骨髓間充質(zhì)干細胞移植對心衰大鼠心肌組織中MMP-2、MMP-9和TIMP-1的影響*

吳志勇， 漆紅梅， 羅 駿， 劉詩英， 萬 勇， 周裔忠， 盛國太， 李華泰

(1江西省人民醫(yī)院心內(nèi)科, 2江西省心血管病研究所， 3南昌大學第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科， 4江西省高血壓病研究所，5江西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 6江西省神經(jīng)病學研究所， 7江西省人民醫(yī)院病理科, 江西 南昌330006)

骨髓間充質(zhì)干細胞移植對心衰大鼠心肌組織中MMP-2、MMP-9和TIMP-1的影響*

吳志勇1,2△， 漆紅梅3,4， 羅 駿1，2， 劉詩英5，6， 萬 勇7， 周裔忠1，2， 盛國太1，2， 李華泰1，2

(1江西省人民醫(yī)院心內(nèi)科,2江西省心血管病研究所，3南昌大學第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，4江西省高血壓病研究所，5江西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，6江西省神經(jīng)病學研究所，7江西省人民醫(yī)院病理科, 江西 南昌330006)

目的探討骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)移植對心衰大鼠心肌組織中基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9和金屬蛋白酶組織抑制劑1(TIMP-1)的影響及機制。方法采用異丙腎上腺素(ISO)皮下注射的方法建立大鼠的心力衰竭模型，隨機分成3組，每組8只，心肌內(nèi)分別注射BMSCs(BMSCs組)、BMSCs條件培養(yǎng)液(BMSCs-CM組)及生理鹽水(NS組)。RT-PCR檢測3組心肌組織MMP-2、MMP-9和TIMP-1 mRNA的表達，Western blotting檢測心肌組織MMP-2、MMP-9和TIMP-1蛋白，胞漿和胞核內(nèi)核因子κB(NF-κB)的p65和p50,以及總蛋白中NF-κB抑制物(I-κB)和磷酸化NF-κB抑制物(p-IκB)蛋白表達水平。結果和NS組比較，BMSCs組和BMSCs-CM組MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白表達明顯減弱(P<0.05),TIMP-1 mRNA和蛋白表達明顯增強(P<0.05)；而與BMSCs-CM組比較，BMSCs組MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白表達明顯減弱(P<0.05),TIMP-1 mRNA和蛋白表達明顯增強(P<0.05)。胞核中p65和p50蛋白表達，NS組明顯多于BMSCs組和BMSCs-CM組(P<0.05)；而胞漿中p65和p50蛋白表達，NS組明顯少于BMSCs組和BMSCs-CM組(P<0.05)。和BMSCs-CM組比較，BMSCs組胞核中p65和p50蛋白表達明顯升高(P<0.05)；而胞漿中p65和p50蛋白表達，BMSCs組明顯少于BMSCs-CM組(P<0.05)。NS組心肌組織總蛋白中p-IκB/IκB最高，明顯多于BMSCs組和BMSCs-CM組(P<0.05),BMSCs組最低(P<0.05)。結論BMSCs及其在缺氧條件下的培養(yǎng)液均可通過改變NF-κB的抑制蛋白IκB的活性，從而改變心衰心肌細胞胞核中NF-κB含量，影響有關基因的轉(zhuǎn)錄，使得MMPs水平升高和TIMPs水平降低。

骨髓間充質(zhì)干細胞； 條件培養(yǎng)液； 基質(zhì)金屬蛋白酶類； 金屬蛋白酶組織抑制劑； 心力衰竭

心室重構是心力衰竭發(fā)生的主要機制，其中最重要的是在神經(jīng)-內(nèi)分泌因素的作用下細胞外基質(zhì)重構，從而發(fā)生心肌纖維化和進行性心室擴張，最終導致心力衰竭[1]。其中心肌組織中的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)及其組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)活性及表達失衡是影響心室重構的重要因素之一[2-3]。同時研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)可分化為心肌細胞及影響細胞外基質(zhì)代謝，從而逆轉(zhuǎn)心室重構、改善心臟功能[4-5]。但BMSCs移植對MMPs和TIMPs的影響由于研究方法不同導致結論不一致。本研究采用異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)皮下注射的方法建立大鼠的心力衰竭模型，通過心肌內(nèi)分別注射BMSCs以及在缺氧條件下的BMSCs培養(yǎng)液(BMSCs-conditioned medium，BMSCs-CM)對比觀察心肌組織中基質(zhì)金屬蛋白酶 9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)、MMP-2及金屬蛋白酶組織抑制劑 1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)的變化，進一步探討B(tài)MSCs移植對細胞外基質(zhì)重構影響的可能機制。

