• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    沉默Notch1基因促進(jìn)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞JNK1和p53磷酸化*

    2013-10-24 08:22:45陳旭東范文娟楊旭光王建國
    中國病理生理雜志 2013年6期
    關(guān)鍵詞:膜電位磷酸化線粒體

    袁 磊, 陳旭東, 范文娟, 楊旭光, 王建國

    (漯河醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校,河南 漯河 462002)

    沉默Notch1基因促進(jìn)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞JNK1和p53磷酸化*

    袁 磊, 陳旭東, 范文娟, 楊旭光, 王建國△

    (漯河醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校,河南 漯河 462002)

    目的探究沉默Notch1基因?qū)θ巳橄侔㎝CF-7細(xì)胞JNK1和p53磷酸化的影響。方法選取人乳腺癌MCF-7細(xì)胞作為研究對象,構(gòu)建shRNA-Notch1真核表達(dá)質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞使Notch1基因沉默。采用Western blotting方法檢測MCF-7細(xì)胞Notch1、Hes-1、PUMA和NOXA蛋白的表達(dá),JNK1和p53蛋白磷酸化水平以及caspase-3活化水平的改變。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和線粒體膜電位的變化。結(jié)果人乳腺癌MCF-7細(xì)胞Notch1基因被沉默后,Notch1和Hes-1蛋白表達(dá)量明顯減少(P<0.01),細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01),JNK1和p53的磷酸化水平明顯高于對照組(P<0.01),PUMA和NOXA表達(dá)量顯著升高(P<0.05),cleaved caspase-3蛋白明顯多于對照組(P<0.01),線粒體膜電位明顯下降(P<0.05)。結(jié)論沉默Notch1基因可能通過激活JNK1信號通路活化p53,促進(jìn)PUMA和NOXA蛋白表達(dá),進(jìn)而通過線粒體途徑導(dǎo)致人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡。

    Notch1蛋白; 短發(fā)夾RNA; JNK1蛋白; p53蛋白; MCF-7細(xì)胞

    近年來,在果蠅發(fā)育的研究中,發(fā)現(xiàn)了一條在細(xì)胞間傳導(dǎo)相互作用的信號途徑,稱為Notch信號途徑。隨后證實(shí)該信號途徑廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物體內(nèi),并且在進(jìn)化過程中高度保守。Notch信號途徑的激活始于Notch受體胞外區(qū)與相鄰細(xì)胞表面的Notch配體胞外區(qū)的結(jié)合。脊椎動物Notch配體分為Delta和Jagged 2個(gè)家族,人的Notch配體有Delta-1、-3、-4和Jagged-1、-2,人的Notch受體家族有4個(gè)成員(Notch1~4)。Notch信號途徑不僅影響著胚胎發(fā)育、血管發(fā)生、程序性細(xì)胞死亡和細(xì)胞增殖等多種生理過程[1-5],在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡、增殖和血管生成等病理過程中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用[6-7]。本研究通過構(gòu)建shRNA-Notch1真核表達(dá)質(zhì)粒以探究沉默Notch1基因?qū)θ巳橄侔㎝CF-7細(xì)胞凋亡的影響及其分子機(jī)制。

    材 料 和 方 法

    1材料

    MCF-7細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫,大腸桿菌菌株DH5α由本校分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco;pRS質(zhì)粒載體購自O(shè)rigene;質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京天根公司;限制性核酸內(nèi)切酶BamH I、Hind III、XhoI和T4 DNA連接酶購自TaKaRa;脂質(zhì)體Lipofectamine 2000和Annexin V/PI檢測凋亡試劑盒購自Invitrogen; Notch1、Hes-1、p-JNK(Thr183/Tyr185)、p-p53(Ser15)、PUMA(p53-upregulated modulator of apoptosis)、NOXA、cleaved caspase-3和β-actin抗體購自Santa Cruz;Rhodamine123購自Sigma;Notch1特異性DNA干擾序列由大連寶生物公司合成。

    2方法

    2.1設(shè)計(jì)shRNA靶序列 利用NCBI數(shù)據(jù)庫檢索人Notch1 mRNA序列(GenBank Accession:NM_017617),根據(jù)shRNA設(shè)計(jì)原則,使用Invitrogen公司在線設(shè)計(jì)軟件針對Notch1編碼區(qū)(2 015~2 035)設(shè)計(jì)特異性靶序列,另設(shè)計(jì)一條由Notch1特異性靶序列隨機(jī)重排而成的序列作為陰性對照,經(jīng)BLAST比對分析與人類基因編碼序列無同源性。shRNA設(shè)計(jì)模板采用BamH I+Sense+Loop+Antisense+終止序列+XhoI+HindIII(其中Loop: 5’-TTCAAGAGA-3’, 終止序列: TTTTTT),具體序列見表1,下劃線部分為靶序列,由大連寶生物公司合成。

