多肽和蛋白質(zhì)藥物口服吸收機(jī)制及策略的研究進(jìn)展

張文平，楊久春，呂正兵，陶 雷，陳 潔

(1.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)所，浙江杭州 310018;2.黑龍江迪龍制藥有限公司，黑龍江安達(dá) 151400)

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，很多活性多肽和蛋白質(zhì)被開(kāi)發(fā)成藥物并應(yīng)用于臨床。與化學(xué)藥物相比，多肽和蛋白質(zhì)藥物(peptide and protein drugs，PPD)具有作用靶點(diǎn)專一、不良反應(yīng)少以及藥效作用強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，故在現(xiàn)代疾病的預(yù)防和治療中的應(yīng)用日益廣泛;但多肽和蛋白質(zhì)由于分子量大、結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜和理化性質(zhì)特殊，機(jī)體對(duì)其產(chǎn)生了多種屏障，如酸屏障、酶屏障和膜屏障，限制了這類藥物的口服吸收［1－2］。目前，上市的PPD常規(guī)給藥途徑多以注射為主。PPD口服給藥是一種方便且提高患者依從性的給藥方式，自20世紀(jì)90年代以來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)這一領(lǐng)域的研究非常活躍。克服PPD的口服給藥技術(shù)難題，將會(huì)給生物制藥工業(yè)帶來(lái)巨大變化并造福人類。本文從PPD口服的認(rèn)識(shí)過(guò)程、吸收機(jī)制、影響因素及提高策略等方面進(jìn)行了綜述。

1 多肽和蛋白質(zhì)藥物認(rèn)識(shí)過(guò)程

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)迅猛發(fā)展，多肽或蛋白質(zhì)不斷被開(kāi)發(fā)成藥品，以紅細(xì)胞生成素、干擾素和胰島素為代表的近百種PPD已經(jīng)在臨床應(yīng)用。1982年，世界第一個(gè)基因工程產(chǎn)品人胰島素上市;1992年，我國(guó)第一個(gè)基因工程產(chǎn)品干擾素α1b上市［1］。但上述PPD在臨床上只有通過(guò)im，iv或sc給藥才能產(chǎn)生治療作用，藥物學(xué)家一直致力于PPD口服制劑研究。

關(guān)于PPD口服吸收，過(guò)去人們一直認(rèn)為蛋白質(zhì)經(jīng)胃腸道酶降解后以氨基酸形式被吸收，后來(lái)發(fā)現(xiàn)其消化產(chǎn)物主要是多肽如二肽和三肽等。20世紀(jì)90年代，對(duì)PPD口服吸收有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，PPD可通過(guò)液相或受體介導(dǎo)的胞飲作用方式吸收入血，對(duì)于12個(gè)以下氨基酸組成的多肽，實(shí)現(xiàn)口服給藥的可能性很大，而對(duì)于蛋白質(zhì)，則難以預(yù)料。但是，多學(xué)科的合作為PPD口服制劑的成功開(kāi)發(fā)提供了機(jī)遇。

進(jìn)入21世紀(jì)，對(duì)PPD口服吸收機(jī)制又有了新的認(rèn)識(shí)，發(fā)現(xiàn)一些多肽可通過(guò)腸多肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)吸收入血，拓展了PPD吸收途徑［3］。逐漸意識(shí)到要成功開(kāi)發(fā)PPD口服制劑，必須解決酶屏障和膜屏障兩個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題［4］，利用納米材料、脂質(zhì)體和酶抑制劑等技術(shù)，完全可能在不久的將來(lái)攻克這一難題［5－7］。

2 多肽和蛋白質(zhì)藥物口服吸收的機(jī)制及途徑

2.1 載體轉(zhuǎn)運(yùn)

小分子藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)以簡(jiǎn)單擴(kuò)散為主，而PPD口服給藥經(jīng)過(guò)胃腸道主要依靠載體轉(zhuǎn)運(yùn)介導(dǎo)通過(guò)細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)至小腸黏膜內(nèi)［8］，如圖1所示，隨后PPD由淋巴回流進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)。未被消化酶降解的多肽與腸表面膜基底外側(cè)的H+依賴型多肽載體結(jié)合，以H+梯度和膜電位差為動(dòng)力，經(jīng)多肽載體轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入基底膜內(nèi)側(cè)，由于H+與多肽是共同通過(guò)上皮細(xì)胞膜的，這一系統(tǒng)又稱為H+-依賴型腸多肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)［3］。

圖1 治療用多肽與蛋白質(zhì)藥物分布機(jī)制:載體轉(zhuǎn)運(yùn)的作用超過(guò)簡(jiǎn)單擴(kuò)散［8］.

