芫花藥材中芫花酯甲和芫花酯乙UPLC-MS含量測定方法△

李思蒙，金敏蓉，趙森淼

(1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210023；2.上海中醫(yī)藥大學，上海 201203)

芫花藥材中芫花酯甲和芫花酯乙UPLC-MS含量測定方法△

李思蒙1，2*，金敏蓉2，趙森淼2

(1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210023；2.上海中醫(yī)藥大學，上海 201203)

目的：對芫花藥材中含量較低的毒效成分芫花酯甲和芫花酯乙建立相關含量測定方法，為芫花的臨床使用安全性及進一步研究提供參考。方法：采用UPLC-MS，選擇離子掃描法建立相關檢測方法。結(jié)果：建立了芫花藥材中芫花酯甲和芫花酯乙含量測定方法，得到芫花酯甲的線性回歸方程為Y=10.48X+1 234，r=0.998，芫花酯乙的線性回歸方程為Y=10.92X+1 997，r=0.995。結(jié)論：所建立的芫花藥材UPLC-MS含量測定方法靈敏性高，操作簡便，耐用性好，測定結(jié)果可靠，能較好地測定芫花藥材中微量二萜類成分。

芫花；芫花酯甲；芫花酯乙；含量測定；UPLC-MS

芫花為瑞香科植物芫花DaphnegenkwaSieb.et Zucc.的干燥花蕾[1]?！侗静菥V目》記載芫花有催生去胎作用[2]。近代臨床主要運用該藥進行引產(chǎn)、抗早孕以及治療多種疑難病癥，如惡性腫瘤、腹水、精神病等[3-5]。國內(nèi)外關于芫花化學成分的研究報道主要包括黃酮、瑞香烷型二萜[6]、木脂素、香豆素類等化合物；生物活性方面的報道主要集中在抗腫瘤作用以及抗人類免疫缺陷病毒(HIV)等。瑞香烷型二萜類成分是目前國際研究的熱點成分，也是芫花藥材中的主要毒效成分，既具有較強的生物活性，同時亦容易引起致敏性反應。由于二萜類成分含量普遍很低，臨床用藥中又要注意避免其帶來的副作用。為了完善芫花藥材的質(zhì)量標準，進一步開發(fā)和利用芫花藥材，提高臨床用藥的安全性，本文采用UPLC-MS技術建立芫花中瑞香烷型二萜芫花酯甲和芫花酯乙的含量測定方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters ZQ 2000；METTLER 200型電子天平。

1.2 材料

11批芫花藥材收集自全國各地，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學中藥研究所吳立宏副研究員鑒定為瑞香科瑞香屬植物芫花DaphnegenkwaSieb.et Zucc.的干燥花蕾，樣品憑證保存于上海中藥標準化研究中心。

芫花酯甲、芫花酯乙(上海中藥標準化研究中心，純度>98%)，甲醇為分析醇，乙腈為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相：乙腈(A)-水(B)(0.1%冰醋酸水溶液)；流速：0.4 mL·min-1；進樣量：5 μL；柱溫：40 ℃，洗脫程序：0～5 min，85%～50% B；5.1～8 min，20% B；8.1～10 min，5% B。

2.2 質(zhì)譜條件

ESI系統(tǒng)條件參數(shù)設置：檢測器為ZQ(正離子模式下選擇芫花酯甲m/z649.6和芫花酯乙m/z587.6)；毛細管電壓為3.0 kV；離子源溫度為110 ℃；脫溶劑溫度為300 ℃；脫溶劑氣流量為650 L·h-1。對照品及樣品離子色譜圖見圖1～3。

2.3 對照品與供試品溶液制備

2.3.1 對照品溶液制備 分別精密稱取芫花酯甲和芫花酯乙對照品適量，加甲醇制成每1 mL含芫花酯甲和芫花酯乙各50 ng的溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液制備 取芫花中粉0.25 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 檢測限與定量限

2.4.1.1 檢測限 按信噪比(S/N)為3時計算，確定芫花酯甲的檢測限為0.000 7 ng，芫花酯乙的檢測限為0.000 8 ng。

圖1 芫花酯甲和芫花酯乙對照品離子色譜圖

圖2 樣品中芫花酯甲和芫花酯乙選擇離子色譜圖

圖3 芫花樣品離子全掃色譜圖

2.4.1.2 定量限 按信噪比(S/N)為10時計算，重復測量5次求得平均值，確定芫花酯甲的定量限為0.002 3 ng，芫花酯乙的定量限為0.002 3 ng。

2.4.2 標準曲線的繪制 精密稱取芫花酯甲和芫花酯乙適量，吸取甲醇配成不同濃度的對照品溶液，按2.1色譜條件進行測定，以對照品濃度(ng·mL-1)為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，得到芫花酯甲的線性回歸方程為Y=10.48X+1 234，r=0.998；芫花酯乙的線性回歸方程為Y=10.92X+1 997，r=0.995。