    表1 shRNA干擾序列

    2.2構(gòu)建pRS-shRNA表達(dá)質(zhì)粒 將pRS空質(zhì)粒于37 ℃用限制性核酸內(nèi)切酶BamH I和HindIII酶切過夜,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后,采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收。將合成的shRNA模板單鏈進(jìn)行退火處理形成雙鏈,然后與雙酶切后的線性化載體于16 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含ampicillin抗性的LB平板上,37 ℃培養(yǎng)過夜,挑取單克隆菌落,置于含有ampicillin抗性的LB培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min過夜。收集菌液,采用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。

    2.3重組質(zhì)粒的鑒定 提取的質(zhì)粒用XhoI做酶切鑒定??召|(zhì)粒pRS的DNA序列中不存在XhoI的酶切位點(diǎn),而在插入的shRNA片段中,我們加入了1個(gè)XhoI的酶切位點(diǎn)。若重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,就能被XhoI酶切。對酶切鑒定正確的質(zhì)粒送大連寶生物公司測序。鑒定正確的質(zhì)粒分別命名為pRS-Notch1和pRS-non。

    2.4細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞,每隔48 h更換1次細(xì)胞培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)80%以上時(shí)換為不含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。將重組質(zhì)粒pRS-Notch1和pRS-non分別轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞,轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamine 2000操作說明書進(jìn)行,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后用PBS洗去轉(zhuǎn)染試劑,加入新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染分組:(1)shControl組:轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pRS-non;(2)shNotch1組:轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pRS-Notch1。

    2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 制備各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞懸液,用PBS洗滌細(xì)胞2次,加入結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞,加入Annexin V-FITC輕輕混勻后于4 ℃避光孵育10 min。800 r/min離心5 min,棄上清,重懸細(xì)胞于結(jié)合緩沖液中,加入PI染色液輕輕混勻后于4 ℃避光孵育5 min,送流式細(xì)胞儀檢測。

    2.6Western blotting檢測蛋白水平 裂解各組細(xì)胞提取總蛋白,用BCA法定量后,進(jìn)行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。封閉液(5%BSA/TBST)封閉1 h,加入Ⅰ抗(1∶1 000稀釋),4 ℃孵育過夜,TBST洗膜3次,加入Ⅱ抗(1∶1 000稀釋)室溫下孵育1 h,TBST洗膜3次,加入ECL進(jìn)行發(fā)光反應(yīng),壓片、顯影、定影,觀察蛋白印記,運(yùn)用ImageJ軟件測定各蛋白條帶灰度值。

    2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜電位 羅丹明123(rhodamine 123, Rh123)是一種可以通過細(xì)胞膜的選擇性染色活細(xì)胞線粒體的熒光染料,細(xì)胞內(nèi)Rh123的平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity, MFI)與線粒體跨膜電位呈正相關(guān)。制備各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞懸液,用PBS洗滌細(xì)胞2次,重懸細(xì)胞于培養(yǎng)基中,加入Rh123(終濃度為5 mg/L),37 ℃孵育箱中放置30 min,再用細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次,送流式細(xì)胞儀檢測。

    3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1pRS-shRNA重組質(zhì)粒的鑒定

    將重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒分別用XhoI進(jìn)行單酶切鑒定??召|(zhì)粒pRS因其序列中無XhoI的酶切位點(diǎn)而不能被XhoI酶切;但在重組質(zhì)粒pRS-Notch1和pRS-non的序列中插入了XhoI的酶切位點(diǎn),可被XhoI酶切,酶切產(chǎn)生的線狀DNA因空間位阻較環(huán)狀質(zhì)粒大導(dǎo)致電泳速度慢于環(huán)狀質(zhì)粒。對酶切鑒定正確的質(zhì)粒測序, 經(jīng)過比對,2個(gè)重組質(zhì)粒中含有目的shRNA片段,表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,見圖1。

    Figure 1. Single restriction endonuclease digestion of pRS-Notch1 and pRS-non. M: 1 kb DNA marker; 1~3: pRS, pRS-Notch1 and pRS-non without digestion,respectively; 4~6: pRS, pRS-Notch1 and pRS-non digested byXhoI,respectively.

    圖1重組質(zhì)粒pRS-Notch1和pRS-non的單酶切鑒定

    2shRNA干擾對Notch1和Hes-1蛋白表達(dá)的影響

    Western blotting結(jié)果顯示,shNotch1組Notch1/β-actin灰度比顯著低于shControl組(P<0.01)。Hes-1基因是Notch1的主要下游基因之一,當(dāng)shNotch1組Notch1蛋白表達(dá)被抑制后,該組Hes-1蛋白表達(dá)較shControl組明顯下降(P<0.01),這表明Notch1信號途徑受到明顯抑制,見圖2。

    Figure 2. Expression of Notch1 and Hes-1 proteins in human breast cancer MCF-7 cells after pRS-non/pRS-Notch1 transfection. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsshControl group.