2.2 胞飲作用和M細(xì)胞途徑

當(dāng)PPD與小腸黏膜刷狀緣膜的受體結(jié)合后，結(jié)合部位膜內(nèi)陷并形成吞噬體而進(jìn)入小腸壁(圖2)，可將40 ku大小的完整蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)［9］，但有很少一部分PPD通過(guò)胞飲作用從血管外轉(zhuǎn)運(yùn)到小腸上皮細(xì)胞內(nèi)。

圖2 多肽和蛋白質(zhì)藥物分子通過(guò)胞飲從血管外進(jìn)入小腸細(xì)胞［9］.

PPD通過(guò)胞飲作用進(jìn)入小腸上皮細(xì)胞，最典型的例子就是通過(guò)M細(xì)胞途徑(圖3)，M細(xì)胞是一種位于腸集合淋巴結(jié)上的微皺褶細(xì)胞，含有M細(xì)胞小囊和派伊爾淋巴集結(jié)［10］，M細(xì)胞表面能吸附顆粒，它可將完整的抗原蛋白或病毒分子經(jīng)胞吞、胞吐途徑吸收并呈遞給黏膜下免疫細(xì)胞［3］。

圖3 腸淋巴微皺褶細(xì)胞(M細(xì)胞)吞噬顆粒的原理圖.相互間隔的M細(xì)胞與柱細(xì)胞(A)都含有細(xì)胞核(N)。位于M細(xì)胞表面的顆粒(P)→M細(xì)胞的囊泡→派伊爾淋巴集結(jié)(D)［10］.

2.3 細(xì)胞旁路

如圖4所示，PPD可以經(jīng)過(guò)細(xì)胞旁路被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，不需要消耗能量，依靠腸上皮細(xì)胞兩側(cè)的藥物濃度、電化學(xué)勢(shì)的差別形成的。阻礙PPD經(jīng)細(xì)胞旁路入血的是小腸上皮細(xì)胞之間的緊密連接或閉合帶，但是，餐后在腸腔葡萄糖刺激下，腸黏膜細(xì)胞骨架收縮，緊密連接暫時(shí)開(kāi)放，某些相對(duì)分子質(zhì)量為0.9～1.9 ku的 PPD 可經(jīng)此途徑吸收入血［11］。

圖4 多肽和蛋白質(zhì)藥物通過(guò)細(xì)胞旁路(A)和跨細(xì)胞途徑(B)進(jìn)入血液［11］.

3 影響多肽和蛋白質(zhì)藥物口服吸收的因素

3.1 相對(duì)分子質(zhì)量

由于PPD相對(duì)分子質(zhì)量大，人的小腸黏膜細(xì)胞間隙為5 nm，一般情況下難以透過(guò)小腸上皮以簡(jiǎn)單擴(kuò)散的方式轉(zhuǎn)運(yùn)入血。小鼠的腸黏膜孔徑約0.4 nm，氨基酸、二肽和三肽可以穿過(guò)腸壁，多肽和蛋白質(zhì)則難以通過(guò)［1］。

3.2 空間結(jié)構(gòu)

影響PPD活性的因素主要是氨基酸序列、末端基團(tuán)、肽鏈和二硫鍵及其空間結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)和多肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)在體外穿過(guò)人結(jié)腸癌細(xì)胞的分子層中發(fā)揮了重要作用，這是由于蛋白質(zhì)的部分展開(kāi)，使疏水部分暴露，可以穿過(guò)液態(tài)脂質(zhì)雙分子層。

3.3 理化性質(zhì)

蛋白質(zhì)是一種親水性高分子化合物，決定了它既不能通過(guò)細(xì)胞間隙簡(jiǎn)單擴(kuò)散，也難以與細(xì)胞膜融合，如果不借助載體則很難通過(guò)小腸黏膜入血，因此生物利用度較低［1］。

3.4 酸屏障、酶屏障和膜屏障

(1)酸屏障 由于大多數(shù)多肽和蛋白質(zhì)不耐酸，胃酸的pH值為1～3，當(dāng)PPD通過(guò)胃時(shí)，一部分藥物被水解失去生物活性，而且整個(gè)腸道pH環(huán)境復(fù)雜多變，一些多肽還容易發(fā)生pH依賴性水解［2，12］，這成為PPD口服吸收的第一道屏障難以逾越。

