抑制小鼠HL-1心肌細胞橋粒斑蛋白基因表達對縫隙連接蛋白 43結(jié)構(gòu)和功能的影響*

張黔桓, 鄧春玉, 饒 芳, 劉曉穎, 麥麗萍, 朱杰寧, 譚虹虹, 吳書林

(廣東省人民醫(yī)院心內(nèi)科， 廣東省心血管病研究所，廣東 廣州 510080)

抑制小鼠HL-1心肌細胞橋粒斑蛋白基因表達對縫隙連接蛋白 43結(jié)構(gòu)和功能的影響*

張黔桓, 鄧春玉, 饒 芳, 劉曉穎, 麥麗萍, 朱杰寧, 譚虹虹, 吳書林△

(廣東省人民醫(yī)院心內(nèi)科， 廣東省心血管病研究所，廣東 廣州 510080)

目的采用基因沉默技術(shù)抑制小鼠HL-1心肌細胞橋粒斑蛋白(DSP)基因表達以明確DSP與縫隙連接蛋白43(Cx43)的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系。方法用基因沉默技術(shù)抑制DSP基因的表達，Western blotting和流式細胞術(shù)檢測HL-1細胞DSP和Cx43蛋白的表達，用雙免疫熒光方法檢測DSP與Cx43蛋白的表達與定位情況，并用劃痕標記染料示蹤技術(shù)檢測細胞縫隙連接通訊狀況。結(jié)果與空白組和對照組相比，siRNA-DSP組的DSP和Cx43蛋白表達量降低(P<0.05)。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)空白組和對照組DSP與Cx43蛋白存在共定位情況，而siRNA-DSP組DSP和Cx43蛋白共定位遭到破壞，Cx43蛋白出現(xiàn)再分布，在細胞內(nèi)檢測到Cx43蛋白，并且劃痕標記染料示蹤技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)siRNA-DSP組Lucifer yellow通過HL-1細胞縫隙連接的傳輸功能降低。結(jié)論DSP表達抑制不僅使Cx43出現(xiàn)再分布，而且影響縫隙連接傳導(dǎo)功能。

縫隙連接蛋白 43； 橋粒斑蛋白; 基因沉默; HL-1細胞

橋粒是心肌閏盤的主要成份，與中間絲共同維持著心肌細胞之間的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。橋粒斑蛋白(desmoplakin,DSP)是最大的橋粒蛋白，其N末端與其它橋粒蛋白如plakophilin-2(PKP2)和plakoglobin(PG)相連，C末端則與中間絲相連，在維持心肌細胞之間的結(jié)構(gòu)和功能完整性方面發(fā)揮重要的作用。致心律失常性右室心肌病(arrhythmogenic right ventri-cular cardiomyopathy，ARVC)是一種遺傳性心肌病，其主要的特征是起源于右室的致命性室性心律失常。約有40%的ARVC患者有一個或多個編碼橋粒蛋白的基因發(fā)生突變，且橋粒突變的患者室性心律失常的發(fā)生率較高[1-2]，但橋?；蛲蛔儗?dǎo)致患者發(fā)生室性心率失常的確切機制并不清楚?？p隙連接蛋白43(connexin 43，Cx43)是人類心臟縫隙連接的主要亞型，在一些橋?；蛲蛔兊幕颊咧蠧x43信號出現(xiàn)減弱[3]。Cx43是否參與和介導(dǎo)了橋?；蛲蛔冎滦穆墒С５姆肿訖C制并不清楚，需要進一步的研究來闡明。本研究采用基因沉默技術(shù)抑制HL-1心肌細胞DSP基因表達以明確DSP與Cx43的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系。