材 料 和 方 法

1材料與試劑

100～150 g雄性Wistar大鼠購自南昌大學實驗動物中心，10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、DMEM培養(yǎng)液、Percoll’s液(密度1 073 g/L)、裂解液(0.5 mol/L Tris-HCl, 0.2 mol/L NaCl, 10 mmol/L CaCl2, 1% Triton X-100, 100 mg/L PMSF)均購自南京維森特生物技術(中國)有限公司，全蛋白抽提試劑盒和胞漿蛋白抽提試劑盒、胞核蛋白抽提試劑盒均購自南京凱基生物公司, 低糖DMEM培養(yǎng)基、 Wistar大鼠成骨誘導完全培養(yǎng)基和Wistar大鼠成脂誘導完全培養(yǎng)基均購自廣州賽業(yè)生物科技公司,β-actin、MMP-2、MMP-9、TIMP-1Ⅰ抗和Ⅱ抗均購自北京博奧森生物技術有限公司，NF-κB p65、NF-κB抑制物(inhibitor of κB, IκB)、磷酸化NF-κB抑制物(phosphorylated IκB, p-IκB)Ⅰ抗和Ⅱ抗均購自南京凱基生物有限公司，NF-κB p50Ⅰ抗和Ⅱ抗購自上海超研生物科技有限公司，辣根過氧化物酶標記Ⅱ抗，BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色液購自上海碧云天生物公司，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)(Kodak)，流式細胞儀(FACSCalibar, BD)。

2方法

2.1模型建立及分組 取100～150 g雄性Wistar大鼠采用異丙腎上腺素皮下注射方法建立心力衰竭模型，實驗處置符合動物倫理學標準。建模具體方法參考文獻[6-7]。異丙腎上腺素用生理鹽水稀釋成濃度為85 mg/L，按170 mg·kg-1·d-1的劑量連續(xù)給藥4 d。4 d后行超聲心動圖的測定，左心室射血分數(shù)<70%的大鼠定義為心衰建模成功。

建模成功者隨機分成3組，每組8只，分別心肌內(nèi)注射BMSCs(BMSCs組)、BMSCs條件培養(yǎng)液(BMSCs-CM組)及生理鹽水(normal saline,NS組)。

2.2BMSCs的分離、純化、擴增及培養(yǎng)和BMSCs-CM的制備

2.2.1BMSCs的分離、純化、擴增及培養(yǎng) 取80 g雄性Wistar大鼠，經(jīng)麻醉處死，消毒后無菌條件下采集雙側股骨、脛骨，去除周圍肌肉組織后放入35 mm無菌塑料培養(yǎng)皿，切除兩側骨端部，用吸有10% FBS的DMEM培養(yǎng)液的注射器沖洗骨髓腔，200目不銹鋼濾網(wǎng)過濾骨髓液，用Percoll’s液梯度離心(2 400 r/min,離心10 min)。將上述單個核細胞層用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基重新懸浮細胞，調(diào)整細胞密度以5×108/L密度接種于50 mL的培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后換液，棄去未貼壁細胞，以后每3 d換液1次，細胞增殖值接近融合80%時用0.25%胰蛋白酶消化傳代，反復傳代純化細胞。分別以形態(tài)學和功能學指標鑒定BMSCs，方法如下：(1)倒置顯微鏡下觀察細胞生長及形態(tài)特征。(2)成骨誘導培養(yǎng)：將BMSCs置于6孔板中培養(yǎng)至80%～90%融合后，棄舊培養(yǎng)基，加入2 mL/well的成骨誘導完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每3 d換液，連續(xù)觀察，誘導3周后，茜素紅染色，甲醛固定，拍照。(3)成脂誘導培養(yǎng)：將BMSCs置于六孔板中培養(yǎng)至80%-90%融合后，棄舊培養(yǎng)基，加入2 mL/well的成脂誘導完全培養(yǎng)基A繼續(xù)培養(yǎng)。3 d后更換為成脂誘導完全培養(yǎng)基B，維持24 h后，再次更換為成脂誘導完全培養(yǎng)基A，如此進行3個循環(huán)。油紅O染色，甲醛固定，拍照。(4)取接近融合的第4代BMSCs, 用0.25%胰酶消化后,用pH 7.2 PBS 洗滌2次,然后用流式細胞儀檢測細胞表面標志(按試劑操作說明完成)。