(2)酶屏障 胃腸道含有，如多種消化酶，主要包括:①腔道分泌的酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶等;② 刷狀緣分泌的酶，如羧肽酶、氨肽酶、肽鏈內(nèi)切酶和外切酶等，酶消化作用是導(dǎo)致PPD降解的主要原因［13］，這是PPD口服吸收的第二道屏障。

(3)膜屏障 首先小腸的上皮細(xì)胞附著一層水合凝膠，稱為不流動(dòng)水層，其下方是磷脂表面活性層，疏水性強(qiáng)，阻礙了PPD等親水性分子向上皮細(xì)胞的擴(kuò)散。其次，小腸上皮細(xì)胞膜的磷脂雙分子層具有半透膜性質(zhì)，允許脂溶性藥物被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，而PPD等大分子以及親水性藥物需要通過(guò)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)才能跨膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)［14］。最后，阻止PPD口服吸收的主要屏障是致密的腸上皮細(xì)胞膜，因?yàn)樾∧c細(xì)胞間隙僅為5 nm，在不加任何促吸收劑的情況下，只有分子量小的藥物才能通過(guò)?？傊?，小腸黏膜特殊的組成和結(jié)構(gòu)是PPD口服吸收的第三道屏障［2］。

3.5 首過(guò)效應(yīng)

有些從胃腸道吸收入門靜脈系統(tǒng)的藥物進(jìn)入肝后被肝藥物代謝酶代謝，具有首過(guò)效應(yīng)。腸道的刷狀緣、腸內(nèi)皮細(xì)胞溶酶體同樣參與首過(guò)效應(yīng)。膽汁內(nèi)容物也有一定的作用，包括水解、氧化、脫烷基化和還原等。一部分藥物被這些酶代謝，從而使藥物進(jìn)入血液循環(huán)的有效量減少，故首過(guò)效應(yīng)是導(dǎo)致PPD口服生物利用度低的原因之一［1］。

4 提高多肽和蛋白質(zhì)藥物口服吸收的策略

4.1 化學(xué)修飾

通過(guò)對(duì)PPD進(jìn)行化學(xué)修飾形成前藥或衍生物，可以保護(hù)PPD免受蛋白酶等消化酶的降解作用，對(duì)PPD的結(jié)構(gòu)修飾一般要考慮親脂性、電荷數(shù)、等電點(diǎn)、化學(xué)穩(wěn)定性以及對(duì)載體的親和力等［2］。例如，酯化反應(yīng)可將多肽或蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)以共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵結(jié)合起來(lái)，從而提高PPD的親脂性，但酯化反應(yīng)可能會(huì)降低PPD的生物活性，最近研發(fā)的一種可逆酯化反應(yīng)技術(shù)可保證酯化的PPD經(jīng)口服后再生恢復(fù)其生物活性，已有幾種PPD經(jīng)過(guò)這種技術(shù)改造后，提高其在胃腸道的吸收程度、穩(wěn)定性及生物活性。聚乙二醇共軛修飾不僅提高PPD脂溶性并且有防止酶解的作用。美國(guó)Nobex公司通過(guò)親水性聚乙二醇鏈和親脂性烷基鏈在賴氨酸-29位點(diǎn)上對(duì)人重組胰島素進(jìn)行共價(jià)修飾，臨床試驗(yàn)證明可以治療1型和2型糖尿病，生物利用度為5%［15］。

4.2 吸收促進(jìn)劑

吸收促進(jìn)劑是一類可逆性增強(qiáng)藥物胃腸道透過(guò)性的小分子化合物，是提高生物膜通透性的主要方法。吸收促進(jìn)劑可以非特異性地暫時(shí)打破小腸屏障、改變細(xì)胞緊密連接的完整性及擴(kuò)大細(xì)胞間隙［16］，或者通過(guò)干擾膜磷脂雙分子層穩(wěn)定性使其形成小孔，從而提高生物膜通透性，增強(qiáng)PPD等藥物經(jīng)胃腸道吸收入血。傳統(tǒng)的吸收促進(jìn)劑如膽酸鹽類、表面活性劑、水楊酸類、氨基酸類衍生物和金屬螯合劑等長(zhǎng)期使用后具有一定的不良反應(yīng)，制約其應(yīng)用。

