慢性腎病對(duì)大鼠骨折愈合的早期影響

趙 波 楊惠林 吳志良 張志剛

蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，江蘇蘇州 215006

慢性腎病是指持續(xù)3個(gè)月以上的慢性腎損害或腎功能下降。當(dāng)前慢性腎病已成為嚴(yán)重的公共健康問題，流行病學(xué)調(diào)查顯示我國成年人群中慢性腎病發(fā)病率高達(dá)10.8%[1]。由于慢性腎病可引起礦物質(zhì)代謝紊亂、繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)及內(nèi)分泌紊亂等，患者常合并腎性骨營養(yǎng)不良，導(dǎo)致骨量的丟失及骨強(qiáng)度的下降，骨折風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。目前的研究熱點(diǎn)主要在慢性腎病患者骨折的危險(xiǎn)因素及骨折預(yù)防方面，然而慢性腎病對(duì)骨折愈合的影響尚不十分清楚。因此，本研究應(yīng)用慢性腎病大鼠脛骨骨折模型，研究慢性腎病對(duì)大鼠骨折愈合質(zhì)量的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立

2個(gè)月齡雄性SD大鼠40只，體重200 g左右，由蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組，每組20只。實(shí)驗(yàn)組給予含0.75%腺嘌呤（SIGMA公司提供）飼料飼養(yǎng)，對(duì)照組予以普通飼料喂養(yǎng)。4周后，頸靜脈抽血檢測血清肌酐、尿素氮、鈣、磷及甲狀旁腺激素（PTH）水平，確定腎病造模成功，然后行右脛骨中段骨折造模及內(nèi)固定。具體方法為：10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射，麻醉成功后，將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，右后肢硫化鈉脫毛、安爾碘消毒，于右小腿中段前方做縱形皮膚切口，長約1 cm，暴露脛骨中段，環(huán)形剝離部分骨膜，用微型鋸于脛骨結(jié)節(jié)下方約1 cm處橫行鋸斷脛骨干，1 mm克氏針?biāo)枨粌?nèi)固定，生理鹽水沖洗傷口后，1號(hào)絲線分層縫合切口，腹腔注射青霉素10萬U。兩組大鼠術(shù)后均給予普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。骨折造模4周后，過量麻醉處死動(dòng)物，切取右側(cè)脛骨，拔除內(nèi)固定，剔除軟組織，4%多聚甲醛固定，-20℃冷凍備用。

1.2 Micro CT分析

標(biāo)本室溫下解凍后，采用Skyscan 1176 Micro CT（蘇州大學(xué)骨科研究所）進(jìn)行標(biāo)本全長掃描，層間距18 μm，掃描電壓50 kV，電流200 mA。掃描完成后將數(shù)據(jù)傳輸?shù)綀D形工作站，應(yīng)用Micro CT分析軟件進(jìn)行圖像重建及3D分析。在CT掃描定位圖上，以骨折線為中心，選取上下各100個(gè)掃描層面（共3.6 mm）進(jìn)行骨痂形態(tài)學(xué)分析，應(yīng)用線性插值方法，手動(dòng)描繪出每個(gè)掃描層面的骨痂組織邊界，分析參數(shù)包括組織總量（total bone volume，TV）、骨量（bone volume，BV）和骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）。

1.3 生物力學(xué)測量

完成 Micro-CT掃描后，應(yīng)用Instron E10000型力學(xué)試驗(yàn)機(jī)（蘇州大學(xué)骨科研究所）進(jìn)行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)。測量時(shí)保持標(biāo)本位置一直，承載點(diǎn)寬度20 mm，加載點(diǎn)為骨折部位，加載速度2.5 mm/min，記錄力-變形曲線，測試標(biāo)本的最大載荷、強(qiáng)度、能量吸收。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎病造模4周后血清鈣、磷、肌酐、尿素氮及甲狀旁腺激素的變化