2.2.2BMSCs-CM的制備 培養(yǎng)第2～5代BMSCs用PBS漂洗2次,去除殘留的完全培養(yǎng)基,加入不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,然后將細胞置于可調(diào)氧濃度的培養(yǎng)箱,2% O2、無菌條件下收集6 h的培養(yǎng)液,置-70 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3BMSCs、BMSCs-CM和NS心肌內(nèi)注射 3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉、氣管插管連接呼吸機機械通氣。無菌條件下在胸骨左緣胸肋關節(jié)處剪斷第2～4肋骨開胸，剪開心包膜，用小拉鉤將心包膜固定于胸壁，充分暴露心臟。3組心衰大鼠分別在左室前壁按“米”形用微量注射器注射BMSCs、BMSCs-CM及生理鹽水，每點分別注射25 μL，共200 μL。注射結束后，關胸，維持輔助呼吸至自主呼吸恢復，腹腔注射青霉素1周，預防感染。送飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng)6周。

2.3RT-PCR檢測心肌組織MMP-2、MMP-9和TIMP-1 mRNA的表達 引物序列及反應條件見表1。取5 μL PCR產(chǎn)物于1 μL 6× loading buffer中，點樣于1．5%瓊脂糖凝膠電泳，80 V、50 min。紫外燈下觀察，凝膠成像系統(tǒng)(Kodak)拍照，進行吸光度掃描讀數(shù)，計算目的基因mRNA與β-actin mRNA的比值。

表1 引物序列及反應條件

2.4Western blotting檢測心肌組織MMP-2、MMP-9和TIMP-1蛋白的表達 取相同部位的左心室組織于液氮中研磨，加入裂解液(0.5 mol/L Tris-HCl, 0.2 mol/L NaCl, 10 mmol/L CaCl2, 1%Triton X-100,100 mg/L PMSF),4 ℃下作用30 min，離心、提取蛋白。取含50 μg總蛋白的樣品進行非連續(xù)SDS-PAGE電泳分離蛋白，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉，Ⅰ抗孵育、漂洗；Ⅱ抗孵育(β-actin和MMP-2為兔抗IgG, MMP-9為羊抗鼠IgG)、漂洗。BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色液進行顯色。Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)照相,測定條帶的吸光度，計算目的條帶與β-actin比值。

2.5Western blotting檢測心肌組織中NF-κB活性 取3組大鼠注射部位周邊區(qū)心肌組織100 mg,剪成2 mm×2 mm×2 mm大小的碎塊，放入冰預冷的玻璃勻漿器勻漿后，分別按照總蛋白、胞漿蛋白和胞核蛋白試劑盒的操作方法提取, BCA法測定蛋白，分裝并置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。分?種蛋白10 μL，常規(guī)電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉后分別加入NF-κB p65、NF-κB p50、IκB和p-IκB的Ⅰ抗,4 ℃輕搖過夜,洗膜,加入辣根過氧化物酶標記Ⅱ抗,化學發(fā)光試劑增強反應,X線壓片曝光,用GSDS000密度掃描分析系統(tǒng)分析圖像,計算胞漿內(nèi)及胞核內(nèi)p65和p50以及總蛋白中IκB、p-IκB蛋白表達水平。

3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。各組數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1BMSCs形態(tài)觀察和流式細胞術檢測

分離獲得的BMSCs形態(tài)較為均一，呈圓形、三角形。培養(yǎng)細胞形態(tài)均勻，與成纖維細胞形態(tài)相似，大部分呈長梭形，排列規(guī)則，見圖1A、B。BMSCs經(jīng)成骨誘導3周后可見鈣結節(jié)明顯形成，茜素紅染色陽性，見圖1C。BMSCs經(jīng)成脂誘導3周后可見脂滴聚集，油紅O染色陽性，見圖1D。

Figure 1. Morphological indentification of BMSCs. A: BMSCs cultured for 24 h were roughly spherical or triangle (inverted microscope,×200)； B: the 3rd generation of BMSCs were of spindle shape, and showed circinate or interlaced arrangement(inverted microscope,×200)； C: BMSCs were positive for alizarin red staining (×40)； D: BMSCs were positive for oil red O staining (×200).