2.4.3 精密度試驗 準確吸取同一對照品溶液5 μL，連續(xù)進樣7次，測定芫花酯甲和芫花酯乙的峰面積，計算RSD分別為3.1%和1.8%。

2.4.4 重復性試驗 取同一樣品6份，精密稱定，按2.3.2操作，在2.1色譜條件下進行測定，根據(jù)所得芫花酯甲和芫花酯乙的質(zhì)量分數(shù)，計算RSD分別為2.4%和1.4%。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 取芫花藥材中粉0.25 g，精密稱定，按2.3.2操作，在2.1色譜條件下，分別在0，1，2，4，8，12，24，36，48，72 h進行測定，以峰面積進行考察，計算RSD=3.4%，結(jié)果表明樣品在72 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 加樣回收試驗 取已知芫花酯甲和芫花酯乙含量的芫花藥材中粉0.125 g(芫花酯甲質(zhì)量分數(shù)為1.11 mg·g-1，芫花酯乙質(zhì)量分數(shù)為1.37 mg·g-1)，精密稱定9份，每3份加入相同量(分別為已知含量的50%，100%，150%)的芫花酯甲和芫花酯乙的對照品，按2.3.2方法操作，測定，計算回收率，結(jié)果見表1、2。

表1 芫花中芫花酯甲加樣回收率測定

表2 芫花中芫花酯乙加樣回收率測定

2.5 含量測定

分別取芫花中粉0.25 g，精密稱定，按2.3.2操作，制成供試品溶液。精密稱取芫花酯甲、芫花酯乙對照品適量，加甲醇制成每1 mL分別含芫花酯甲、芫花酯乙各50 ng的溶液，即得。分別精密吸取對照品溶液1 μL，供試品溶液5 μL，注入UPLC-MS，測定，結(jié)果見表3。

表3 芫花樣品中芫花酯甲和芫花酯乙的測定(n=3) mg·g-1

3 討論

流動相的選擇分別考察了乙腈-水，乙腈-0.01%醋酸水溶液，水溶液在加入醋酸后對色譜峰的對稱性有明顯改善，則選用乙腈-0.01%醋酸水溶液作為流動相。

芫花酯甲和芫花酯乙是芫花抗腫瘤、抗HIV作用的主要活性成分，也是芫花致敏性的主要成分。本文選擇這兩個成分作為芫花UPLC-MS含量測定的指標成分，能夠較好地指示出芫花中毒效成分的含量，對于臨床用藥的安全性以及對芫花的深入研究都有著重要意義，同時可以完善芫花藥材質(zhì)量優(yōu)劣的認定?！吨袊幍洹?010版以及其他相關標準都是以黃酮類物質(zhì)芫花素、羥基芫花素作為芫花的指標成分進行考察，這兩類黃酮類物質(zhì)主要起到鎮(zhèn)咳祛痰的作用。經(jīng)文獻研究芫花的傳統(tǒng)藥用物質(zhì)基礎主要為瑞香烷型二萜類成分，故采用芫花酯甲和芫花酯乙這兩個二萜類物質(zhì)中含量較高的成分為代表，能夠較好地反映出芫花藥材的質(zhì)量優(yōu)劣，從而保證芫花藥材的質(zhì)量。實驗研究建立的芫花藥材UPLC-MS含量測定方法靈敏性高，操作簡便，耐用性好，測定結(jié)果可靠，能較好地測定芫花藥材中的微量二萜類成分，可用于芫花藥材的質(zhì)量評價。

[1] 國家藥典委員會，中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：148.

[2] 李時珍，本草綱目 [M].第二冊.北京：人民衛(wèi)生出版社，1979：121.

[3] Kasai R，Lee K H，Huang H C,et al.Genkwadaphnin，a potent antileukemic diterpene fromDaphnegenkwa[J].Phytochemistry，1981，20(11)：2592-2594.

[4] Hall I H，Kasai R，Wu R Y，et al.Antitumor agents LV：Effects of genkwadaphnin and yuanhuacine on nucleic acid synthesis of P-388 lymphocytic leukemia cells，Pharm[J].Sci，1982，71(11)：1263-1267.

[5] Zhan Z J，F(xiàn)an C Q，Ding J，et al.Novel diterpenoids with potent inhibitory activity against endothelium cell HMEC and cytotoxic activities form a well-known TCM plantDaphnegenkwa[J].Bioorga Med Chem，2005，13：645-655.

[6] Li S M，Chou G X，Hseu Y C,et al.Isolation of anticancer constituents from Flos Genkwa(DaphnegenkwaSieb.et Zucc.)through bioassay-guided procedures[J].Chemistry Central Journal，2013，7：159.

DeterminationofYuanhuacineandYuanhuadineinDaphnegenkwaSieb.etZucc.byUPLC-MS

LI Simeng1，2*，JINMinrong2，ZHAOSenmiao2

(1.NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China；2.ShanghaiUniversityofChineseMedicine，Shanghai，201203，China)

Objective：To establish qualitative analysis method for yuanhuacine and yuanhuadine，and to provide the reference for the clinical safety of the medicinal material ofDaphnegenkwa.Methods：The qualitative analysis method was established by UPLC-MS and ion scanning method.Results：The qualitative analysis methods was established for determining yuanhuacine and yuanhuadine.The linear regression equation of yuanhuacine wasY=10.48X+1 234，r=0.998，and the linear regression equation of yuanhuadine wasY=10.92X+1 997，r=0.995.Conclusion：The qualitative analysis forD.genkwaby UPLC-MS was high sensitive，easy and simple to handle，good durability and reliable，which was able to determine the diterpenoids for medicinal material ofD.genkwa.

Daphnegenkwa；Yuanhuacine；Yuanhuadine；Qualitative analysis；UPLC-MS

2014-10-24)

常用有毒中藥質(zhì)量控制方法和安全標準研究(09dZ1972800)；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目

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李思蒙，講師，研究方向：中藥化學及質(zhì)量標準；Tel：(025)85811514，E-mail：lisimeng0626@hotmail.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.12.008