給予含0.75%腺嘌呤飼料喂養(yǎng)4周后，實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟腫大、蒼白、包膜下見黃褐色顆粒狀；血清磷、肌酐、尿素氮、PTH均較對(duì)照組明顯升高（P＜0.05）；但血清鈣離子濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 腎病造模4周后血清鈣、磷、肌酐、尿素氮及PTH的變化（±s）

表1 腎病造模4周后血清鈣、磷、肌酐、尿素氮及PTH的變化（±s）

注：PTH：甲狀旁腺激素

組別 只數(shù) 鈣（mmol/L）磷（mmol/L）肌酐（μmol/L）尿素氮（mmol/L）PTH（ng/L）對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組20 20 t值 P值2.22±0.22 2.03±0.21 1.88＞0.05 2.57±0.36 5.96±0.79 12.31＜0.05 23.55±2.92 227.07±51.41 12.49＜0.01 4.56±0.35 46.41±7.67 17.22＜0.01 111.20±8.14 1268.50±65.36 22.66＜0.01

2.2 Micro CT分析

骨折造模術(shù)后4周，兩組大鼠骨折均無明顯的畸形愈合，無內(nèi)固定彎曲、斷裂等，去除內(nèi)固定后無骨折部位無肉眼可見的活動(dòng)及成角。Micro CT掃描二維及三位圖像重建顯示，對(duì)照組骨折斷端有連續(xù)的骨性骨痂連接；實(shí)驗(yàn)組骨折斷端以軟骨痂為主，骨性骨痂不連續(xù)（圖1）。骨痂組織3D分析結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組BV、TV、BV/TV也較對(duì)照組明顯降低（P ＜ 0.05）。 見表2。

表2 骨痂組織Micro CT分析（±s）

表2 骨痂組織Micro CT分析（±s）

注：TV：骨痂組織總量；BV：骨性骨痂量；BV/TV：骨體積分?jǐn)?shù)

組別 只數(shù) TV（mm3）BV（mm3） BV/TV（%）實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組t值P值20 20 18.45±2.11 29.60±2.45 18.21＜0.01 7.12±3.40 15.65±1.32 8.43＜0.01 40.77±2.27 44.65±2.12 2.40＜0.01

2.3 生物力學(xué)

在三點(diǎn)彎曲力學(xué)測試中，所有標(biāo)本均于骨痂組織處斷裂。實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本最大載荷、強(qiáng)度、斷裂能量均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 三點(diǎn)彎曲力學(xué)測試結(jié)果（±s）

表3 三點(diǎn)彎曲力學(xué)測試結(jié)果（±s）

組別 只數(shù) 最大載荷（N） 強(qiáng)度（N/mm） 斷裂能量（N·mm）實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組20 20 t值 P值34.85±9.39 46.42±3.26 4.76＜0.01 47.65±5.64 103.79±4.12 3.23＜0.01 7.17±4.47 14.25±2.21 9.61＜0.01

3 討論

最新的流行病學(xué)資料顯示，我國慢性腎病患者已超過一億[1]，是世界上慢性腎病患者最多的國家。慢性腎病引起礦物質(zhì)代謝紊亂、繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)、活性維生素D3缺乏，嚴(yán)重影響骨代謝，造成患者骨量減少、骨強(qiáng)度下降，骨折風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。研究發(fā)現(xiàn)慢性腎病患者骨折風(fēng)險(xiǎn)隨著腎小球率過濾的下降而增加[2]，終末期慢性腎病患者髖部骨折風(fēng)險(xiǎn)是正常人群的4倍[3]。由于慢性腎病在老年人群的發(fā)病率最高[4]，老年患者常合并絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松及老年性骨質(zhì)疏松，因此骨折風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步增加。當(dāng)前國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)主要在慢性腎病患者的骨折風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)防方面，而慢性腎病對(duì)骨折愈合的影響尚不是很清楚。