材 料 和 方 法

1細胞

HL-1 細胞來源于小鼠的心肌細胞系A(chǔ)T-1，傳5代以上，由王志國教授惠贈(加拿大Mcgill大學(xué))。

2主要試劑

Claycomb培養(yǎng)基和新鮮牛血清購自Biosciences；0.05%typsin-EDTA購自Gibco；LipofectamineTM2000和熒光標記的Ⅱ抗(Alexa Flour? 488，羊抗兔)購自Invitrogen； Hoechst 33258和Lucifer yellow 熒光染料購自Sigma；ALL-in-OneTMQ-PCR Primer購自廣州復(fù)能公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit購自大連TaKaRa ；GoTaq? Green Master Mix試劑盒購自Promega；desmoplakinⅠ/Ⅱ多克隆抗體(兔來源)和GAPDH多克隆抗體(兔來源)購自Santa Cruz，desmoplakinⅠ/Ⅱ單克隆抗體(鼠來源)購自Abcam；HRP標記的Ⅱ抗(羊抗兔) 和HRP標記的Ⅱ抗(羊抗鼠)購自KPL；PE標記的Ⅱ抗(羊抗鼠)IgG購自杭州聯(lián)科生物；熒光標記的Ⅱ抗(Alexa Flour? 647，羊抗鼠)和RIPA購自Cell Signaling Technology。DAPI購自Roche。

3主要方法

3.1HL-1細胞培養(yǎng) 向T25培養(yǎng)瓶中加入Claycomb培養(yǎng)基，每24～48 h更換。細胞長至完全融合后分瓶，0.05% trypsin-EDTA(37 ℃)沖洗，然后將液體去除。每個培養(yǎng)瓶另加1.3 mL trypsin-EDTA液，37 ℃孵化，加相同量的大豆胰蛋白酶抑制劑中和消化酶，將細胞轉(zhuǎn)移到離心管中。用5 mL沖洗培養(yǎng)基(Claycomb培養(yǎng)基含5%胎牛血清和青/鏈霉素)沖洗空培養(yǎng)瓶，然后加到上述15 mL離心管中，500×g離心5 min，同時去除培養(yǎng)瓶中的凝膠/纖維結(jié)合素液，加入4 mL Claycomb培養(yǎng)基到每個瓶中。取出離心管，去上清，加入3ml Claycomb培養(yǎng)基，混勻。

3.2siRNA轉(zhuǎn)染

3.2.1siRNA的合成 由上海吉瑪公司合成針對小鼠DSP mRNA的siRNA 寡核苷酸，共有3對陽性序列，1對陰性對照，序列見表1。為檢測siRNA 的轉(zhuǎn)染效率，同時合成1對帶熒光標記的陰性對照(FAM-siRNA)。

3.2.2siRNA轉(zhuǎn)染 裝有siRNA oligo的EP管離心(10 000 r/min、4 ℃)1 min，加入DEPC水配置成20 μmol/L的溶液，振蕩溶解，4 ℃保存。轉(zhuǎn)染前1 d，胰酶消化細胞并計數(shù)，細胞鋪在24孔板上，使其在轉(zhuǎn)染日密度為50%～70%。每孔細胞加入500 μL不含抗生素但含有血清的培養(yǎng)基。對于每孔細胞，使用50 μL Opti-MEMTM培養(yǎng)基稀釋不同濃度梯度的siRNA溶液，再用50 μL Opti-MEMTM培養(yǎng)基稀1 μL LipofectamineTM2000試劑，分別裝入2個EP管，室溫下孵育5分鐘后混合，孵育20 min。更換細胞培養(yǎng)基，加入無血清培養(yǎng)基500 μL，再加入上述siRNA和LipofectamineTM2000混合物，搖動混勻，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育，6 h后更換含血清的生長培養(yǎng)基。以上操作均在超凈工作臺上完成，所有EP管和槍頭均是RNase-free。轉(zhuǎn)染FAM-siRNA時需要避光。

