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    芫花素對乙酰膽堿酯酶抑制作用研究

    2020-11-15 01:05:52肖正鳳
    廣州化工 2020年21期
    關鍵詞:芫花酯酶緩沖溶液

    肖正鳳

    (陜西學前師范學院,陜西 西安 710062)

    阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)被認為是最常見的一種癡呆形式,是一種進行性神經(jīng)障礙,其特征是記憶力喪失和其他智力能力的嚴重損害[1]。關于AD發(fā)病機制的學說有不少,其中最為廣泛接受的是“膽堿能假說”,該學說認為AD與乙酰膽堿(ACh)的降低水平和腦內膽堿能神經(jīng)元的丟失有關[2]。因此,通過增加腦內乙酰膽堿水平、改善膽堿能系統(tǒng)的是治療AD的重要方法。

    乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,AChE),一種能將神經(jīng)遞質ACh分解成乙酸和膽堿的酶,阻礙正常的神經(jīng)傳遞,在調控膽堿能系統(tǒng)中發(fā)揮關鍵作用[3]。阿爾茨海默病的膽堿能假說指出,抑制AChE作用可能是治療阿爾茨海默病癥狀重要方法之一?;诖耍?-甲氧基他林(7-methoxytacrine)、多奈哌齊(donepezil)、加蘭他敏(galantamine)及石杉堿甲(huperzineA)等多個AChE抑制劑已被研制成功,并投入臨床用于調節(jié)和控制AChE的活性及預防和治療阿爾茨海默病,成為目前治療阿爾茨海默病的主要藥物[4]。但是目前已投入臨床中的抑制劑對于改變重度阿爾茨海默病患者的癥狀效果不佳,同時存在選擇性低、副作用較大等問題。因此,尋找能夠有效抑制AChE活性、選擇性好、副作用小的新型天然產(chǎn)物,并探討它們的抑制作用及機理,對于研發(fā)治療阿爾茨海默病的藥物和了解AChE抑制劑發(fā)揮藥效的作用機制具有重要意義。

    芫花素(genkwanin)又叫芫花黃素,為淡黃色針狀結晶,屬于黃酮類化合物,其成分來源為瑞香科植物芫花。據(jù)我國藥典記載,芫花具有解毒殺蟲、瀉水逐飲的功效;內治痰飲積聚、氣逆喘咳、水腫脹滿、胸腹積水、二便不利,外治疥癬禿瘡、凍瘡[8]?,F(xiàn)代藥理研究表明,芫花素具有多種藥理活性,例如抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)咳祛痰、保護腦缺血神經(jīng)損傷及心肌細胞缺血再灌注損傷、降血壓、抗焦慮、抗菌、抗病毒以及抗氧化調節(jié)免疫功能等作用[9-11]。

    本文發(fā)現(xiàn)芫花素對AChE的活性具有一定的抑制作用,探討了芫花素與AChE的相互作用,并采用酶抑制動力學研究了其抑制機理,旨在于為建立芫花素與AChE結合的體外模型、揭示芫花素抑制體內生物學作用機制及利用、設計或開發(fā)新藥等提供理論依據(jù)。

    1 實 驗

    1.1 試劑和儀器

    試劑:eeAChE(來源于電鰩)、碘化硫代乙酰膽堿(ATChI)及聯(lián)硫代雙硝基苯甲酸(DTNB),美國Sigma公司;芫花素,中國食品藥品檢定研究院;二甲基亞砜、磷酸二氫鉀、乙醇、磷酸氫二鈉均購自西安化學試劑廠。實驗所用試劑均為分析純;實驗用水均為超純水。

    儀器:PE Lambda35型紫外可見分光光度計,美國PerkinElmer公司;pH數(shù)顯酸度計,賽多利斯科學儀器有限公司。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 溶液配制

    用磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀配制pH為7.5的0.01 mol·L-1的PBS緩沖溶液。用pH為7.5的0.01 mol·L-1的PBS緩沖溶液配制濃度為1.17 mg/mL的AChE貯備液,冷凍儲存,使用時用磷酸鹽緩沖溶液稀釋至所需濃度;用pH為7.5的0.01 mol·L-1的PBS緩沖溶液配制濃度為1.87×10-3mol·L-1的碘化硫代乙酰膽堿(ATChI)貯備液,用時稀釋至所需濃度;用pH為7.5的0.01 mol·L-1的PBS緩沖溶液配制濃度為1.25×10-3mol·L-1的聯(lián)硫代雙硝基苯甲酸(DTNB)儲備液,用時稀釋至所需濃度。用二甲基亞砜(DMSO)配制濃度為1×10-2mol·L-1芫花素儲備液。