常用于建立大鼠慢性腎病模型的方法的有部分腎切除、單側(cè)腎動(dòng)脈結(jié)扎+對(duì)側(cè)部分腎切除、腎毒性藥物等。Terai等[5]對(duì)比研究了部分腎切除及腺嘌呤飼養(yǎng)法，認(rèn)為應(yīng)用腺嘌呤喂養(yǎng)建立大鼠慢性腎病模型具有快速、穩(wěn)定、病死率低等優(yōu)點(diǎn)。本研究應(yīng)用含0.75%腺嘌呤飼料喂養(yǎng)的方法建立大鼠的慢性腎病模型，在給藥4周后，觀察到血清肌酐、尿素、磷的顯著升高，肉眼觀察大鼠腎臟腫大、蒼白、腎臟表面可見黃褐色顆粒，符合慢性腎病的病理改變。

Micro CT具有極高的分辨率，能清楚顯示骨組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)，通過圖像重建技術(shù)及3D形態(tài)學(xué)分析，可準(zhǔn)確反映骨折愈合情況及骨痂微細(xì)結(jié)構(gòu)的變化，具有普通X線攝片無法比擬的優(yōu)勢。本研究觀察到在骨折后第4周，實(shí)驗(yàn)組大鼠骨折部位沒有連續(xù)性的骨性骨痂形成，骨痂內(nèi)非礦化成分較多；而對(duì)照組大鼠骨折線消失，骨折斷端骨痂組織連續(xù)，骨痂改建較好。3D分析顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠TV、BV、BV/TV均較對(duì)照組下降，表明在骨折愈合早期，實(shí)驗(yàn)組大鼠骨折愈合過程中成骨能力下降、骨痂礦化延遲。

生物力學(xué)測試是評(píng)價(jià)骨折愈合質(zhì)量的金標(biāo)準(zhǔn)。由于實(shí)驗(yàn)組大鼠骨痂組織以非礦化的軟骨痂為主，其力學(xué)性能較差，三點(diǎn)彎曲力學(xué)測試發(fā)現(xiàn)其最大載荷、強(qiáng)度及能量吸收較對(duì)照組分別下降了24.9%、54.5%、49.7%。

骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜的過程，由于參與骨折愈合的組織細(xì)胞對(duì)應(yīng)變的耐受能力不同，在骨折愈合的不同階段，有其特殊的組織細(xì)胞反應(yīng)。在骨折愈合初期，骨折部位應(yīng)變較大，主要由能耐受高應(yīng)變的肉芽組織及軟骨修復(fù)；當(dāng)局部應(yīng)變小于1%的時(shí)候，成骨細(xì)胞開始活動(dòng)，局部形成編織骨替代軟骨痂；在骨折愈合的后期，破骨細(xì)胞開始活躍，編織骨及礦化軟骨逐漸被吸收，取而代之的是排列規(guī)整的板層骨。成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的功能與活性是影響骨折愈合的重要因素，任何原因造成骨折愈合過程中成骨減少或骨吸收增加都會(huì)影響骨折愈合過程中骨痂的質(zhì)量。