圖1BMSCs形態(tài)學鑒定

流式細胞術檢測傳代BMSCs中CD44陽性細胞為96.96%，CD34陽性細胞為0.23%，CD45陽性細胞為0.24%，結合形態(tài)學觀察證實本實驗分離培養(yǎng)的細胞為BMSCs，見圖2。

Figure 2. Antigen expression of rat BMSCs tested by flow cyto-metry.A: CD45; B: CD44 and CD34.

圖2流式細胞術檢測大鼠BMSCs抗原的表達

2心肌組織MMP-9、MMP-2和TIMP-1mRNA測定

RT-PCR分析結果顯示，和NS組比較，BMSCs組和BMSCs-CM組MMP-2和MMP-9 mRNA表達明顯減弱(P<0.05),TIMP-1 mRNA表達明顯增強(P<0.05)；與BMSCs-CM組比較，BMSCs組MMP-2和MMP-9 mRNA表達明顯減弱(P<0.05),TIMP-1 mRNA表達明顯增強(P<0.05)，見圖3。

3心肌組織MMP-9、MMP-2和TIMP-1蛋白表達

Western blotting分析結果顯示，和NS組比較，BMSCs組和BMSCs-CM組MMP-2和MMP-9蛋白的表達明顯減弱(P<0.05),TIMP-1蛋白的表達明顯增強(P<0.05)；與BMSCs-CM組比較，BMSCs組MMP-2和MMP-9蛋白的表達明顯減弱(P<0.05),TIMP-1蛋白的表達明顯增強(P<0.05)，見圖4。

4心肌組織NF-κB活性及p-IκB/IκB比值變化

4.1心肌細胞胞漿、胞核內(nèi)NF-κB p65和p50蛋白表達水平比較 通過檢測胞漿和胞核蛋白中NF-κB 2個亞基p65和p50，了解心肌組織NF-κB活性變化，見圖5、6。胞核中p65和p50蛋白表達，NS組明顯多于BMSCs組和BMSCs-CM組(P<0.05)；而胞漿中p65和p50蛋白表達，NS組明顯少于BMSCs組和BMSCs-CM組(P<0.05)。BMSCs組和BMSCs-CM組比較，BMSCs組胞核中p65和p50蛋白表達明顯高于BMSCs-CM組(P<0.05)；而胞漿中p65和p50蛋白表達，BMSCs組明顯少于BMSCs-CM組(P<0.05)。

Figure 3. The mRNA expression of MMP-9, MMP-2 and TIMP-1 in the 3 groups detected by RT-PCR.1: BMSCs group; 2: BMSCs-CM group; 3: NS group.Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNS group；#P<0.05vsBMSCs-CM group.

圖3RT-PCR檢測心肌組織MMP-9、MMP-2及TIMP-1mRNA的表達

4.2心肌細胞中p-IκB/IκB比值變化 3組心肌組織總蛋白中p-IκB/IκB比值各不相同，其中NS組最高，明顯多于BMSCs組和BMSCs-CM組(P<0.05)；BMSCs組最低(P<0.05)，見圖7。

討 論

研究發(fā)現(xiàn)MMPs/TIMPs系統(tǒng)的改變在心力衰竭心室重構中發(fā)揮重要的作用。MMPs作為一種內(nèi)源性鋅依賴性酶家族，不僅在間質(zhì)成分的降解中起重要作用，同時還參與膠原的合成。而TIMPs作為MMPs的內(nèi)源性特異性抑制劑，其底物廣泛，其作用與MMPs構成一動態(tài)平衡系統(tǒng)共同維持心血管基質(zhì)的分解與重塑。臨床研究發(fā)現(xiàn)如擴張性心肌病、致心律失常型右室心肌病等心力衰竭患者心肌MMPs/TIMPs比值增加，具體表現(xiàn)為MMPs水平的升高和TIMPs水平的降低[8]，而給予與左室輔助泵等治療措施后心肌MMPs/TIMPs比值趨于正常[9]。因此,MMPs/TIMPs比值的改變與心室重構和心功能改變存在因果關系。本研究中的大鼠模型中也同樣表現(xiàn)為MMPs水平的升高和TIMPs水平的降低，與既往的研究報道相一致[10]。

Figure 4. The protein expression of MMP-9, MMP-2 and TIMP-1 in the 3 groups measured by Western blotting.1: BMSCs group; 2: BMSCs-CM group; 3: NS group.Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsBMSCs-CM group.

圖4Westernblotting檢測心肌組織MMP-9、MMP-2及TIMP-1蛋白的表達

Figure 5. The protein expression of NF-κB p65 and p50 in nuclear extraction(NE) of cardiomyocytes in the 3 group. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsBMSCs-CM group.