近年研制的一些不良反應(yīng)小的新型吸收促進(jìn)劑，如細(xì)胞膜穿透肽，可以介導(dǎo)藥物分子跨膜進(jìn)入不同組織和細(xì)胞，其富含堿性氨基酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)和螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)穿膜起著重要作用，日本學(xué)者研制基于精氨酸殘基組成的細(xì)胞膜穿透肽促進(jìn)了胰島素經(jīng)鼻黏膜、口服給藥的吸收［17－18］。Petrus等［4］用維生素B12與胰島素制成納米粒，有效地促進(jìn)胰島素口服吸收。

4.3 酶抑制劑

酶抑制劑能夠有效地防止酶對(duì)PPD的降解，研究表明PPD與酶抑制劑聯(lián)合應(yīng)用后，其口服生物利用度顯著提高［2］。

酶抑制劑可分為4類:① 非氨基酸類 P-氨基苯甲酰胺、1，2，3，4-四氫-1-萘甲酸 4-(4-異丙基-1-哌啶羥基)-苯酯甲烷磺醋(FK-448)和甲磺酸卡莫司他(camostat mesylate);②氨基酸類 肽類和修飾肽;③胰凝乳蛋白酶抑制劑、氨肽酶抑制劑、桿菌肽和鎮(zhèn)痛素;④ 肽酶抑制劑 抑肽酶和胰蛋白酶抑制劑［13，16］。應(yīng)用包曼-伯克抑制劑和彈性蛋白酶抑制劑制備殼聚糖降鈣素口服制劑，可以降低其在胃腸道內(nèi)的降解［19］。

4.4 納米粒載體

納米粒是直徑在10～100 nm的超微小藥物載體，可通過(guò)細(xì)胞旁路或腸黏膜派伊爾淋巴集結(jié)的M細(xì)胞吞噬途徑吸收入血［1］，納米粒包裹PPD可以避免胃腸道分泌的酸和消化酶的破壞，載體納米粒粒徑越小，越易吸收，且具有一定靶向性。

制備納米粒的載體材料可分為兩種類型:生物降解型和非生物降解型。有機(jī)體內(nèi)的水解酶可以將生物降解聚合物材料水解成水和二氧化碳，近年來(lái)對(duì)生物降解聚合物材料的研究更為重視，常見(jiàn)的生物降解型納米材料有交鏈聚酯、聚原酸酯、聚酐和多肽等［20］。以研究胰島素口服制劑等為代表的載體納米微粒見(jiàn)表1，其中殼聚糖納米粒在開(kāi)發(fā)口服胰島素用于治療糖尿病取得了一定的成效［12］。

4.5 脂質(zhì)體載體

脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜雙層脂膜結(jié)構(gòu)類似，可通過(guò)腸黏膜細(xì)胞的吸附、脂質(zhì)交換、融合和內(nèi)吞等作用機(jī)制，增強(qiáng)細(xì)胞攝取藥物，特別是促進(jìn)了派伊爾淋巴集結(jié)對(duì)藥物的攝取。而且，脂質(zhì)體保護(hù)PPD等藥物免受胃腸道酶的降解，起到緩釋作用，延長(zhǎng)半衰期［7］。Kv 等［22］等制備沙雷菌肽酶(serrationpeptidase)脂質(zhì)體并以Caco-2細(xì)胞模型研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體劑型比原藥有更好的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)效果。Hanato等［23］制備的胰高血糖素樣多肽脂質(zhì)體在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中具有良好的降血糖作用。但是，脂質(zhì)體用于PPD載體存在兩個(gè)問(wèn)題:①脂質(zhì)體在制備過(guò)程中，PPD的包封率較低;② 脂質(zhì)體的不穩(wěn)定性，因?yàn)槲改c道存在的膽鹽會(huì)破壞脂質(zhì)體的雙分子層結(jié)構(gòu)，使脂質(zhì)流失，導(dǎo)致脂質(zhì)體的穩(wěn)定性比較差［24］。