慢性腎病可通過多種機(jī)制影響骨折愈合質(zhì)量。繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)（SHPT）可能是影響骨折愈合的重要原因之一。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠給予含腺嘌呤飼料喂養(yǎng)4周后，血清PTH濃度升高到正常的10倍以上。研究發(fā)現(xiàn)，PTH對(duì)成骨細(xì)胞分化具有雙重作用，間歇性地給予PTH可促進(jìn)其分化，而持續(xù)性給予PTH則對(duì)成骨細(xì)胞的分化產(chǎn)生抑制作用[6]。同時(shí)，成骨細(xì)胞對(duì)PTH的抵抗可能是成骨細(xì)胞活性下降的另一重要原因，慢性腎功能不全時(shí)成骨細(xì)胞表達(dá)PTH1型受體下調(diào)[7]，PTH抵抗可能是SHPT的重要原因[8]，在慢性腎病的患者，PTH需要升高到正常的2～4倍才能維持正常的骨代謝[9]。成骨細(xì)胞在骨折愈合過程的主要功能是合成、分泌骨基質(zhì)及促進(jìn)類骨質(zhì)礦化。持續(xù)性的高水平PTH勢必導(dǎo)致成骨細(xì)胞分化障礙，影響骨折愈合。此外，血液中高濃度的PTH可促進(jìn)破骨細(xì)胞分化因子（RANKL）的表達(dá)，RANKL與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞膜上的核因子-κB受體活化因子（RANK）結(jié)合，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化、活化，抑制破骨細(xì)胞的凋亡[10]。近年來發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞本身也表達(dá)PTH1型受體，在體外單獨(dú)培養(yǎng)的破骨細(xì)胞中，PTH通過直接作用于破骨細(xì)胞促進(jìn)其骨吸收活性[11]。成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的功能失衡，導(dǎo)致骨折愈合過程中新骨生成的減少、吸收增加及礦化障礙，最終導(dǎo)致骨痂量的減少和機(jī)械強(qiáng)度下降。另外，慢性腎病引起的鈣磷代謝紊亂、腎性貧血、低蛋白血癥、性腺功能低下、代謝性酸中毒、鋁中毒等可能同樣會(huì)對(duì)骨折愈合過程產(chǎn)生不良影響。

總之，本研究應(yīng)用慢性腎病大鼠骨折模型，通過生物力學(xué)測試及Micro CT分析等方法，首次觀察到慢性腎病大鼠骨折愈合過程中骨痂質(zhì)量及力學(xué)性能的下降，從而影響骨折愈合質(zhì)量。然而慢性腎病影響大鼠骨折愈合的細(xì)胞、分子機(jī)制尚不清楚，其對(duì)骨折愈合中、晚期的影響也有待進(jìn)一步研究。

[1]Ping H，Zhang X，Xing N.Prevalence of chronic kidney disease in China[J].Lancet，2012，380（9838）：216.

[2]Nickolas TL，Leonard MB，Shane E.Chronic kidney disease and bone fracture：a growing concern[J].Kidney Int，2008，74（6）：721-731.

[3]Alem AM，Sherrard DJ，Gillen DL，et al.Increased risk of hip fracture among patients with end-stage renal disease[J].Kidney Int，2000，58（1）：396-399.

[4]Coresh J，Astor BC，Greene T，et al.Prevalence of chronic kidney disease and decreased kidney function in the adult US population：third national health and nutrition examination survey [J].Am J Kidney Dis，2003，41（1）：1-12.

[5]Terai K，Mizukami K，Okada M.Comparison of chronic renal failure rats and modification of the preparation protocol as a hyperphosphataemia model[J].Nephrology（Carlton），2008，13（2）：139-146.

[6]Ishizuya T，Yokose S，Hori M，et al.Parathyroid hormone exerts disparate effects on osteoblast differentiation depending on exposure time in rat osteoblastic cells[J].J Clin Invest，1997，99（12）：2961-2970.

[7]Hoyland JA，Picton ML.Cellular mechanisms of renal osteodystrophy[J].Kidney Int Suppl，1999，73：8-13.

[8]Llach F，Massry SG，Singer FR，et al.Skeletal resistance to endogenous parathyroid hormone in pateints with early renal failure.A possible cause for secondary hyperparathyroidism [J].J Clin Endocrinol Metab，1975，41（2）：339-345.

[9]Slatopolsky E，F(xiàn)inch J，Clay P，et al.A novel mechanism for skeletal resistance in uremia[J].Kidney Int，2000，58（2）：753-761.

[10]Haynes DR，Crotti TN，Zreiqat H.Regulation of osteoclast activity in peri-implant tissues[J].Biomaterials，2004，25（20）：4877-4885.

[11]Dempster DW，Hughes-Begos CE，Plavetic-Chee K，et al.Normal human osteoclasts formed from peripheral blood monocytes express PTH type 1 receptors and are stimulated by PTH in the absence of osteoblasts[J].J Cell Biochem，2005，95（1）：139-148.