圖5心肌細胞胞核內(nèi)NF-κBp65和p50蛋白的表達

Figure 6. The protein expression of NF-κB p65 and p50 in cytosol extraction(CE) of cardiomyocytes in the 3 groups. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsBMSCs-CM group.

圖6心肌細胞胞漿內(nèi)NF-κBp65和p50蛋白的表達

Figure 7. p-IκB/IκB in total myocardium protein in the 3 groups. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsBMSCs-CM group.

圖7心肌細胞p-IκB/IκB比值的變化

BMSCs治療心力衰竭的研究已經(jīng)成為當今研究的熱點，推測其可能通過直接向心肌細胞分化或通過旁分泌等機制抑制心室擴張和心室重構，改善心功能。但關于BMSCs對心衰過程中細胞外基質(zhì)影響的確切機制有待進一步明確。

本研究結果首先證實，不管是BMSCs本身，還是其在離體狀態(tài)、特定條件下分泌的生物活性物質(zhì),對心衰大鼠模型的心肌組織中的MMPs/TIMPs系統(tǒng)均可產(chǎn)生影響。BMSCs-CM是間充質(zhì)干細胞對生存環(huán)境的反映。BMSCs離體培養(yǎng)環(huán)境的不同，BMSCs-CM所含有成分及量可能不同。BMSCs-CM可能是通過含有多種生物活性物質(zhì)的聚集體發(fā)揮作用的[11]。有研究報道真核細胞在激活或者凋亡過程中可衍生膜微粒[12-13]，其可通過攜帶的生物活性物質(zhì)和表面受體、細胞因子以及信號蛋白、mRNA、miRNA等傳遞遺傳信息[14-15]。其可作為一種細胞應激信號，調(diào)節(jié)旁細胞或遠處靶細胞的功能如：調(diào)節(jié)炎癥與凝血的發(fā)生、免疫反應、組織修復及細胞間信息的轉(zhuǎn)導[16]。

同時，本研究結果也證實BMSCs或其特定的條件培養(yǎng)液對心室重構這一的病理生理過程中細胞外基質(zhì)代謝的影響是通過NF-κB的信號轉(zhuǎn)導途徑影響MMPs/TIMPs系統(tǒng)而發(fā)揮作用。過去的研究已經(jīng)證實對于在靜息狀態(tài)的心肌細胞，NF-κB與抑制蛋白IκB結合，以非活化形式存在于細胞漿中[17]。而心衰的病理進程中的心肌細胞受到活化信號刺激作用，IκB發(fā)生磷酸化，與NF-κB分離，隨后NF-κB轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，因此胞核蛋白中NF-κB的2個亞基p65和p50明顯增多，而胞漿中p65和p50蛋白減少。本研究結果也證實了這一點。本研究中NS組的心肌細胞總蛋白中p-IκB/IκB比值、胞核蛋白中p65和p50蛋白表達均明顯多于BMSCs組和BMSCs-CM組。而從BMSCs組和BMSCs-CM組的結果推測BMSCs及由其分泌的生物活性物質(zhì)改變NF-κB的抑制蛋白IκB的活性，使對NF-κB的抑制作用解除，在胞核、胞漿里重新發(fā)生分布，改變心肌細胞胞核中NF-κB含量，影響細胞核內(nèi)靶基因啟動區(qū)或增強子上的NF-κB的結合位點，從而調(diào)控有關基因的轉(zhuǎn)錄。在本研究中在BMSCs組和BMSCs-CM組MMP-2和MMP-9的mRNA及相應的蛋白表達明顯減弱,TIMP-1 mRNA及相應的蛋白表達明顯增強，也就證實這點。

此外，本研究結果也提示BMSCs移植比單純的BMSCs-CM移植對心衰大鼠模型心肌組織中的NF-κB信號轉(zhuǎn)導途徑和MMPs/TIMPs系統(tǒng)影響更為明顯，其中原因可能與下列因素有關：(1)由于與NF-κB的信號轉(zhuǎn)導途徑、MMPs/TIMPs系統(tǒng)之間可能存在正反饋機制，因此即使MSCs移植后直接分化為心肌細胞的量據(jù)研究報道非常微小，但對最終影響還是非常明顯。(2)體外研究也證實心肌微環(huán)境中的心肌細胞分泌的細胞因子以及間質(zhì)細胞所產(chǎn)生的某些生長因子或配體，可能通過細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導途徑控制著BMSCs的分化和成熟，但具體機制和途徑不確定[18]。本研究證實在心力衰竭的心肌微環(huán)境下，BMSCs可分泌與在缺氧狀態(tài)下的BMSCs-CM相類似的生物活性物質(zhì)，而且可通過NF-κB的信號轉(zhuǎn)導途徑促使MMPs/TIMPs系統(tǒng)向改善心室重構的方向進行。(3)與此同時，本研究中也發(fā)現(xiàn)在心力衰竭的心肌微環(huán)境下，BMSCs分泌的生物活性物質(zhì)在成分或質(zhì)量方面較在缺氧狀態(tài)下的BMSCs-CM更有利MMPs/TIMPs系統(tǒng)向改善心室重構的方向進行。

