實時xCELLigence細胞分析系統(tǒng)在藥物心臟毒性篩選中的應用

王淑顏，汪溪潔，馬 璟

(中國醫(yī)藥工業(yè)研究院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院國家上海新藥安全評價研究中心，上海 201203)

心臟毒性是藥物研發(fā)過程中需重點考慮的風險因素之一，1998-2008年，在美國有33%的藥物因其心臟毒性而被撤市［1］，這不僅給患者的用藥安全帶來極大的風險，也給制藥公司帶來了巨大的經(jīng)濟損失。

實時xCELLigence細胞分析系統(tǒng)(real time xCELLigence analysis system，RTCA)是一種基于電子阻抗的實時細胞檢測系統(tǒng)，通過細胞與檢測板底部電極的相互作用，可在近似生理環(huán)境下連續(xù)幾天至幾周實時、無標記、非侵入性動態(tài)地記錄細胞增殖、細胞毒性和細胞形態(tài)的變化，為全面了解細胞的活性和運動性提供了一個更加精確、敏感的檢測平臺，可在新藥研發(fā)的早期，合成出少量先導化合物階段進行心臟毒性的評價，具有良好的應用前景。本文對RTCA的基本原理和其在藥物心臟毒性篩選中的應用作一綜述。

1 實時細胞分析系統(tǒng)的基本原理

RTCA是一種基于非標記性、非侵入性、動態(tài)實時細胞分析檢測技術(shù)。1984年，Giaever和Keese［2］首次報道了利用電子阻抗技術(shù)無標記地檢測細胞反應。在過去的20多年里，許多報道描述了使用此技術(shù)來監(jiān)測細胞活動，包括細胞的黏附、傳播和活化［3］，細胞形態(tài)和由多種因素造成的形態(tài)改變［4-5］，細胞遷徙［6］和細胞對毒性化合物的反應［7-8］，此技術(shù)在細胞生物領(lǐng)域得到了廣泛的應用。如Kustermann等［9］運用RTCA監(jiān)測NIH3T3小鼠成纖維細胞的毒性和增殖能力，來鑒別細胞抑制劑、細胞毒藥物和非毒性藥物。Irelan等［10］利用此技術(shù)定量的檢測細胞的質(zhì)量特性及功能，Ke等［11］監(jiān)測HeLa細胞的生存能力等。2011年，由美國艾森生物和羅氏共同推出了xCELLigence RTCA Cardio(以下簡稱Cardio)，它可以記錄體外培養(yǎng)的心肌細胞搏動的頻率、節(jié)律、振幅、搏動持續(xù)時間以及搏動頻率的不規(guī)則指數(shù)等指標。對藥物引起的心肌細胞毒性有了更全面的認識，這種新的研究手段，用特征性的心肌細胞搏動圖譜反映心律失常，這是傳統(tǒng)電生理學研究方法所不能實現(xiàn)的。

RTCA由4部分組成，即電子微量滴定板、細胞實時監(jiān)測阻抗記錄單元、實時細胞分析單元和實時細胞數(shù)據(jù)處理及阻抗轉(zhuǎn)換為細胞指數(shù)單位［12-14］。該系統(tǒng)將微電極細胞傳感器芯片整合到表面適于細胞貼附與生長檢測板的底部。微電極阻抗主要是由點及周邊離子環(huán)境所決定，當電場加在上面時即可測得一個基線阻抗。細胞的有無以及貼壁程度的改變都會影響電極傳感器表面電子和離子的通過。無細胞時，檢測孔底部排列的微電極陣列的阻抗分布近似均勻;加入細胞后，細胞和電極表面接觸黏附，影響電極溶液間的離子環(huán)境，導致阻抗的升高，細胞越多，阻抗增加越高，這種阻抗的變化即可通過算法換算成細胞指數(shù)表示。細胞在上述表面上的貼壁或生長可引起各個陣列的電極結(jié)構(gòu)的阻抗變化，細胞貼壁程度緊密與否也會使電阻抗發(fā)生變化。因此，黏附在電極表面的細胞越多，細胞指數(shù)越大(圖1)。同樣，細胞與電極表面黏附越緊密伸展，電阻抗增加越大。測得的電極間的阻抗反映關(guān)于電極上細胞生物狀態(tài)的重要信息。當細胞的生物狀態(tài)發(fā)生變化時，系統(tǒng)即可實時并自動獲取模擬電信號，并轉(zhuǎn)變成數(shù)字信號進行進一步分析。因此，電阻抗即為細胞指數(shù)值，反映細胞生長、伸展、形態(tài)變化、死亡和貼壁程度等一系列生理狀態(tài)［15］。

圖1 實時細胞分析系統(tǒng)(RTCA)原理圖.