    1.2.2 芫花素對乙酰膽堿酯酶活性的抑制作用

    按照Ellmann法[12]檢測AChE的活性。在25 ℃下,pH=7.5,0.01 mol·L-1PBS中,以碘化硫代乙酰膽堿(ATChI)為底物。酶促反應的產(chǎn)物硫代膽堿與聯(lián)硫代雙硝基苯甲酸(DTNB)發(fā)生反應,其產(chǎn)物為黃色化合物的5-巰基-2-硝基苯甲酸(TNB)。TNB在412 nm處的摩爾消光系數(shù)ε為14150 L·mol-1·cm-1,用紫外分光光度計測定TNB在412 nm處的吸光值[13]。

    未加抑制劑AChE活性的測定:在1 mL比色管中加入515.6 μL PBS緩沖溶液、8 μL的AChE使用液(2.34 μg·mL-1)、7 μL的DMSO及160 μL DTNB使用液(1.25 mmol·L-1),將于25 ℃水浴中恒溫20 min,然后加入9.4 μL碘化硫代乙酰膽堿使用液(1.87 mmol·L-1),搖勻并置于25 ℃水浴中恒溫1 min,在波長412 nm處并以蒸餾水為參比溶液,測其吸光度值(Acontrol)。以PBS緩沖溶液(0.01 mol·L-1)代替AChE使用液(2.34 μg·mL-1)做空白實驗,重復上述步驟,測得空白值A0。

    加入抑制劑AChE活性測定:在1 mL比色管中加入8 μL AChE使用液的同時加入一定量的芫花素使用液,根據(jù)加入的芫花素使用液體積調整PBS緩沖溶液的體積使總體積保持為700 μL,其它步驟與未加抑制劑AChE活性的測定相同,在波長412 nm處并以蒸餾水為參比溶液,測得加入一定量芫花素抑制劑后的吸光度值A。按照下式計算加入芫花素后的相對酶活力:

    (1)

    式(1)中:ΔAcontrol是未加芫花素抑制劑時測得的校正吸光度值;ΔAcontrol=Acontrol-A0;ΔA是加入芫花素后酶催化反應的校正吸光度值,ΔA=A-A0。

    1.2.3 芫花素對乙酰膽堿酯酶的動力學特征

    通過紫外分光光度計測得5-巰基-2-硝基苯甲酸(TNB)吸光度值A的變化反映了AChE催化反應產(chǎn)物硫代膽堿濃度的變化。在不同芫花素濃度(0,5,10和15 μmol·L-1)下,固定催化反應溫度為25 ℃,AChE的濃度為3.82×10-10mol·L-1,在AChE催化反應線性區(qū)間內,每間隔一定的時間,測定不同底物濃度(2.5,4,5,8,10,20和40 mmol·L-1)時反應產(chǎn)物硫代膽堿與顯色劑DTNB生成黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸的吸光度值A。用time(AChE催化反應時間)~A(測得的吸光度值)作圖,得到的直線斜率反映了AChE催化反應的速率v[14-15],接著按照 Lineweaver-Burk的雙倒數(shù)作圖法,可確定抑制作用的類型。

    2 結果與討論

    2.1 AChE催化反應進程

    固定AChE的濃度為3.82×10-10mol·L-1,硫代乙酰膽堿的初始濃度為2.51×10-5mol·L-1,記錄412 nm處吸光度值隨時間的變化,測得無抑制劑存在時和分別加入不同濃度的芫花素后AChE催化硫代乙酰膽堿分解的反應時間進程曲線如圖1所示。由圖1可見,吸光度值A隨時間的變化曲線為過原點的直線,直線的斜率反映AChE催化反應的初速率v,可代表酶活。加入芫花素抑制劑后,直線的斜率變小,AChE催化反應速率隨著芫花素的濃度增加而降低,單位時間內生成5-巰基-2-硝基苯甲酸的量減少,說明芫花素對AChE的催化活性具有抑制作用。

    圖1 加入不同濃度的芫花素后對AChE的催化反應速率的影響

    2.2 芫花素對乙酰膽堿酯酶活力的抑制作用

    由圖1中每條直線的斜率與無抑制劑存在時直線的斜率的比值求得相對酶活力,作出了圖2,此圖體現(xiàn)了不同濃度的芫花素對AChE活性的影響。由圖2可知,隨著芫花素濃度的增加,AChE的相對酶活力逐漸降低。當芫花素的濃度在0~10 μmol·L-1范圍時,相對酶活力與加入的芫花素濃度之間呈線性負相關關系(相關系數(shù)r>0.99),線性擬合曲線為:相對酶活力=-0.054c(genkwanin)+0.9839。根據(jù)該線性擬合曲線求得50%抑制濃度(IC50),即導致AChE酶活力下降50%所需的芫花素濃度為8.96 μmol·L-1,此結果表明AChE的活性受到芫花素的抑制,且抑制作用較強。因此芫花素可作為一種用來篩選AChE的抑制劑的參考配體。