    圖2pRS-non/pRS-Notch1轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后Notch1和Hes-1蛋白的表達(dá)

    3沉默Notch1基因?qū)?xì)胞凋亡的影響

    流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,shNotch1組MCF-7細(xì)胞凋亡率為23.8%±1.7%,較shControl組(2.1%±0.5%)顯著升高(P<0.01),見圖3。

    4沉默Notch1基因?qū)NK1和p53磷酸化的影響

    shNotch1組p-JNK1/β-actin和p-p53/β-actin的灰度比分別為1.050 3±0.071 2和0.830 2±0.063 5,均顯著高于shControl組(P<0.05),見圖4。

    5沉默Notch1基因?qū)UMA、NOXA和cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)的影響

    shNotch1組PUMA/β-actin、NOXA/β-actin和cleaved caspase-3/β-actin的灰度比分別為0.827 1±0.070 8、1.737 6±0.096 3和1.234 1±0.078 2,均顯著高于shControl組,(P<0.05),見圖5。

    Figure 3. Effect ofNotch1 silencing on apoptosis of MCF-7 cells detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsshControl group.

    圖3流式細(xì)胞術(shù)檢測沉默Notch1對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

    Figure 4. Effect ofNotch1 silencing on phosphorylations of JNK1 and p53 in MCF-7 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsshControl group.

    圖4沉默Notch1對MCF-7細(xì)胞JNK1和p53磷酸化的影響

    Figure 5. Effect ofNotch1 silencing on the protein levels of PUMA,NOXA and cleaved caspase-3 in MCF-7 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsshControl group.

    圖5沉默Notch1對MCF-7細(xì)胞PUMA、NOXA和cleavedcaspase-3蛋白水平的影響

    6沉默Notch1基因?qū)€粒體膜電位的影響

    流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,shControl組的FI為5 576±410,以此為對照,沉默Notch1基因后MCF-7細(xì)胞的FI降為4 332±338 (P<0.05),表明抑制Notch1蛋白表達(dá)可引起MCF-7細(xì)胞線粒體膜電位下降,見圖6。

    Figure 6. Effect ofNotch1 silencing on mitochondrial membrane potential of MCF-7 cells detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsshControl group.

    圖6流式細(xì)胞術(shù)檢測沉默Notch1基因?qū)CF-7細(xì)胞線粒體膜電位的影響

    討 論

    Notch1單鏈前體(300 kD)首先在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成,運(yùn)輸至高爾基體后被Furin 樣轉(zhuǎn)化酶切割成含胞外區(qū)的N端片段(180 kD)與含跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的C端片段(120 kD),兩者通過非共價(jià)鍵結(jié)合為異源二聚體后被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜。當(dāng)Notch與相鄰細(xì)胞表面的配體結(jié)合后,Notch1相繼發(fā)生2次蛋白水解。先由ADAM10/Kuz或ADAM17/TACE酶切其C端片段的胞外部分產(chǎn)生Notch1胞外截短體(Notch extracellular truncation, NEXT),再由γ-促分泌酶復(fù)合體酶切NEXT釋放Notch1胞內(nèi)段 (Notch intracellular domain,NICD),NICD進(jìn)入細(xì)胞核與CSL [CBF1/Su(H)/LAG1]結(jié)合[8]。CSL蛋白是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子,在哺乳動物中又被稱為C-啟動子結(jié)合因子1 (C-promoter binding factor 1, CBF1)或轉(zhuǎn)錄因子重組信號結(jié)合蛋白 Jκ (recombination signal binding protein-Jκ, RBP-Jκ)。沒有NICD存在時(shí),CSL與Notch1靶基因啟動子結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)錄,當(dāng)NICD與CSL結(jié)合并募集Mastermind組成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體后,CSL由轉(zhuǎn)錄抑制因子轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)錄激活因子,激活Notch1靶基因的轉(zhuǎn)錄,如Hes-1、Hey-1、CDK8和CCND1等[9]。

    本研究針對Notch1的開放讀碼框設(shè)計(jì)了特異性的shRNA干擾序列,以此構(gòu)建的重組質(zhì)粒pRS-Notch1在轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF-7細(xì)胞后有效抑制了Notch1基因的表達(dá)。為進(jìn)一步明確Notch1信號通路是否被有效抑制,我們檢測了Notch1信號通路的特異性靶基因Hes-1的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,隨著Notch1蛋白表達(dá)的抑制,Hes-1蛋白的表達(dá)顯著降低,這表明重組質(zhì)粒pRS-Notch1能夠有效沉默Notch1基因和抑制Notch1信號通路。