基于上述原理，將心肌細胞接種于含有微電極的培養(yǎng)板上，當心肌收縮和舒張時，引起阻抗變化，將阻抗變化換算成細胞指數(shù)，在10 kHz時，細胞指數(shù) =(樣本阻抗-基線阻抗)/15，即可觀察心肌細胞搏動頻率、節(jié)律幅度以及活性的變化。Cardio將所得的數(shù)據(jù)應用軟件分析系統(tǒng)分析其心率變異性(heart rate variability，HRV)。HRV 的 Poincaréplots是以RR間期序列{RRi}(i=1，2，……，N)中的相鄰兩點(RRi，RRi+1)為坐標在圖中用散點標記出逐拍心跳。大量的散點形成一個相對密集的散點區(qū)域，其不同形態(tài)反映了不同的心率變異信息［16］。通常情況下，Poincaréplots所用的3個指數(shù)為:SD1，即短軸表示RR間期短時變化的標準差;SD2，即長軸表示RR間期長時變化的標準差;R，即軸率(R=SD1/SD2)?？菇M胺類藥物特非那定其潛在的hERG通道阻滯作用，引起QT間期延長，導致尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速(圖2A，B)而被撤出市場。特非那定并不引起明顯的振幅變化(圖2C)，卻引起明顯的搏動幅度的峰值時間的下降(圖2D)所示。給予特非那定0.1μmol·L-1后，和對照組相比，SD1 由12.6 下降到6.2 ms，SD2 由101.5 下降到49.4 ms;而給予特非那定10μmol·L-1后，SD1和SD2分別增長到21.2和172.9 ms(圖2E)。通過以上指數(shù)證實，高濃度的特非那定使人誘導性多能干細胞誘導心肌細胞(human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte，hiPSC-CM)的搏動信號極其不規(guī)則［17］。由此可見，Cardio可以檢測潛在的QT間期延長、心臟沖動形成和傳導異常導致的心律失常，預測藥物對心肌細胞潛在的毒性。

2 實時細胞分析系統(tǒng)在藥物心臟毒性篩選中的應用

心律失常是藥物導致心臟毒性的主要原因，由于心肌細胞膜上鈉、鉀、鈣離子的定向性和選擇性運動產(chǎn)生電荷、協(xié)調(diào)心肌細胞的收縮，所以，任何干擾這些離子通道的藥物均有可能導致心律異常［18］。傳統(tǒng)的電生理學研究方法操作復雜，不能對心肌細胞進行長時間持續(xù)性的動態(tài)監(jiān)測，且對非離子通道藥物可能引起的心臟毒性無法監(jiān)測;而體內(nèi)動物實驗成本高、周期長、工作量大以及需用的化合物量大無法完成高通量檢測。

圖2 特非那定對人誘導性多能干細胞誘導分化的心肌細胞(hiPS-CM)活性變化的影響［12］.A:搏動曲線;B:搏動比率;C:Poincaréplots分析的搏動信號振幅的分布;D:自發(fā)性心肌細胞搏動幅度的達峰時間;E:達峰時間.

