改變。利多卡因通過CYP3A4，CYP1A2，和CYP2C9進行N-脫乙基形成單乙基甘油二甲基苯胺，3-羥基化生成3-OH-利多卡因催化幾乎完全由CYP1A2完成，CYP3A4只有極少部分參與［18-19］。

3.3 缺氧環(huán)境對細(xì)胞色素CYP450酶活性的影響

用家兔進行在體實驗，評價急性中度低氧血癥(PaO2=48 mmHg)，高碳酸血癥(PaCO2=65 mmHg)或低氧血癥和高碳酸血癥相結(jié)合(PaO2=51 mmHg和PaCO2=72 mmHg)對苯妥英動力學(xué)的影響。雖然其他實驗條件并沒有改變苯妥英藥代動力學(xué)，但低氧血癥使苯妥英的清除率減少了50%［20］。苯妥英的生物轉(zhuǎn)化主要由CYP2C9和較少部分的CYP2C19 催化［21］。

家兔急性中度缺氧(PaO2=50 mmHg)減少了丙泊酚(異丙酚)的清除率。值得注意的是，在離體實驗中，低氧血癥影響肝組織勻漿中丙泊酚的生物轉(zhuǎn)化，但在肺組織勻漿中沒有影響［22］。丙泊酚生物轉(zhuǎn)化的主要途徑是經(jīng)尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶LA9亞型轉(zhuǎn)化成葡萄糖醛酸。丙泊酚也會由一些CYP亞型催化進行環(huán)羥基化反應(yīng)，例如:CYP2B6催化生成 4-羥基-異丙酚的能力類似于 CYP2C9，比 CYP1A2、CYP2A6、CYP2C19、CYP2D6和 CYP3A4的催化能力大 4至10 倍［23-24］。

目前關(guān)于高原環(huán)境的動物實驗主要是在高壓氧艙中模擬高原缺氧的條件下進行的。Proulx等［25］在1995年報道了家兔急性缺氧8 h后，CYP酶的含量降低而CYP酶的活性沒有變化，24 h后酶的含量和活性都降低，提示高原低氧環(huán)境可能降低CYP酶的代謝活性，但是與時間有關(guān)，在較短時間內(nèi)酶的活性沒有明顯變化可能因為動物體內(nèi)存在代償性反應(yīng)。在高海拔慢性缺氧狀態(tài)下，CYP2C9和CYP2C19的蛋白表達無影響，而高海拔急性缺氧使CYP2C19活性顯著升高［26］。在中度缺氧的條件下，雄兔肝微粒體酶的代謝活性也發(fā)生改變。實驗表明，CYP1A1、CYP1A2、CYP2B4、CYP2C5和CYP2C16的活性降低，CYP3A6的活性增強。由于肝CYP酶對藥物進行生物轉(zhuǎn)化是一個耗氧的過程，所以，有研究人員推斷在缺氧期間，肝代謝轉(zhuǎn)化藥物的能力是受到抑制。動物實驗結(jié)果顯示，缺氧對CYP酶的催化活性和水平結(jié)果有爭議。有些研究表明降低活性，而有些報道稱增加或保持不變，甚至一些其他動物實驗顯示了雙向結(jié)果，提示對CYP酶的影響依賴于缺氧時間或缺氧程度。2002年，Jürgens等［27］第一次做了關(guān)于高原對藥物介導(dǎo)的CYP酶活性的影響的人體試驗，通過高效液相色譜法測定探針?biāo)幬锏那宄士疾炝巳梭w重要的幾種CYP酶亞型。其中CYP2D6和CYP3A4的活性稍有減少，回到平原后活性升高，而CYP1A2和CYP2C19可能有所增加，但變化無統(tǒng)計學(xué)意義。2009年，李向陽等［28-29］報道了有關(guān)中國人急進高原的藥代動力學(xué)，由平原急進高原(3780 m)的志愿者和常駐高原的志愿者之間磺胺甲噁唑的藥代動力學(xué)有明顯差異?；前芳讎f唑是CYP2C8的探針?biāo)幬?，可以為CYP2C8活性的研究提供參考。De Bock等［30］首次在體外將探針?biāo)幬锱c大鼠肝微粒體細(xì)胞共孵育，并用 HPLC-MS/MS的方法定量檢測了CYP1A2、CYP2D6、CYP2E1 和 CYP2C9 的活性:0.25 g·L-1的微粒體蛋白，孵育15 min后，CYP1A2、CYP2E1和CYP2C9的催化活性分別為776.22，1290.18，725.59 和 381.48 nmol·g-1·min-1。