    抑制Notch1信號通路可促進(jìn)多種細(xì)胞發(fā)生凋亡,然而在不同的細(xì)胞環(huán)境中,分子機(jī)制不盡相同。運(yùn)用γ-分泌酶抑制劑(γ-secretase inhibitor,GSI)阻斷Notch信號通路可下調(diào)骨髓瘤細(xì)胞Akt、Bcl-2和Bcl-xL蛋白的表達(dá)[10];通過siRNA沉默前列腺癌細(xì)胞Notch1基因可抑制Akt和轉(zhuǎn)錄因子FoxM1的表達(dá)[11],下調(diào)Bcl-2蛋白和上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)[12]。在轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞中通過下調(diào)Notch1或Jagged1蛋白的表達(dá)抑制Notch1信號通路后,Akt和mTOR蛋白的表達(dá)均受到抑制,同時(shí)NF-κB信號通路及其下游蛋白MMP-9、VEGF和uPA的表達(dá)也均受到抑制[7]。

    本研究發(fā)現(xiàn),沉默乳腺癌MCF-7細(xì)胞Notch1基因可促進(jìn)JNK1和p53的磷酸化。這可能是由于Notch1信號通路活化產(chǎn)生的NICD可與JNK1競爭結(jié)合JNK相互作用蛋白1(JNK-interacting protein 1, JIP1),從而干擾了JIP1-JNK1信號通路的活化[13],沉默Notch1基因后,解除了NICD對JIP1-JNK1信號通路的抑制,促進(jìn)了JNK1的磷酸化。JNK1激活后可磷酸化p53使之活性增強(qiáng)[14]。在人肝癌HepG2細(xì)胞中,DNA損傷可引起p53蛋白磷酸化(Ser15), PUMA、NOXA、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)增多,繼而促使細(xì)胞色素C和Smac/DIABLO蛋白從線粒體膜間腔釋放至胞漿,激活caspase-9和caspase-3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15]。

    BH3-only蛋白PUMA和NOXA為p53的下游蛋白,可與Bcl-2蛋白家族中抗凋亡蛋白結(jié)合,促進(jìn)Bax的活化,活化的Bax可插入線粒體外膜并寡聚成孔道,也可與線粒體外膜中的電壓依賴性陰離子通道 (voltage-dependent anion channel, VDAC)結(jié)合引起線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔 (mitochondrial permeability transition pore, MPTP)的持續(xù)開放,進(jìn)而引起線粒體外膜通透化 (mitochondrial outer membrane permeabilization, MOMP)和線粒體膜電位消散,釋放線粒體膜間腔中的促凋亡蛋白,激活半胱天冬酶(caspase),最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn),在沉默乳腺癌MCF-7細(xì)胞Notch1基因后,隨著p53蛋白磷酸化水平的升高,PUMA和NOXA蛋白的表達(dá)明顯增強(qiáng),進(jìn)而導(dǎo)致線粒體膜電位降低和caspase-3活化。

    [1] Fernandez-Valdivia R, Takeuchi H, Samarghandi A,et al. Regulation of mammalian Notch signaling and embryonic development by the proteinO-glucosyltransferase Rumi[J]. Development, 2011, 138(10):1925-1934.

    [2] Gianni-Barrera R, Trani M, Reginato S,et al. To sprout or to split? VEGF, Notch and vascular morphogenesis[J]. Biochem Soc Trans, 2011, 39(6):1644-1648.

    [3] Yalcin-Ozuysal ?, Fiche M, Guitierrez M,et al. Antagonistic roles of Notch and p63 in controlling mammary epithelial cell fates[J]. Cell Death Differ, 2010, 17(10):1600-1612.

    [4] Monahan P, Rybak S, Raetzman LT. The Notch target geneHes1 regulates cell cycle inhibitor expression in the developing pituitary[J]. Endocrinology, 2009, 150(9):4386-4394.

    [5] 郭 亞, 趙能江, 林 玲,等.Notch1基因?qū)θ四z質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖和周期的影響[J].中國病理生理雜志, 2010, 26(6):1115-1119.

    [6] Garcia A, Kandel JJ. Notch: a key regulator of tumor angiogenesis and metastasis[J]. Histol Histopathol, 2012, 27(2):151-156.

    [7] Wang Z, Li Y, Banerjee S,et al. Down-regulation of Notch-1 and Jagged-1 inhibits prostate cancer cell growth, migration and invasion, and induces apoptosis via inactivation of Akt, mTOR, and NF-κB signaling pathways[J]. J Cell Biochem, 2010, 109(4):726-736.

    [8] Fortini ME. Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation[J]. Dev Cell, 2009, 16(5): 633-647.

    [9] Ranganathan P, Weaver KL, Capobianco AJ,et al. Notch signalling in solid tumours: a little bit of everything but not all the time[J]. Nat Rev Cancer, 2011, 11(5):338-351.

    [10] Nefedova Y, Sullivan DM, Bolick SC,et al. Inhibition of Notch signaling induces apoptosis of myeloma cells and enhances sensitivity to chemotherapy[J]. Blood, 2008, 111(4):2220-2229.

    [11] Wang Z, Li Y, Ahmad A,et al. Down-regulation of Notch-1 is associated with Akt and FoxM1 in inducing cell growth inhibition and apoptosis in prostate cancer cells[J]. J Cell Biochem, 2011, 112(1):78-88.