但目前有關BMSCs-CM的成分非常復雜，如果能獲取一種間充質(zhì)干細胞釋放膜微粒穩(wěn)定方法，明確其含有成分及作用，便使一種間充質(zhì)干細胞新的治療方法成為現(xiàn)實。

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EffectsofbonemarrowmesenchymalstemcelltransplantationonexpressionofMMP-2,MMP-9andTIMP-1inmyocardiumofheartfailurerats

WU Zhi-yong1, 2, QI Hong-mei3, 4, LUO Jun1, 2, LIU Shi-ying5, 6, WAN Yong7, ZHOU Yi-zhong1, 2, SHENG Guo-tai1, 2, LI Hua-tai1, 2

(1DepartmentofCardiology,People’sHospitalofJiangxiProvince,2InstituteofCardiovascularMedicineofJiangxiPro-vince,3DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,4HypertensionInstituteofJiangxiProvince,5DepartmentofNeurology,People’sHospitalofJiangxiProvince,6InstituteofNeurologicMedicineofJiangxiPro-vince,7DepartmentofPathology,People’sHospitalofJiangxiProvince,Nanchang330006,China.E-mail:wuzhiyong76@163.com)

AIM: To study the effects of bone marrow mesenchymal stem cell (BMSC) transplantation on matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) in the myocardium of heart failure rats.METHODSHeart failure model was established by subcutaneous injection of isoproterenol consecutively in Wistar rats. The rats were randomly divided into 3 groups (8 rats each group) and were implanted with BMSCs (BMSCs group), BMSCs-conditioned medium (BMSCs-CM group) and normal saline (NS group), respectively. Six weeks after transplantation, RT-PCR and Western blotting analysis were used to observe the expression of MMP-2, MMP-9 and TIMP-1 in the myocardium at mRNA and protein levels. Western blotting was also used to determine the protein levels of NF-κB p65 and p50 in nuclear extraction (NE) and cytosol extraction (CE), and the protein levels of IκB and p-IκB in the myocardium.RESULTSCompared with saline group, the expression of MMP-2 and MMP-9 was decreased significantly, and the expression of TIMP-1 was increased obviously in BMSCs group and BMSCs-CM group at mRNA and protein levels. The expression of MMP-2 and MMP-9 at mRNA and protein levels in BMSCs group were significantly lower than that in BMSCs-CM group, but the expression of TIMP-1 at mRNA and protein levels in BMSCs group was obviously higher than that in BMSCs-CM group. Compared with BMSCs group and BMSCs-CM group, the expression of NF-κB p65 and p50 in NE in NS group was significantly higher.However, the expression of NF-κB p65 and p50 in CE in NS group was lower than that in BMSCs group and BMSCs-CM group. Compared with BMSCs-CM group, the protein levels of NF-κB p65 and p50 in NE in BMSCs group were increased, but the protein levels of NF-κB p65 and p50 in CE in BMSCs group were decreased. The value of p-IκB/IκB in NS group was the highest, and that in BMSCs group was the lowest in the 4 groups.CONCLUSIONThe transplantations of BMSCs and BMSCs-CM both increase the levels of MMP-2 and MMP-9, and decrease the level of TIMP-1 in the myocardium of heart failure rats. BMSCs and BMSCs-CM can change the level of NF-κB in NE by inhibiting the activity of IκB to influence the gene transcription.

Bone marrow mesenchymal stem cells; Conditioned medium; Matrix metalloproteinases; Tissue inhibitor of metalloproteinases; Heart failure

R361.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.003

1000- 4718(2013)06- 0975- 07

2012- 11- 08

2013- 04- 28

江西省衛(wèi)生廳科技計劃課題(No. 20113012)

△通訊作者 Tel: 0791-86892180; E-mail: wuzhiyong76@163.com