Cardio將基于阻抗的實時細胞分析技術(shù)運用到心臟毒性的檢測領(lǐng)域，相對于傳統(tǒng)體外、體內(nèi)實驗方法，它可以在近似生理的細胞環(huán)境下持續(xù)短時或長時的監(jiān)測心肌細胞的搏動情況、生理狀態(tài)以及活力改變，快速獲得更多有效及重要的數(shù)據(jù)，從而保證了實驗的持續(xù)性、重復性和數(shù)據(jù)的質(zhì)量。有效避免假陰性，具有高的特異性和靈敏性，相對簡單的操作。能更多使用生理學相關(guān)細胞而非基因工程細胞進行實驗，結(jié)果的可信性更高，通量更大，且可長時間監(jiān)測。因此，該系統(tǒng)可在早期檢測離子通道及非離子通道藥物的心肌細胞調(diào)節(jié)作用，預測藥物潛在的心臟毒性，為藥物心臟毒性的安全性評價及優(yōu)化提供了嶄新的平臺。

2.1 Cardio檢測的各種指標與心臟毒性的關(guān)系

心率是Cardio監(jiān)測的主要指標，傳統(tǒng)上心率是指心臟每分鐘搏動的次數(shù)，在此是指心肌細胞每分鐘搏動的次數(shù)。心率與藥物的心臟毒性有著密切的關(guān)系，因為心率增加可引起多種疾病。Inoue等［19］報道，隨著心率的升高，高血壓的發(fā)病率不斷增加。有研究表明，靜息心率可作為冠心病的預測因子，INVEST研究表明，高血壓伴有冠心病的老年患者，基礎(chǔ)心率比較高，用維拉帕米或阿替洛爾治療后，靜息心率過高或者過低，均增加死亡風險［20］。心率增加還可引起多種嚴重的心臟疾病，如心肌梗死［21］、心房顫動［22-23］及心力衰竭［24］等。

節(jié)律也是Cardio監(jiān)測的主要指標之一。體內(nèi)試驗中，節(jié)律是指心電監(jiān)測儀上呈現(xiàn)出的心臟搏動的節(jié)奏和規(guī)律;在Cardio監(jiān)測的體外實驗中，節(jié)律是指心肌細胞搏動的節(jié)奏和規(guī)律。節(jié)律異常的表現(xiàn)形式多種多樣，早后除極是最常見的節(jié)律紊亂，也是誘發(fā)尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速的主要因素［25］。而慢性心力衰竭與心肌細胞的節(jié)律和收縮性有著密切的關(guān)系［26］。

Cardio系統(tǒng)還可以測得心肌細胞搏動的幅度，這個測量指標在心肌細胞搏動圖譜上被定義為一個負峰值和下一個正峰值之間的距離。2個正峰值之間的時間被稱之為心肌細胞的搏動間期，這兩個指數(shù)均與心肌細胞的興奮-收縮耦聯(lián)間期相對應。該系統(tǒng)還可以測得3個與時間相關(guān)的參數(shù)，在心肌細胞搏動圖譜上被稱之為上升時間、達峰時間和衰減時間，呈現(xiàn)出心肌細胞搏動的時間特征。由Cardio及Poincaréplots分析系統(tǒng)提供的關(guān)于HRV即逐次心跳的RR間期間存在的微小差異或漲落現(xiàn)象的數(shù)據(jù)，為藥物心臟毒性的評價，提供了更加精確的信息。HRV受心臟交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)等多種因素的影響，交感神經(jīng)活動增強時HRV減小，副交感神經(jīng)活動增加時HRV增加。多種心臟疾病于交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)的緊張性和均衡性有關(guān)系，如急性心肌梗死、心力衰竭患者的交感神經(jīng)張力升高，副交感神經(jīng)張力下降［27］。