    [12] Ye QF, Zhang YC, Peng XQ,et al. Silencing Notch-1 induces apoptosis and increases the chemosensitivity of prostate cancer cells to docetaxel through Bcl-2 and Bax[J]. Oncol Lett, 2012, 3(4): 879-884.

    [13] Kim MY, Ann EJ, Mo JS,et al. JIP1 binding to RBP-Jκ mediates cross-talk between the Notch1 and JIP1-JNK signaling pathway[J]. Cell Death Differ, 2010, 17(11):1728-1738.

    [14] Fan S, Qi M, Yu Y,et al. P53 activation plays a crucial role in silibinin induced ROS generation via PUMA and JNK[J]. Free Radic Res, 2012, 46(3):310-319.

    [15] Yang G, Zhou X, Wang J,et al. MEHP-induced oxidative DNA damage and apoptosis in HepG2 cells correlates with p53-mediated mitochondria-dependent signaling pathway[J]. Food Chem Toxicol, 2012, 50(7):2424-2431.

    [16] Chipuk JE, Moldoveanu T, Llambi F,et al. The BCL-2 family reunion[J]. Mol Cell, 2010, 37(3): 299-310.

    [17] Whelan RS, Konstantinidis K, Wei AC,et al. Bax regulates primary necrosis through mitochondrial dynamics[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012, 109(17):6566-6571.

    Notch-1genesilencingpromotesphosphorylationsofJNK1andp53inhumanbreastcancerMCF-7cells

    YUAN Lei, CHEN Xu-dong, FAN Wen-juan, YANG Xu-guang, WANG Jian-guo

    (LuoheMedicalCollege,Luohe462002,China.E-mail:wr0395@sina.com)

    AIM: To investigate the effect ofNotch1 gene silencing on phosphorylations of JNK1 and p53 in human breast cancer MCF-7 cells.METHODSshRNA-Notch1 eukaryotic expression plasmid was constructed and transfected into MCF-7 cells. The expression of Notch1 and Hes-1 was observed by Western blotting after transfction. Apoptosis and mitochondrial membrane potential were detected by flow cytometry. Western blotting was also used to determine the protein levels of p-JNK1, p-p53, PUMA, NOXA and cleaved caspase-3 afterNotch1 silencing was performed in MCF-7 cells.RESULTSSilencing ofNotch1 significantly reduced the expression of Notch1 and Hes-1 in MCF-7 cells (P<0.01). In shNotch1 group, the number of apoptotic cells was much higher (P<0.01) and mitochondrial membrane potential was much lower (P<0.05) than those in shControl group. The protein levels of p-JNK1, p-p53, PUMA, NOXA and cleaved caspase-3 increased obviously after silencing ofNotch1 was performed in MCF-7 cells (P<0.05).CONCLUSIONNotch1 silencing induces apoptosis of human breast cancer MCF-7 cells through promoting phosphorylations of JNK1 and p53, and increasing the production of PUMA, NOXA and cleaved caspase-3.

    Notch1 protein; Short hairpin RNA; JNK1 protein; p53 protein; MCF-7 cells

    R737.9

    A

    10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.010

    1000- 4718(2013)06- 1014- 06

    2012- 12- 31

    2013- 04- 02

    河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目(No.122300410277);漯河醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)??蒲谢鹳Y助項(xiàng)目(No.2010-S10)