4.6 微乳載藥

乳劑中的油相可增加PPD的膜通透性、也可能增加藥物的淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)，從而提高生物利用度［1］。早在1997年Cortecs公司就開(kāi)發(fā)了胰島素油制劑，通過(guò)兩親性表面活性劑的作用，將親水性藥物如胰島素、降鈣素等增溶至弱極性的油中形成澄清透明的溶液，6例健康志愿者口服該制劑后血糖降低34%［25］。國(guó)外已有環(huán)孢素微乳軟膠囊上市，國(guó)內(nèi)也將胰島素制成復(fù)乳，ig給予小鼠后有顯著降血糖作用［1］，北京大學(xué)研制的蚓激酶油包水口服微乳具有較好的可行性［26］。

4.7 定位釋藥

胃腸道存在PPD特異性吸收的位點(diǎn)，如果使PPD在此釋放，可避免各種消化酶的降解作用，最大程度地提高PPD的口服吸收，一般從結(jié)腸和小腸考慮定位釋藥。PPD吸收的最佳部位可能是大腸［1］，因?yàn)樗幬镌诖送Ａ?0～30 h，而且消化酶的活性較低。研究較多的是結(jié)腸定位釋藥，它具有延長(zhǎng)藥物的滯留時(shí)間、降低酶活性和增強(qiáng)吸收促進(jìn)劑的作用等優(yōu)勢(shì)，常用α-淀粉、果膠鈣、殼聚糖、海藻酸、丙烯酸酯偶氮苯水凝膠以及果膠/半乳甘露聚糖等作為包衣材料［27］。小腸的某些區(qū)域存在著與免疫有關(guān)的特定組織區(qū)域，如派伊爾淋巴集結(jié)能使淋巴因子和一些顆粒進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，使用腸溶衣或其他控釋技術(shù)使藥物在小腸釋放，可能增加PPD的吸收。

表1 口服載藥納米顆粒［21］

4.8 基因工程

Page等［28］認(rèn)為基因工程在PPD口服制劑開(kāi)發(fā)方面具有很大潛力，口服基因藥物遞送載體包括病毒載體和合成高分子載體等，如霍亂毒素B亞單位對(duì)GM1神經(jīng)節(jié)苷脂(細(xì)胞膜糖脂類受體)有高度親和力，當(dāng)霍亂毒素B亞單位連接到包裹抗原的脂質(zhì)體表面時(shí)，小鼠口服給藥后，可顯著升高黏膜免疫球蛋白A和免疫球蛋白G水平。有人將熱休克蛋白A和霍亂弧菌封閉小帶毒素兩個(gè)基因進(jìn)行融合，并在大腸桿菌中高效表達(dá)，研制成幽門螺桿菌熱休克蛋白A-霍亂弧菌封閉小帶毒素融合蛋白質(zhì)口服疫苗［1］。

本實(shí)驗(yàn)室采用家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)對(duì)PPD口服給藥做了系列研究，利用基因工程改造功能基因并在家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)一些用于口服的重組蛋白如霍亂毒素B亞單位-重組人胰島素、重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、重組人乳鐵蛋白、重組人生長(zhǎng)激素、重組人破骨細(xì)胞形成抑制因子和口服基因工程疫苗等［29－33］。Gong等［31］構(gòu)建霍亂毒素B亞單位人胰島素融合基因，利用家蠶桿狀病毒高效表達(dá)霍亂毒素B亞單位-重組人胰島素融合蛋白，ig給予非肥胖型糖尿病小鼠后抑制了胰島炎癥和糖尿病病理癥狀的發(fā)生;Meng等［34］在家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)里成功表達(dá)了霍亂毒素B亞單位-重組人胰島素-綠色熒光蛋白融合蛋白，對(duì)該融合蛋白經(jīng)小腸黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程進(jìn)行追蹤，發(fā)現(xiàn)其ig給予10周齡的非肥胖型糖尿病小鼠后，產(chǎn)生了特異性抗體，并且誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的產(chǎn)生，延緩1型糖尿病的發(fā)作，改善其癥狀。目前，這項(xiàng)利用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)的胰島素口服制劑是一種治療1型糖尿病的新型藥物，現(xiàn)處于中試階段。家蠶生物反應(yīng)器表達(dá)的重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，ig給予小鼠、Beagle犬和獼猴后，具有升高白細(xì)胞作用;健康志愿者口服后其生物利用度平均為1%［29］，現(xiàn)處于Ⅱ期臨床研究階段。Liu等［33］在家蠶細(xì)胞中表達(dá)重組人乳鐵蛋白，表達(dá)量約為13.5 mg·L－1，小鼠ig給藥后，可有效緩解葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎癥狀。