2.2 Cardio在心臟毒性評價中的應用

Cardio系統(tǒng)是藥物臨床前早期篩選的一個重要工具，能將心肌細胞對引起心律失常的藥物的響應用特征性的搏動圖譜呈現(xiàn)，進而檢測時間分辨率。該系統(tǒng)結(jié)合心肌細胞的物理搏動特性，可以非常簡便地檢測此類藥物的作用。同時，通過動態(tài)監(jiān)測保證了心肌細胞瞬時響應及長時效應的獲取。該方法通過實時記錄分析藥物的心率、節(jié)律及HRV的變化，更加精確，敏感地評價藥物的心臟毒性，有效地降低傳統(tǒng)終點法和單一離子通道等檢測方法的假陰性率，減少了藥物心臟毒性給制藥公司帶來的經(jīng)濟損失。Cardio可用于原代培養(yǎng)心肌細胞、胚胎干細胞誘導心肌細胞(embryonic stem cellderived cardiomyocyte，ESC-CM)、hiPSC-CM、小鼠 iPSC-CM(miPSC-CM)的研究，檢測藥物對心肌細胞的毒性作用。如表1所示，最近，Jonsson等［28］利用Cardio系統(tǒng)檢測多種已知作用的化合物對hiPSC-CM和mESC-CM的作用，并得到精確的結(jié)果，證明了該系統(tǒng)可以全面精確地檢測化合物的心臟毒性。如L-型Ca2+通道阻滯劑氨氯地平在第2次給藥后引起人iPSC-CM搏動消失，在第1次給藥后引起小鼠ESC-CM搏動消失，這說明給藥濃度太高，而出現(xiàn)急性毒性。T-型Ca2+通道阻滯劑米貝地爾在2次給藥后基本不影響人iPSC-CM的搏動情況;在第1次給藥后抑制2個平行劑量組大鼠ESC-CM的搏動，在第2次給藥后抑制了所有(6個平行劑量組)大鼠ESC-CM的搏動。hERG通道抑制劑E-4031，在第1次給藥后引起人iPSC-CM搏動的次數(shù)由基礎(chǔ)值44±1降為22±3，降低了45%并伴有5個平行劑量組的搏動不規(guī)則，在第2次給藥后2個平行劑量組出現(xiàn)搏動不規(guī)則，2個平行劑量組搏動的振幅＜0.02CI;大鼠ESC-CM的搏動次數(shù)在第1次給藥后由177±5降為161±8，降低了9%并有2個平行劑量組搏動不規(guī)則，在第2次給藥后，降為153±10，降低了15%且搏動不規(guī)則消失。這7種化合物分別作用于不同的靶點，給予不同濃度的藥物后，Cardio均能精確地檢測出它們對hiPSC-CM和mESC-CM心率的影響。同時，Nguemo等［17］應用 Cardio和 Poincaréplots分析系統(tǒng)評價了異丙腎上腺素、卡巴膽堿、特非那丁、索他洛爾和多柔比星的心臟毒性，并聯(lián)合了膜片鉗技術(shù)進行了驗證。Cardio可以在近似生理環(huán)境下同時監(jiān)測藥物對多個離子通道作用，以及藥物物之間的相互作用，且具有高通量性、高特異性和高敏感性。

表1 兩種濃度的7種化合物對hiPSC-CM和大鼠胚胎干細胞誘導心肌細胞(mESC-CM)心率的影響［28］

Abassi等［29］利用Cardio預測藥物(離子通道調(diào)節(jié)劑、hERG通道抑制劑、誘發(fā)尖端扭轉(zhuǎn)心率失常的藥物等)的臨床前心臟毒性。如運用Cardio記錄mESC-CM給予L-型鈣離子通道阻滯劑伊拉地平(isradipine)、hERG通道抑制劑E4301、鈉離子通道抑制劑河豚毒素、β-受體激動劑異丙腎上腺素后，24 h心肌細胞的搏動情況。第1小時每分鐘記錄1次，第2小時每5 min記錄1次，第3～24小時每15 min記錄1次，每次記錄時間為20 s。Cardio軟件分析獲得數(shù)據(jù)，計算搏動的次數(shù)、節(jié)律、幅度以及搏動持續(xù)時間等，為評價藥物的早期心臟毒性提供大量的信息。該系統(tǒng)敏感、定量地檢測出了影響心臟調(diào)節(jié)功能的物質(zhì)，包括一些被傳統(tǒng)電生理學方法所遺漏的藥物。另外，該系統(tǒng)還被廣泛地應用于細胞形態(tài)學改變、凋亡、死亡和G蛋白耦聯(lián)受體激動作用的監(jiān)測［30］。

綜上所述，Cardio可以在早期敏感而準確地檢測出藥物潛在的心臟毒性，該心肌細胞分析系統(tǒng)已迅速地被藥物企業(yè)及生物技術(shù)公司接受。當前輝瑞、羅氏和GSK等國外大型制藥公司都以開始使用此技術(shù)進行藥物和候選化合物常規(guī)心臟毒性的篩選研究，并進行了聯(lián)合驗證，準備向FDA和ICH推薦此技術(shù)，希望能把該技術(shù)列為和hERG技術(shù)同等重要的地位。美國FDA在2012年10月購買了Cardio實時心肌細胞分析系統(tǒng)，這正是該系統(tǒng)被制藥領(lǐng)域認可的延伸表現(xiàn)。