    △通訊作者 Tel: 0395-2112681; E-mail: wr0395@sina.com

    猜你喜歡
    膜電位磷酸化線粒體
    有關(guān)動作電位的“4坐標(biāo)2比較”
    參芪復(fù)方對GK大鼠骨骼肌線粒體膜電位及相關(guān)促凋亡蛋白的影響研究
    棘皮動物線粒體基因組研究進(jìn)展
    線粒體自噬與帕金森病的研究進(jìn)展
    ITSN1蛋白磷酸化的研究進(jìn)展
    MAPK抑制因子對HSC中Smad2/3磷酸化及Smad4核轉(zhuǎn)位的影響
    魚藤酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡及線粒體膜電位變化
    NF-κB介導(dǎo)線粒體依賴的神經(jīng)細(xì)胞凋亡途徑
    組蛋白磷酸化修飾與精子發(fā)生
    遺傳(2014年3期)2014-02-28 20:59:01
    紅細(xì)胞膜電位的光學(xué)測定方法
    人成视频在线观看免费观看| 91精品国产国语对白视频| 欧美在线一区亚洲| 久久精品国产清高在天天线| 此物有八面人人有两片| 中文字幕精品免费在线观看视频| 成人欧美大片| 多毛熟女@视频| a级毛片在线看网站| 999久久久精品免费观看国产| 不卡av一区二区三区| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 国产野战对白在线观看| 国产精品日韩av在线免费观看 | 亚洲精品国产一区二区精华液| 精品欧美一区二区三区在线| 级片在线观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 日韩精品青青久久久久久| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产片内射在线| 精品高清国产在线一区| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲成人国产一区在线观看| av超薄肉色丝袜交足视频| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 午夜福利视频1000在线观看 | 精品久久蜜臀av无| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 18禁美女被吸乳视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 亚洲精品一区av在线观看| 身体一侧抽搐| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 成人国语在线视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 制服诱惑二区| 亚洲在线自拍视频| 国产精品亚洲美女久久久| 身体一侧抽搐| 深夜精品福利| 国产国语露脸激情在线看| 伦理电影免费视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 午夜影院日韩av| 一二三四社区在线视频社区8| 久久久久久大精品| 亚洲人成伊人成综合网2020| 在线观看免费午夜福利视频| 黄频高清免费视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲成人精品中文字幕电影| 老司机靠b影院| 亚洲五月色婷婷综合| 国产激情欧美一区二区| 伦理电影免费视频| 可以在线观看的亚洲视频| av超薄肉色丝袜交足视频| 丝袜美腿诱惑在线| 88av欧美| 日韩欧美一区视频在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产视频一区二区在线看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲一区二区三区不卡视频| 怎么达到女性高潮| 最新美女视频免费是黄的| 正在播放国产对白刺激| 曰老女人黄片| 免费少妇av软件| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 最近最新免费中文字幕在线| 久久久国产成人精品二区| 亚洲精品av麻豆狂野| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲精品一区av在线观看| 一a级毛片在线观看| 国产成人精品在线电影| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 欧美久久黑人一区二区| 国产视频一区二区在线看| 午夜a级毛片| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 丁香六月欧美| 999久久久国产精品视频| 亚洲,欧美精品.| 两个人视频免费观看高清| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 91大片在线观看| 动漫黄色视频在线观看| 宅男免费午夜| 18美女黄网站色大片免费观看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 精品国产国语对白av| 美女国产高潮福利片在线看| 老汉色∧v一级毛片| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 一区二区日韩欧美中文字幕| 精品乱码久久久久久99久播| 男女之事视频高清在线观看| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 91麻豆精品激情在线观看国产| 久久久久久国产a免费观看| 久久性视频一级片| 久久久久久久久免费视频了| av免费在线观看网站| 在线视频色国产色| 日本免费a在线| 精品国产一区二区久久| 男男h啪啪无遮挡| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产精品日韩av在线免费观看 | 看黄色毛片网站| 波多野结衣高清无吗| or卡值多少钱| x7x7x7水蜜桃| 欧美激情久久久久久爽电影 | 欧美另类亚洲清纯唯美| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 久久婷婷成人综合色麻豆| 久久中文看片网| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 国产精品野战在线观看| 色哟哟哟哟哟哟| 午夜福利欧美成人| 叶爱在线成人免费视频播放| 级片在线观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 99热只有精品国产| 国产熟女午夜一区二区三区| 正在播放国产对白刺激| 韩国精品一区二区三区| 成在线人永久免费视频| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产精品亚洲av一区麻豆| 99国产精品99久久久久| 国产精品影院久久| 久久亚洲真实| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 老鸭窝网址在线观看| 免费搜索国产男女视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 一级黄色大片毛片| 日韩欧美三级三区| 成人亚洲精品一区在线观看| 无人区码免费观看不卡| 欧美性长视频在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 久久久久久久精品吃奶| 高清在线国产一区| 国产成+人综合+亚洲专区| 精品国产亚洲在线| 久久国产精品人妻蜜桃| 美女 人体艺术 gogo| 国产亚洲欧美在线一区二区| 黄色视频不卡| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲熟妇熟女久久| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲精华国产精华精| 一区在线观看完整版| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 中文字幕最新亚洲高清| 中文字幕高清在线视频| 波多野结衣巨乳人妻| 韩国av一区二区三区四区| 午夜免费鲁丝| 色播在线永久视频| 亚洲一区中文字幕在线| 黄色成人免费大全| 老汉色∧v一级毛片| 神马国产精品三级电影在线观看 | 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲成人久久性| 