綜合考慮，動物研究表明，急性中度缺氧(PaO2≈45 mmHg)通過 CYP1A、CYP2A、CYP2B、CYP2C 和 CYP2E亞型對外源性化學(xué)物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化清除率產(chǎn)生影響。外源性化學(xué)物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化主要由CYP2D和CYP3A催化可能不會受到缺氧影響。人體試驗觀察到，實驗性低氧血癥中葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶，磺基轉(zhuǎn)移酶和N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶的活性不會降低。

3.4 高原環(huán)境對P450酶的調(diào)節(jié)作用的機制

對于高原環(huán)境對CYP酶的調(diào)節(jié)作用的機制研究，現(xiàn)在還處于探索階段，尚無明確的根據(jù)。有報道稱［31］血漿介質(zhì)中對 CYP亞基起下調(diào)作用的是干擾素-γ，白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-2。促紅細(xì)胞生成素也參與增加CYP酶的活性和增強CYP3A4的表達。低氧誘導(dǎo)因子-1是目前研究較多的關(guān)于高原低氧的細(xì)胞調(diào)節(jié)因子。低氧誘導(dǎo)因子-1作為低氧應(yīng)答時基因表達和恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的凋節(jié)中心，可以穩(wěn)定地表達并調(diào)控一系列低氧相關(guān)基因，低氧誘導(dǎo)因子-1可以與 CYP3A6的啟動子結(jié)合，反式激活CYP3A6的基因并誘導(dǎo)基因表達［32］。胎兒在母體內(nèi)類似于缺氧環(huán)境，有研究證明，低氧誘導(dǎo)因子-1α在胎兒體內(nèi)對CYP3A基因的表達機制與成年人不同［33］。目前，已知的高原低氧適應(yīng)人群有3類:① 南美安第斯山的印第安人;②喜馬拉雅山的藏族人;③非洲埃塞俄比亞人。我國科學(xué)家與國外研究機構(gòu)聯(lián)合對世居藏族人群的基因組進行測序。結(jié)果表明，藏族人群存在高原適應(yīng)相關(guān)的候選基因。該研究成果在基因水平上闡明了人體在高原環(huán)境長期適應(yīng)過程中的調(diào)控結(jié)果，其中有關(guān)CYP17A1及CYP2E1等與CYP酶的相關(guān)基因的適應(yīng)性突變可能成為藏族人群對高原環(huán)境適應(yīng)性的基因憑證［34-35］。但相關(guān)基因單核苷酸多態(tài)性的改變與基因表達的聯(lián)系，以及表達調(diào)控的機制研究尚不多見，尤其是突變基因的表達是否會對藥物代謝的相關(guān)酶系產(chǎn)生影響未見報道，具有較大的研究空間。

4 展望

20世紀(jì)70年代以后，高原醫(yī)學(xué)和藥理學(xué)開始發(fā)展起來，前期主要集中在高原反應(yīng)和高原疾病起因的描述，隨著對高原環(huán)境的了解加深，高原低氧對藥物代謝的影響等方面的研究逐漸展開。雖然在高原CYP和代謝機制方面的研究取得了一定的進展，但仍有著很大的研究前景:①前期的研究主要集中在大鼠、家兔等哺乳動物在低壓氧艙下的模擬實驗，而動物與人的藥物代謝仍有較大區(qū)別，低壓氧艙也缺乏考慮高原寒冷、輻射、晝夜溫差大等自然環(huán)境因素，近些年來人們已經(jīng)開始重視以世居高原人群和急進高原人群作為研究對象，但仍缺乏有力實驗支持。② 目前酶活性的檢測方法多采用高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用等，定量考察探針?biāo)幬锝?jīng)過某種酶代謝后的代謝產(chǎn)物，但該法對儀器水平要求較高，有文獻報道可以采用多種CYP酶特異性底物與微粒體蛋白共孵育的方法同時檢測多個底物的代謝產(chǎn)物，該方法雖然條件并不完善，但簡單，可靠，具有較好的推廣價值。③ 前期的研究工作主要集中在生理學(xué)和藥理學(xué)水平上，綜合細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，可以在細(xì)胞傳導(dǎo)和基因調(diào)控水平上，深入探討CYP酶在高原環(huán)境下的代謝機制。

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