3 展望

近年來，越來越多的技術(shù)應用于藥物心臟毒性篩選和評價中。Cardio作為一個新興的技術(shù)，具有高敏感性、高通量、低成本和高效率等優(yōu)點，通過在近似生理環(huán)境下，實時記錄分析心肌細胞的搏動情況、形態(tài)改變等，可以早期預測和評價藥物潛在的心臟毒性，降低新藥研發(fā)的風險。但該方法也存在局限性，Cardio無法清楚解釋藥物是通過何種途徑(如鉀、鈉、鈣離子通道，心肌細胞壞死等)誘發(fā)心臟毒性，尚不能取代傳統(tǒng)的電生理學研究方法。如能將Cardio技術(shù)與電生理學技術(shù)、分子生物學技術(shù)及組學技術(shù)等有機地結(jié)合運用，相互補充，取長補短，必將能更加全面深入地預測和評價各種離子通道和非離子通道藥物引起的心臟毒性，從而更加有效地降低新藥研發(fā)的風險。

［1］MacDonald JS，Robertson RT.Toxicity testing in the 21st Century:a view from the pharmaceutical industry［J］.Toxicol Sci，2009，110(1):40-46.

［2］Giaever I， Keese CR. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1984，81(12):3761-3764.

［3］Kowolenko M，Keese CR，Lawrence DA，Giaever I.Measurement of macrophage adherence and spreading with weak electric fields［J］.J Immunol Methods，1990，127(1):71-77.

［4］Giaever I， Keese CR. A morphological biosensor for mammalian cells［J］.Nature，1993，366(6455):591-592.

［5］Wang HS， Keese CR， Giaever I， Smith TJ.Prostaglandin E2alters human orbital fibroblast shape through a mechanism involving the generation of cyclic adenosine monophosphate［J］.J Clin Endocrinol Metab，1995，80(12):3553-3560.

［6］Keese CR，Bhawe K，Wegener J，Giaever I.Real-time impedance assay to follow the invasive activities of metastatic cells in culture［J］.Biotechniques，2002，33(4):842-844，846，848-850.

［7］Xiao C，Lachance B，Sunahara G，Luong JH.Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing:concentration and time response function approach［J］.Anal Chem，2002，74(22):5748-5753.

［8］Xiao C，Luong JH.On-line monitoring of cell growth and cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing(ECIS)［J］.Biotechnol Prog，2003，19(3):1000-1005.

［9］Kustermann S，Boess F，Buness A，Schmitz M，Watzele M，Weiser T，et al.A label-free，impedance-based real time assay to identify drug-induced toxicities and differentiate cytostatic from cytotoxic effects［J/OL］.Toxicol in Vitro(2012-08-28)，http://dx.doi.org/10.1016/j.tiv.2012.08.019

［10］Irelan JT，Wu MJ，Morgan J，Ke N，Xi B，Wang X，et al.Rapid and quantitative assessment of cell quality，identity，and functionality for cellbased assays using real-time cellular analysis［J］.J Biomol Screen，2011，16(3):313-322.

［11］Ke N，Wang X，Xu X，Abassi YA.The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability［J］.Methods Mol Biol，2011，740:33-43.

［12］Solly K，Wang X，Xu X，Strulovici B，Zheng W.Application of real-time cell electronic sensing(RT-CES)technology to cell-based assays［J］.Assay Drug Dev Technol，2004，2(4):363-372.

［13］Atienza JM，Yu N，Kirstein SL，Xi B，Wang X，Xu X，et al.Dynamic and label-free cell-based assays using the real-time cell electronic sensing system［J］.Assay Drug Dev Technol，2006，4(5):597-607.

［14］Ryder AB，Huang Y，Li H，Zheng M，Wang X，Stratton CW，et al.Assessment of Clostridium difficile infections by quantitative detection of tcdB toxin by use of a real-time cell analysis system［J］.J Clin Microbiol，2010，48(11):4129-4134.