18禁观看日本| 波多野结衣高清无吗| 宅男免费午夜| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 久久伊人香网站| 九色亚洲精品在线播放| 午夜福利,免费看| 成年人黄色毛片网站| 91国产中文字幕| 精品国产乱子伦一区二区三区| 纯流量卡能插随身wifi吗| 88av欧美| 亚洲男人的天堂狠狠| 在线观看免费视频日本深夜| 丝袜美腿诱惑在线| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 丁香欧美五月| 国产成人精品无人区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 手机成人av网站| 午夜免费观看网址| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 不卡一级毛片| 国产亚洲欧美在线一区二区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲人成77777在线视频| 一二三四社区在线视频社区8| 午夜免费鲁丝| 精品电影一区二区在线| 1024视频免费在线观看| 色综合婷婷激情| 午夜福利一区二区在线看| 久久精品成人免费网站| 精品一区二区三区av网在线观看| 搡老岳熟女国产| 天天添夜夜摸| 欧美久久黑人一区二区| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产1区2区3区精品| 亚洲 国产 在线| 久久精品成人免费网站| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| av电影中文网址| 黄片小视频在线播放| 欧美成人性av电影在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 波多野结衣高清无吗| 国产精品久久视频播放| av片东京热男人的天堂| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲成av人片免费观看| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲熟女毛片儿| 啦啦啦免费观看视频1| 国产精品国产高清国产av| 亚洲中文日韩欧美视频| 91成人精品电影| 男女下面插进去视频免费观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 最近最新中文字幕大全电影3 | 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲精品中文字幕在线视频| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 12—13女人毛片做爰片一| 大陆偷拍与自拍| 欧美久久黑人一区二区| 97碰自拍视频| 久久久国产精品麻豆| 国产精品九九99| 久久久久亚洲av毛片大全| 村上凉子中文字幕在线| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 亚洲视频免费观看视频| 1024视频免费在线观看| 日本三级黄在线观看| 精品久久久久久久久久免费视频| av电影中文网址| 国产精品影院久久| 性色av乱码一区二区三区2| 午夜精品国产一区二区电影| 国产精品九九99| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 欧美大码av| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲成a人片在线一区二区| 欧美精品亚洲一区二区| 一个人免费在线观看的高清视频| 一级毛片女人18水好多| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 男人操女人黄网站| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 一级黄色大片毛片| АⅤ资源中文在线天堂| 色av中文字幕| 一区二区三区高清视频在线| 丝袜美腿诱惑在线| 成人18禁在线播放| 18禁观看日本| 脱女人内裤的视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产成人精品在线电影| 男男h啪啪无遮挡| 99精品欧美一区二区三区四区| √禁漫天堂资源中文www| 韩国精品一区二区三区| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 在线观看www视频免费| 欧美在线一区亚洲| 99国产精品一区二区三区| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产精品久久久人人做人人爽| 99久久综合精品五月天人人| 国产男靠女视频免费网站| 操出白浆在线播放| 18禁观看日本| 人人妻人人澡人人看| 亚洲精品国产区一区二| 国产精华一区二区三区| 老司机深夜福利视频在线观看| 女性生殖器流出的白浆| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 在线观看www视频免费| 亚洲五月天丁香| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 成人亚洲精品一区在线观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av | 国产激情久久老熟女| 亚洲美女黄片视频| av片东京热男人的天堂| 91成人精品电影| 亚洲人成伊人成综合网2020| 午夜免费成人在线视频| 欧美色欧美亚洲另类二区 | 亚洲avbb在线观看| 在线观看免费视频网站a站| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产av在哪里看| 在线观看日韩欧美| 亚洲精品中文字幕在线视频| 99在线视频只有这里精品首页| 在线观看免费视频日本深夜| 高清毛片免费观看视频网站| 国产亚洲av高清不卡| 国产成人精品无人区| 搞女人的毛片| 精品免费久久久久久久清纯| 欧美乱色亚洲激情| 免费观看人在逋| 午夜日韩欧美国产| or卡值多少钱| 国产亚洲精品一区二区www| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 中文字幕高清在线视频| 黑丝袜美女国产一区| 国产成人免费无遮挡视频| 91精品三级在线观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 欧美黄色片欧美黄色片| 9色porny在线观看| 亚洲视频免费观看视频| 9色porny在线观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 色老头精品视频在线观看| 国产伦人伦偷精品视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲国产精品成人综合色| 99国产精品一区二区三区| 香蕉丝袜av| 黑人操中国人逼视频| 国产精品日韩av在线免费观看 | 久久人妻福利社区极品人妻图片| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产单亲对白刺激| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产一卡二卡三卡精品| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产一区二区激情短视频| 欧美最黄视频在线播放免费| 久久久国产精品麻豆| 一区二区三区国产精品乱码| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲国产精品合色在线| 国产精品久久视频播放| 久久精品91蜜桃| 99riav亚洲国产免费| 久久国产精品影院| 久久久久九九精品影院| 日韩中文字幕欧美一区二区| 久久香蕉激情| 自线自在国产av| 男人的好看免费观看在线视频 | 国产精品永久免费网站| 国产精品98久久久久久宅男小说| 久久久精品欧美日韩精品| 国产精品一区二区免费欧美| 色综合亚洲欧美另类图片| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 一级黄色大片毛片| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产一区二区三区视频了| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 