3.2.3Real-time PCR檢測siRNA轉(zhuǎn)染效率 HL-1細胞接種于6孔板，將實驗分為6組：siRNA-DSP-Ⅰ組、siRNA-DSP-Ⅱ組、siRNA-DSP-Ⅲ組、空白組、脂質(zhì)體組和siRNA-DSP-control組，轉(zhuǎn)染48 h后提取細胞總RNA，real-time RT-PCR法檢測各組細胞中 DSP mRNA的表達情況，方法如下：Trizol法提取細胞總RNA，配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，-20 ℃保存。PCR擴增的反應(yīng)體系為：正義引物 (20 μmol/L) 1 μL，反義引物 (20 μmol/L) 1 μL，模板 DNA 2 μL，RNase-free dH2O 6 μL，ALL-in-OneTMQ-PCR Primer 10 μL。擴增條件為：預(yù)變性95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s。

3.2.4引物設(shè)計 從PubMed GenBank中獲取小鼠DSP基因(NM_0238422)全序列，Primer Primier 5.0軟件設(shè)計引物，廣州復(fù)能公司合成引物，GAPDH作為內(nèi)參照，各引物序列見表2。

表2 引物序列

3.3Western blotting檢測DSP和Cx43蛋白的表達 HL-1細胞接種于6孔板，細胞轉(zhuǎn)染120 h棄去培養(yǎng)基，預(yù)冷的PBS沖洗，每孔加入100 μL RIPA裂解液，同時加入蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min，收集裂解液，12 000 r/min離心20 min，去上清，分裝后儲存于-80 ℃。采用BCA蛋白定量中的標準液制定標準曲線，分光光度計測定細胞蛋白樣本吸光度值，與標準曲線比較計算總蛋白含量。按照分子克隆第2版配方分別配制相應(yīng)的濃縮膠和5%分離膠；取30 μg蛋白樣本，加入4×SDS 上樣緩沖液，總體積40 μL, 煮沸5 min變性后上樣(35 μL)，于Tris-甘氨酸電泳緩沖液中以120 V積層膠、180 V分離膠電泳至分離膠底端。然后將蛋白質(zhì)從SDS聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，洗膜，封閉后，將硝酸纖維膜放入雜交袋中，加入以封閉液稀釋至適當濃度的Ⅰ抗工作液(抗體以1∶200稀釋)，4 ℃過夜。TBST漂洗，加以TBST-M至適當濃度的辣根酶標記的相應(yīng)Ⅱ抗工作液(1∶2 000)，室溫平緩搖動孵育2～3 h；漂洗后ECL Plus 檢測。Western blotting結(jié)果掃描后用Quantity One軟件分析，與內(nèi)參照GAPDH相比較。

3.4雙免疫熒光檢測DSP和Cx43蛋白的定位和表達 多聚賴氨酸處理過的玻片，烘干后，高溫消毒，放于6孔板中，HL-1細胞種植于6孔板的玻片上。細胞轉(zhuǎn)染后120 h棄去培養(yǎng)基，用雙免疫熒光方法檢測DSP與Cx43的蛋白表達與定位情況。用冷PBS沖洗，甲醇-20 ℃固定，用0.5%Triton X-100透化；5%BSA室溫封閉；PBS沖洗后先后加鼠DSP單克隆抗體(Ⅰ抗)和兔多克隆Cx43抗體(第2種Ⅰ抗)，室溫2 h或4 ℃過夜；然后沖洗后先后加熒光Ⅱ抗Alexa Flour? 647(羊抗鼠)和熒光Ⅱ抗Alexa Flour? 488(羊抗兔)，37 ℃、60 min孵育；PBS沖洗，DAPI染核5 min，抗熒光衰減劑封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

3.5劃痕熒光實驗檢測縫隙連接功能 用劃痕標記染料示蹤技術(shù)(scrape loading and dye transfer，SLDT)檢測細胞縫隙連接通訊狀況。HL-1細胞接種于6孔板，轉(zhuǎn)染后120 h棄培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞，用手術(shù)刀輕輕劃痕2～3 條，迅速滴加含0.05% Lucifer yellow的0.33 mol/L的Licl溶液2 mL，標記細胞3 min，用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞3次，立即在熒光顯微鏡下觀察細胞間熒光傳輸情況。有縫隙連通訊功能的細胞其標記染料可沿劃痕區(qū)向外擴散，通過觀察熒光染料擴散的距離或劃痕區(qū)的熒光強度，即可直接反映細胞的縫隙連接功能狀況。