［15］Che Y.Microelectronic cell sensor chip based on the resistance［J］.ChinJ Mod Appl Pharm(中國現(xiàn)代應用藥學)，2008，25(8):783-786.

［16］Huo CY，Zhuang JJ，Huang XL，Hou FZ，Ning XB.Heart rate variability analysis based on modified Poincaréplot［J］.Acta Phys Sin(物理學報)，2012，61(19):1-8.

［17］Nguemo F，?ari'c T，Pfannkuche K，Watzele M，Reppel M，Hescheler J.In vitro model for assessing arrhythmogenic properties of drugs based on high-resolution impedance measurements［J］.Cell Physiol Biochem，2012，29(5-6):819-832.

［18］Anson BD，Kolaja KL，Kamp TJ.Opportunities for use of human iPScells in predictive toxicology［J］.Clin Pharmacol Ther，2011，89(5):754-758.

［19］Inoue T，Iseki K，Iseki C，Kinjo K，Ohya Y，Takishita S.Higher heart rate predicts the risk of developing hypertension in a normotensive screened cohort［J］.Circ J，2007，71(11):1755-1760.

［20］Kolloch R，Legler UF，Champion A，Cooper-Dehoff RM，Handberg E，Zhou Q，et al.Impact of resting heart rate on outcomes in hypertensive patients with coronary artery disease:findings from the International verapamil-SR/trandolapril study(INVEST)［J］.Eur Heart J，2008，29(10):1327-1334.

［21］Fox K，F(xiàn)ord I，Steg PG，Tendera M，F(xiàn)errari R;BEAUTIFUL Investigators.Ivabradine for patients with stable coronary artery disease and left-ventricular systolic dysfunction(BEAUTIFUL):a randomised，double-blind，placebo-controlled trial［J］.Lancet，2008，372(9641):807-816.

［22］Van Gelder IC，Groenveld HF，Crijns HJ，Tuininga YS，Tijssen JG，Alings AM，et al.Lenient versus strict rate control in patients with atrial fibrillation［J］.N Engl J Med，2010 ，362(15):1363-1373.

［23］Groenveld HF， Crijns HJ， Rienstra M， Van den Berg MP，Van Veldhuisen DJ，Van Gelder IC，et al.Does intensity of rate control influence outcome in persistent atrial fibrillation?Data of the RACE study［J］.Am Heart J，2009，158(5):785-791.

［24］B?hm M，Swedberg K，Komajda M，Borer JS，F(xiàn)ord I，Dubost-Brama A，et al.Heart rate as a risk factor in chronic heart failure(SHIFT):the association between heart rate and outcomes in a randomised placebo-controlled trial［J］.Lancet，2010，376(9744):886-894.

［25］Picard S，Goineau S，Guillaume P，Henry J，Hanouz JL，Rouet R.Supplemental studies for cardiovascular risk assessment in safety pharmacology:a critical overview［J］.Cardiovasc Toxicol，2011，11(4):285-307.

［26］Undrovinas A，Maltsev VA.Late sodium current is a new therapeutic target to improve contractility and rhythm in failing heart［J］.Cardiovasc Hematol Agents Med Chem，2008，6(4):348-359.

［27］Hao M.Analysis and clinical significance of heart rate viability［J］.Med Equip(醫(yī)療裝備)，2008，6:31-34.

［28］Jonsson MK，Wang QD，Becker B.Impedance-based detection of beating rhythm and proarrhythmic effects of compounds on stem cell-derived cardiomyocytes［J］.Assay Drug Dev Technol，2011，9(6):589-599.

［29］Abassi YA，Xi B，Li N，Ouyang W，Seiler A，Watzele M，et al.Dynamic monitoring of beating periodicity of stem cell-derived cardiomyocytes as a predictive tool for preclinical safety assessment［J］.Br J Pharmacol，2012，165(5):1424-1441.

［30］Schwarzenberger T，Wolf P，Brischwein M，Kleinhans R，Demmel F，Lechner A，et al.Impedance sensor technology for cell-based assays in the framework of a high-content screening system［J］.Physiol Meas，2011，32(7):977-993.