5 展望

自從1982年世界第一個(gè)基因工程產(chǎn)品人胰島素問(wèn)世以來(lái)，大量的PPD就被開(kāi)發(fā)并應(yīng)用于臨床。2010年全球最暢銷、銷售額達(dá)到50億美元以上的12種藥品中，有6種為生物制劑。截止2011年6月，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局已批準(zhǔn)包括重組細(xì)胞因子、融合蛋白和基因工程疫苗等各類上市生物技術(shù)藥物39種，并有超過(guò)120種后選藥物處于不同臨床研究階段，盡管口服PPD所占比例很少，但是已經(jīng)取得很大進(jìn)展。由于PPD口服制劑產(chǎn)品技術(shù)含量及附加值高，患者耐受性好，因此其應(yīng)用前景廣泛，國(guó)內(nèi)外很多制藥公司、研究機(jī)構(gòu)正加快對(duì)PPD口服制劑的研發(fā)，PPD口服制劑已成為醫(yī)藥工業(yè)發(fā)展的重要方向之一，也是新藥研發(fā)的重點(diǎn)和難點(diǎn)。相信經(jīng)過(guò)多學(xué)科的合作，人類最終會(huì)成功開(kāi)發(fā)PPD口服制劑。

［1］Zhang WP.PhaseⅠ clinical trial of BmrhGM-CSF and absorption mechanism of BmrhGM-CSF by oral administration(BmrhGM-CSF的Ⅰ期臨床試驗(yàn)及其口服吸收機(jī)制)［D］.Hangzhou:Zhejiang University，2010.

［2］Shaji J，Patole V.Protein and peptide drug delivery:oral approaches［J］.Indian J Pharm Sci，2008，70(3):269-277.

［3］Toorisaka E，Watanabe K，Ono H，Hirata M，Kamiya N，Goto M.Intestinal patches with an immobilized solid-in-oil formulation for oral protein delivery［J］.Acta Biomater，2012，8(2):653-658.

［4］Petrus AK，F(xiàn)airchild TJ，Doyle RP.Traveling the vitamin B12pathway:oral delivery of protein and peptide drugs［J］.Angew Chem Int Ed Engl，2009，48(6):1022-1028.

［5］Shen WC.Oral peptide and protein delivery:unfulfilled promises?［J］.Drug Discov Today，2003，8(14):607-608.

［6］Wang XQ，Zhang Q.pH-sensitive polymeric nanoparticles to improve oral bioavailability of peptide/protein drugs and poorly water-soluble drugs［J］.Eur J Pharm Biopharm，2012，82(2):219-229.

［7］Griffin BT，O'Driscoll CM.Opportunities and challenges for oral delivery of hydrophobic versus hydrophilic peptide and protein-like drugs using lipidbased technologies［J］.Ther Deliv，2011，2(12):1633-1653.

［8］Bernd Meibohm.Pharmacokinetic and pharmacodynamic evaluation of biologics:challenges and pitfalls［J］.Chin J Clin Pharmacol Ther(中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué))，2007，12(10):1089-1098.

［9］Reddy ST，Berk DA，Jain RK，Swartz MA.A sensitive in vivo model for quantifying interstitial convective transport of injected macromolecules and nanoparticles［J］.J Appl Physiol，2006，101(4):1162-1169.

［10］Chen H，Langer R.Oral particulate delivery:status and future trends［J］.Adv Drug Deliv Rev，1998，34(2-3):339-350.

［11］T Borchardt R，Jeffrey Aubé，Siahaan TJ，Gangwar S，Pauletti GM.Improvement of oral peptide bioavailability:peptidomimetics and prodrug strategies［J］.Adv Drug Deliv Rev，1997，27(2-3):235-256.

［12］Rekha MR，Sharma CP.Oral delivery of therapeutic protein/peptide for diabetes－future perspectives［J］.Int J Pharm，2013，440(1):48-62.

［13］Bernkop-Schnürch A，Schmitz T.Presystemic metabolism of orally administered peptide drugs and strategies to overcome it［J］.Curr Drug Metab，2007，8(5):509-517.

［14］Maher S，Brayden DJ，F(xiàn)eighery L，McClean S.Cracking the junction:update on the progress of gastrointestinal absorption enhancement in the delivery of poorly absorbed drugs［J］.Crit Rev Ther Drug Carrier Syst，2008，25(2):117-168.