4統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較用One-way ANOVA方法檢驗。用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件分析，檢驗為雙側(cè)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1FAM-siRNA轉(zhuǎn)染效率的檢測

不同濃度siRNA轉(zhuǎn)染HL-1細胞，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，出現(xiàn)的綠色熒光強度不一，其中以FAM-siRNA終濃度為50 nmol/L時細胞中出現(xiàn)的綠色熒光最強，轉(zhuǎn)染效率最高，因此選擇50 nmol/L為本實驗進行siRNA轉(zhuǎn)染的終濃度。

2篩選最佳干擾效能的siRNA-DSP

HL-1細胞轉(zhuǎn)染siRNA-DSP后24 h進行real-time PCR分析顯示，siRNA-DSP-I組、siRNA-DSP-II組和siRNA-DSP-III組DSP mRNA表達抑制率分別為26%、24%和76%，表明siRNA-DSP-III具有明顯的干擾作用，故選擇siRNA-DSP-III進行后續(xù)實驗。

3轉(zhuǎn)染siRNA-DSP對HL-1細胞DSP蛋白表達的影響

HL-1細胞轉(zhuǎn)染siRNA-DSP 48、72、96和120 h,siRNA-DSP組的DSP蛋白表達量降低，而空白組和siRNA-DSP-control組DSP蛋白表達量無明顯改變，見圖1。

Figure 1. Western blotting assay for DSP and APDH (internal control) expression in HL-1 cells.

圖1Westernblotting檢測各組DSP蛋白的表達

4DSP基因沉默影響Cx43蛋白表達和定位

HL-1細胞轉(zhuǎn)染siRNA-DSP 120 h后采用免疫熒光技術(shù)在激光共聚焦顯微鏡下觀察DSP與Cx43蛋白的定位和表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未處理組和對照組DSP與Cx43蛋白存在共定位情況，而siRNA-DSP組DSP和Cx43蛋白共定位則遭到破壞，Cx43蛋白出現(xiàn)再分布，并在細胞內(nèi)檢測到Cx43蛋白，見圖2。

Figure 2. Immunofluorescence microscopy (×400) of HL-1 cells treated for 120 h with siRNA-DSP, non-targeting siRNA (siRNA-DSP-control), or without any siRNA(non-treatment).

圖2HL-1轉(zhuǎn)染siRNA-DSP120h后激光共聚焦顯微鏡下觀察沉默DSP基因?qū)x43蛋白分布的影響

HL-1細胞轉(zhuǎn)染siRNA-DSP 120 h后用Western blotting檢測DSP和Cx43蛋白的表達，與空白組和siRNA-DSP-control組相比，siRNA-DSP組的DSP和Cx43蛋白表達量降低，見圖3。

5轉(zhuǎn)染siRNA-DSP后HL-1細胞縫隙連接通訊功能的降低

HL-1細胞轉(zhuǎn)染siRNA-DSP 120 h后發(fā)現(xiàn)與對照組和未處理組相比，Lucifer yellow通過HL-1細胞縫隙連接的傳輸功能降低，提示沉默DSP基因不僅使Cx43蛋白再分布，而且影響其組成的縫隙連接的功能。

討 論

縫隙連接通過調(diào)節(jié)細胞間離子轉(zhuǎn)運實現(xiàn)電偶聯(lián)和機械信號的傳遞，而黏附連接和橋粒則為縫隙連接提供機械穩(wěn)定性，它們?nèi)呶挥谛募〖毎c盤中[4]?？p隙連接由2個半通道或連接子(connexons)組成，位于鄰近細胞的胞質(zhì)膜，該連接子是由6個亞基組成，其中Cx43是人類心臟的主要亞型，但是Cx40和Cx45也有較低水平的表達。