    圖2 芫花素對AChE活性的影響

    2.3 芫花素對乙酰膽堿酯酶活力的抑制動力學

    為了進一步明確芫花素對乙酰膽堿酯酶抑制作用的機理,在測定酶活體系中,固定酶的濃度為3.82×10-10mol·L-1,在不同的芫花素濃度下,改變試液的底物碘化硫代乙酰膽堿(ATChI)濃度([S]),測得這些試液的吸光度隨時間的變化情況,從直線的斜率得到AChE催化反應的初速率v,再根據(jù)底物濃度([S])與初速率v作圖,得到米氏(Michaelis-Menten)曲線(如圖3所示)。由圖3可知,酶促反應的動力學符合米氏(Michaelis-Menten)方程,因此可進一步研究芫花素對AChE的抑制類型。

    圖3 不同濃度芫花素下AChE的米氏曲線

    在可逆抑制類型中,根據(jù)抑制劑、底物和酶三者的相互關系,又可分為競爭性抑制、非競爭性抑制、反競爭性抑制和混合型抑制四種類型,可通過雙倒數(shù)作圖(Lineweaver-Burk作圖法)進行判斷[16]。利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法即以不同的芫花素濃度下測得的AChE催化反應速率的倒數(shù)(1/[v])對底物濃度的倒數(shù)(1/[S])作圖,如圖4所示。

    圖4 芫花素對AChE抑制作用的雙倒數(shù)圖

    由圖4可知,無抑制劑存在時和加入不同濃度的芫花素后,得到的幾條相交于第二象限的直線。因加入不同濃度的芫花素,這些直線與橫軸和縱軸的交點都不同。本實驗條件下,無抑制劑存在時AChE催化硫代酰膽堿分解的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)擬合曲線為:

    (2)

    根據(jù)公式(2)的斜率和截距計算出在溫度為25 ℃時乙酰膽堿酯酶表觀米氏常數(shù)Km為0.062 mmol·L-1,酶促反應的最大速率Vmax為0.962 mmol·L-1·min-1。圖4可知乙酰膽堿酯酶的表觀米氏常數(shù)(Km)隨著芫花素濃度增大而增大,而酶促反應的最大速率(Vmax)隨著芫花素濃度增大而減小。因此根據(jù)酶的可逆抑制動力學特征判斷[16],芫花素對乙酰膽堿酯酶的抑制作用機理表現(xiàn)為混合Ⅰ型競爭抑制。混合型抑制結果表明,芫花素既可以和游離酶(E)結合,也可以與酶-底物復合物(ES)結合,導致酶活力降低。

    用抑制劑存在下的表觀米氏常數(shù)Km或雙倒數(shù)圖斜率(簡稱一次作圖斜率)對抑制劑濃度作圖即兩次作圖法可求得抑制常數(shù)KI。因此,以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖中直線的斜率對芫花素濃度作圖,得到圖5。圖5中直線的反向延長線與X軸的交點即為芫花素對AChE的抑制常數(shù)的相反數(shù),由此求得芫花素對AChE的抑制常數(shù)KI=5.77×10-6mol·L-1。又以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖中直線與Y軸的截距對芫花素濃度作圖,如圖6所示,圖中直線的反向延長線與X軸的交點即為芫花素對酶-底物絡合物的抑制常數(shù)的相反數(shù),由此求得芫花素對酶-底物絡合物的抑制常數(shù)KIS=31.11×10-6mol·L-1,KIS值約為KI值的5.39倍,由此可知抑制常數(shù)KIS>KI,說明競爭性抑制強于反競爭性抑制,即芫花素對游離酶的抑制作用強于其對酶-底物復合物的抑制作用[17]。這種抑制類型往往是由于配體與酶的結合部位是對酶活性起重要作用的其它活性位點,而不是酶的活性中心。

    圖5 芫花素對AChE抑制常數(shù)KI的測定

    圖6 芫花素對AChE抑制常數(shù)KIS的測定

    3 結 論

    芫花素對AChE的抑制作用研究結果表明,加入芫花素后,酶催化反應速率顯著降低。芫花素對AChE抑制作用的IC50為 8.96 μmol·L-1。芫花素對AChE的抑制作用表現(xiàn)為混合Ⅰ型的可逆抑制,芫花素對游離酶的抑制作用強于其對酶-底物復合物的抑制作用。本文的研究結果對進一步深入研究芫花素對AChE抑制作用的機理提供了依據(jù)。

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