［15］Kipnes M，Dandona P，Tripathy D，Still JG，Kosutic G.Control of postprandial plasma glucose by an oral insulin product(HIM2)in patients with type 2 diabetes［J］.Diabetes Care，2003，26(2):421-426.

［16］Hui EJ，Yin BQ，Li ZF.Research development of oral peptide and protein drugs［J］.Biotechnol Bull(生物技術(shù)通報(bào))，2011，6:21-24.

［17］Khafagy el-S，Morishita M，Ida N，Nishio R，Isowa K，Takayama K.Structural requirements of penetratin absorption enhancement efficiency for insulin delivery［J］.J Control Release，2010，143(3):302-310.

［18］Khafagy el-S，Morishita M，Isowa K，Imai J，Takayama K.Effect of cell-penetrating peptides on the nasal absorption of insulin［J］.J Control Release，2009，133(2):103-108.

［19］Guggi D，Kast CE，Bernkop-Schnürch A.In vivo evaluation of an oral salmon calcitonin-delivery system based on a thiolated chitosan carrier matrix［J］.Pharm Res，2003，20(12):1989-1994.

［20］Wang XL，Tian H，Yao WB.Progress in the study of oral delivery of protein and peptide drugs［J］.Pharm Biotechnol(藥物生物技術(shù))，2011，18(5):445-448.

［21］Morishita M，Peppas NA.Is the oral route possible for peptide and protein drug delivery?［J］.Drug Discov Today，2006，11(19-20):905-910.

［22］KV S， Devi GS， Mathew ST. Liposomal formulations of serratiopeptidase:in vitro studies using PAMPA and Caco-2 models［J］.Mol Pharm，2008，5(1):92-97.

［23］Hanato J，Kuriyama K，Mizumoto T，Debari K，Hatanaka J，Onoue S，et al.Liposomal formulations of glucagon-like peptide-1:improved bioavailability and anti-diabetic effect［J］.Int J Pharm，2009，382(1-2):111-116.

［24］Sarpietro MG，Castelli F.Transfer kinetics from colloidal drug carriers and liposomes to biomembrane models:DSC studies［J］.J Pharm Bioallied Sci，2011，3(1):77-88.

［25］Zhang J，Zhang C，Gao S.The study of oral absorption and delivery systems for peptide drugs［J］.Prog Pharm Sci(藥學(xué)進(jìn)展)，2004，28(10):437-441.

［26］Cheng MB，Jin W，Wang JC，Chen DW，Zhang Q.Preparation and in vitro characterization of oral microemulsions containing earthworm fibrinolytic enzyme［J］.Chin J New Drugs(中國(guó)新藥雜志)，2009，18(1):78-83.

［27］Kumar P， Mishra B. Colon targeted drug delivery systems－an overview［J］.Curr Drug Deliv，2008，5(3):186-198.

［28］Page DT，Cudmore S.Innovations in oral gene delivery:challenges and potentials［J］.Drug Discov Today，2001，6(2):92-101.

［29］Zhang W，Lv Z，Nie Z，Chen G，Chen J，Sheng Q，et al.Bioavailability of orally administered rhGM-CSF:a single-dose，randomized，open-label，two-period crossover trial［J］.PLoS One，2009，4(5):e5353.

［30］Lan H，Nie Z，Liu Y，Lv Z，Liu Y，Quan Y，Chen J，et al.In vivo bioassay of recombinant human growth hormone synthesized in B.mori pupae［J］.J Biomed Biotechnol，2010，2010:306462.

［31］Gong Z，Jin Y，Zhang Y.Suppression of diabetes in non-obese diabetic(NOD)mice by oral administration of a cholera toxin B subunit-insulin B chain fusion protein vaccine produced in silkworm［J］.Vaccine，2007，25(8):1444-1451.

［32］Xiao HL，Zhang YZ，Wu XF.Oral administration activity determination of recombinant osteoprotegerin from silkworm larvae［J］.Mol Biotechnol，2007，35(2):179-184.

［33］Liu T，Zhang YZ，Wu XF.High level expression of functionally active human lactoferrin in silkworm larvae［J］.J Biotechnol，2005，118(3):246-256.

［34］Meng Q，Wang W，Shi X，Jin Y，Zhang Y.Protection against autoimmune diabetes by silkworm-produced GFP-tagged CTB-insulin fusion protein［J］.Clin Dev Immunol，2011，2011:831704.