橋粒結(jié)構(gòu)完整性遭到破壞會影響縫隙連接的結(jié)構(gòu)和功能。最初在Naxos病和Carvajal綜合征患者中發(fā)現(xiàn)Cx43在縫隙連接處的表達減少[5-6]，而這些患者除了心臟結(jié)構(gòu)改變外，還伴有皮膚和毛發(fā)的改變。最近，F(xiàn)ilder等[7]在PKP2突變(R635W)患者的心肌組織中發(fā)現(xiàn)Cx43信號減弱，而Oxford等[8]則在體外培養(yǎng)的心肌細胞中證實PKP2表達的抑制可以減少Cx43蛋白的表達。

目前研究表明Cx43直接或間接地與β-catenin、p120-catenin和位于心肌閏盤的鈉通道復(fù)合物等之間有關(guān)聯(lián)[9]，雖然這些蛋白之間的相互作用不清楚，但Cx43可能在細胞間的信號傳遞中起作用。Ai等[10]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)典信號通道上的Wnt-1蛋白可調(diào)節(jié)Cx43 的表達，縫隙連接的重塑可使Wnt-1和Cx43表達下調(diào)，而在Cx43表達缺陷的小鼠易發(fā)生室性心律失常，Cx43表達完全喪失的小鼠則可導(dǎo)致右室流出道梗阻和圍產(chǎn)期死亡。此外，Cx43與HSP90(與心肌細胞凋亡有關(guān))之間有交互作用[11]。由于心肌細胞的傳導(dǎo)速度部分是由縫隙連接的功能完整性決定的，Cx43的分布不均衡可能會導(dǎo)致傳導(dǎo)速度的異質(zhì)性，這有利于折返形成從而導(dǎo)致心律失常。本實驗發(fā)現(xiàn)沉默HL-1細胞的DSP基因，不僅使Cx43蛋白出現(xiàn)再分布，而且影響其組成的縫隙連接功能。本研究首次證明了DSP蛋白的表達抑制與Cx43的再分布及細胞間通訊傳導(dǎo)功能異常有關(guān)。

Figure 3. Western blotting for DSP and Cx43 expression in HL-1 cells treated for 48 and 120 h with siRNA-DSP, non-targeting siRNA (control), or without any siRNA (non-treatment).Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3Westernblotting檢測各組細胞DSP和Cx43蛋白的表達

Figure 4. Scrape loading and dye transfer analysis of the coupling between cultured HL-1 cells(×400).A:non-treatment;B:siNA-DSP-control;C:siRNA-DSP.

圖4熒光顯微鏡下觀察LuciferYellow通過HL-1細胞縫隙連接的傳輸情況(5min)

DSP在維持橋粒結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性中起著重要作用，其由3部分組成：球狀頭部、螺旋狀的中間部分和尾部。球狀頭部與其它橋粒蛋白如PKP2和PG相連，在蛋白之間相互作用方面起著關(guān)鍵作用。在敲除DSP蛋白球狀頭部的轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn)心肌細胞凋亡、纖維化和脂肪累積，同時心室腔擴大[12]，這與人類ARVC的表現(xiàn)一致。目前有關(guān)DSP與Cx43相互作用的研究很少，Czyz等[11]發(fā)現(xiàn) Cx43與PKP2共同存在一個大分子的復(fù)合物中，而在Carvajal綜合征的患者中證實DSP基因突變可能會導(dǎo)致DSP與其它蛋白如PKP2和PG之間的相互作用發(fā)生改變，盡管需要進一步的研究來證實，但由此可以推論PKP2是連接DSP與Cx43的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，DSP與Cx43也可能存在于一個大分子復(fù)合物中，它們共同維持著心肌閏盤結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定。

本實驗用免疫熒光技術(shù)證實在HL-1細胞中DSP和Cx43能共定位，但如果DSP表達下調(diào)，這種共定位特征就會喪失，Cx43出現(xiàn)再分布，并在HL-1細胞內(nèi)檢測到Cx43信號。目前尚不清楚在細胞內(nèi)的Cx43其成分是否與位于縫隙連接的成分一致，細胞內(nèi)的Cx43與其它閏盤結(jié)構(gòu)成分的關(guān)系如何并不得而知，而且在心肌細胞中Cx43有磷酸化和非磷酸化結(jié)構(gòu)，兩者與DSP的關(guān)系如何也尚不明確，因此這需要進一步的研究來闡明DSP與Cx43兩者的關(guān)系。