身体一侧抽搐| 精品无人区乱码1区二区| 免费看a级黄色片| 国产成人欧美在线观看| 久久亚洲精品不卡| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产黄a三级三级三级人| 窝窝影院91人妻| 午夜福利免费观看在线| 亚洲一区二区三区不卡视频| 大型av网站在线播放| 亚洲av五月六月丁香网| 久久久久国内视频| 少妇粗大呻吟视频| 女人精品久久久久毛片| 在线观看免费视频网站a站| 正在播放国产对白刺激| 国产欧美日韩精品亚洲av| 看片在线看免费视频| 久久久久久久午夜电影| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| 999久久久精品免费观看国产| 中文字幕人妻熟女乱码| 久久人人精品亚洲av| 人妻久久中文字幕网| 国产主播在线观看一区二区| 91老司机精品| 免费高清在线观看日韩| 美女国产高潮福利片在线看| 桃红色精品国产亚洲av| 好男人电影高清在线观看| 亚洲欧美激情综合另类| 一级a爱片免费观看的视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲激情在线av| 怎么达到女性高潮| 黄色视频,在线免费观看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 操出白浆在线播放| 国产精品久久久av美女十八| 日韩欧美国产在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 午夜日韩欧美国产| 日韩av在线大香蕉| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 日日夜夜操网爽| 精品久久久久久久毛片微露脸| 精品国产一区二区久久| 欧美日韩精品网址| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 色精品久久人妻99蜜桃| 曰老女人黄片| 亚洲九九香蕉| 美女国产高潮福利片在线看| 男女下面插进去视频免费观看| 日日夜夜操网爽| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 伦理电影免费视频| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 国产aⅴ精品一区二区三区波| av视频免费观看在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲成人精品中文字幕电影| 女人被狂操c到高潮| 女性被躁到高潮视频| 久久精品国产清高在天天线| 中文字幕最新亚洲高清| 宅男免费午夜| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲无线在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| 黄片播放在线免费| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产av精品麻豆| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 黑人操中国人逼视频| av网站免费在线观看视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 亚洲人成电影观看| 亚洲电影在线观看av| 午夜免费激情av| 国产成人欧美| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产乱人伦免费视频| 69av精品久久久久久| 天天一区二区日本电影三级 | 午夜日韩欧美国产| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 午夜精品久久久久久毛片777| 精品国产亚洲在线| 最近最新免费中文字幕在线| 又紧又爽又黄一区二区| 中国美女看黄片| 好男人电影高清在线观看| 女警被强在线播放| 亚洲全国av大片| 精品久久蜜臀av无| 国产主播在线观看一区二区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 免费在线观看完整版高清| 欧美久久黑人一区二区| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产在线精品亚洲第一网站| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产精品av久久久久免费| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲一区高清亚洲精品| 中文亚洲av片在线观看爽| videosex国产| 欧美成人免费av一区二区三区| 999久久久精品免费观看国产| 久久精品成人免费网站| 国产成+人综合+亚洲专区| 免费看a级黄色片| 18禁美女被吸乳视频| 淫妇啪啪啪对白视频| 村上凉子中文字幕在线| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| e午夜精品久久久久久久| 亚洲欧美激情在线| 99在线人妻在线中文字幕| 精品第一国产精品| 国产成人系列免费观看| 精品欧美一区二区三区在线| 日本欧美视频一区| 免费在线观看黄色视频的| 午夜福利高清视频| 欧美乱妇无乱码| 国产成人欧美| 亚洲欧美激情综合另类| 男人舔女人的私密视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲中文字幕日韩| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产97色在线日韩免费| 亚洲成人久久性| 欧美在线一区亚洲| 我的亚洲天堂| 乱人伦中国视频| 亚洲人成电影观看| 在线国产一区二区在线| 精品人妻1区二区| 亚洲av第一区精品v没综合| 在线av久久热| 亚洲国产精品合色在线| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲欧美激情综合另类| 国产精品99久久99久久久不卡| av有码第一页| 午夜成年电影在线免费观看| 色哟哟哟哟哟哟| 高清黄色对白视频在线免费看| 欧美一级a爱片免费观看看 | 中文字幕色久视频| 免费在线观看影片大全网站| 91国产中文字幕| 女性被躁到高潮视频| 国产精品av久久久久免费| 亚洲精品av麻豆狂野| 日日干狠狠操夜夜爽| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产黄a三级三级三级人| 搞女人的毛片| 日本免费a在线| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 搡老妇女老女人老熟妇| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 日韩欧美一区视频在线观看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产欧美日韩精品亚洲av| 黄片播放在线免费| 精品免费久久久久久久清纯| 757午夜福利合集在线观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| www国产在线视频色| 欧美av亚洲av综合av国产av| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 久久狼人影院| 精品日产1卡2卡| 亚洲第一av免费看| 我的亚洲天堂| 老汉色av国产亚洲站长工具| 黄色a级毛片大全视频| 黄频高清免费视频| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 大码成人一级视频| 99热只有精品国产| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲av美国av| 中出人妻视频一区二区| 日韩欧美三级三区| 久久久久久久久免费视频了| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 一本大道久久a久久精品| 性色av乱码一区二区三区2| 精品久久久精品久久久| 久久久久九九精品影院| 丝袜在线中文字幕| 青草久久国产| 国产在线观看jvid| 精品久久久久久成人av| 国产主播在线观看一区二区| 午夜福利在线观看吧| 老司机靠b影院| 免费在线观看黄色视频的| 伊人久久大香线蕉亚洲五| tocl精华| 国产在线观看jvid|