本實驗采用劃痕標記染料示蹤技術(shù)檢測細胞縫隙連接通訊狀況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默HL-1細胞DSP基因，Lucifer Yellow通過縫隙連接的傳輸功能降低，提示DSP表達抑制不僅使Cx43出現(xiàn)再分布，而且影響其傳導(dǎo)功能。雖然目前尚不能明確縫隙連接傳導(dǎo)功能的破壞就一定會導(dǎo)致心律失常，但既往的研究表明Cx43的結(jié)構(gòu)受損會導(dǎo)致傳導(dǎo)速度減慢，如在缺血情況下就會導(dǎo)致心律失常[13]?？p隙連接不僅是電傳導(dǎo)的主要結(jié)構(gòu)，而且還具有分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能[14]，其結(jié)構(gòu)和功能的完整性在維持心肌細胞整體平衡方面起著重要作用，如遭到破壞可能會導(dǎo)致心肌細胞凋亡和纖維化。動物模型的研究證實室壁心肌復(fù)極時間和不應(yīng)期離散度與心律失常發(fā)生有關(guān)[15]。本研究只是對縫隙連接功能的初步探索，而位于心肌細胞閏盤結(jié)構(gòu)的離子通道是否也有改變則需要進一步研究證實。

Cx43可能參與了ARVC發(fā)病機制的多個環(huán)節(jié)：縫隙連接的結(jié)構(gòu)破壞、電偶聯(lián)機制的喪失和影響Wnt/β-caternin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。本研究證實了DSP的表達抑制使Cx43再分布，縫隙連接的轉(zhuǎn)導(dǎo)功能受損，因此對Cx43在ARVC中致病作用的研究需要進一步的探索。

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Inhibitionofdesmoplakinexpressioninducesconnexin43remodelinginmouseHL-1myocardialcells

ZHANG Qian-huan, DENG Chun-yu, RAO Fang, LIU Xiao-ying, MAI Li-ping, ZHU Jie-ning, TAN Hong-hong, WU shu-lin

(DepartmentofCardiology,GuangdongGeneralHospital,GuangdongCardiovascularInstitute,Guangzhou510100,China.E-mail:wushulind@gmail.com)

AIM: To evaluate the content, distribution, and function of connexin 43 (Cx43) gap junctions in mouse HL-1 myocardial cells under the condition of desmoplakin (DSP) silencing.METHODSThe technique of RNA interference was used to inhibit the protein expression of DSP in HL-1 cells. The protein expression of DSP and Cx43 was analyzed by Western blotting and flow cytometry. The immunofluorescence staining was used to detect the distribution and co-localization of DSP and Cx43. The techniques of scrape loading and dye transfer were also used to determine the function of Cx43 gap junctions.RESULTSCompared with non-treatment group and negative control group, the protein expression of DSP and Cx43 was reduced (P<0.05). Co-localization to the site of cell-cell contact was apparent in untreated and control conditions, but loss of DSP expression induced by siRNA-DSP correlated with a drastic redistribution of Cx43. Instead, Cx43 was found mostly within the intracellular space. The results of dye transfer assay indicated a significant decrease in the function of Cx43 gap junctions of the cells treated with siRNA-DSP.CONCLUSIONInhibition of DSP expression induces redistribution of Cx43 and decrease in dye coupling between cells.

Connexin 43; Desmoplakin; Gene silencing; HL-1 cells

R542.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.004

1000- 4718(2013)06- 0982- 06

2013- 03- 22

2013- 05- 15

廣東省自然科學(xué)基金資助項目(No. 10151008002000011)

△通訊作者 Tel: 020-83827812; E-mail: wushulind@gmail.com