降鈣素基因相關肽介導骨折愈合的實驗研究

張捍軍 張 睿 李華哲 趙承斌

哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院骨科，黑龍江哈爾濱 150086

骨折是骨科臨床中最為常見的疾病，特別是隨著交通事故的頻發(fā)，骨折患者的數量也呈逐年上升的趨勢。目前，骨折的治療方式主要包括切開復位和閉合復位，但無論哪種方式都存在延遲愈合甚至不愈合的可能，給患者的身心造成極大的痛苦。針對這一問題，國內外學者先后采用了機械固定、骨移植、電刺激、骨誘導等多種方法進行治療[1-3]，雖然取得了一定的進展，但均不能完全解決骨折不愈合的難題。本研究采用與骨代謝密切相關的降鈣素基因相關肽（CGRP）轉染入骨折斷端，觀察其對骨折動物模型的愈合作用，在基因水平為促進骨折的愈合提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

36只 SD大鼠，平均體重（200±10）g，由中國農科院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供，許可證號：SYXK （黑）2006-032；pcDNA3.1-CGRP 質粒（Invitrogen，美國），E.coli.DH5α（哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院實驗室提供），CGRP引物、dNTP（TAKARA，日本），Hind Ⅲ、BamHⅠ（博士德公司，中國武漢），兔抗大鼠CGRP單克隆抗體、生物素二抗、AP二抗（博士德公司，中國武漢）。

1.2 實驗方法

1.2.1 pcDNA3.1-CGRP質粒的轉化 應用CaCl2溶液將E.coli.DH5α制備成感受態(tài)E.coli.DH5α，加入到 50 mL離心管中，向離心管中加入 5 μL pcDNA3.1-CGRP質粒，冰浴 30 min，42℃熱休克 90 s，再冰浴 2 min。向管中加入SOC培養(yǎng)基800 μL，37℃培養(yǎng) 45 min，使恢復大腸桿菌的正常生長狀態(tài)并且表達抗生素的抗性基因。將菌液涂于含有50 μg/mL氨芐青霉素的SOB平板上進行抗性篩選。

1.2.2 CGRP的PCR及酶切鑒定 待菌落長出后，挑選飽滿菌落對CGRP行PCR檢測，向體系內加入5×PCR Buffer 4 μL，dNTP 1 μL，上下游引物各 1 μL（表1），Taq DNA 聚合酶 0.2 μL，加 ddH2O 定容至 20 μL。 95℃變性 60 s，60℃復性 60 s，72℃延伸 60 s，30 個循環(huán)后，72℃延伸 5 min，4℃保溫。對產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。對于PCR鑒定陽性菌落，擴增提取質粒后，加入 10×K Buffer 2 μL，Hind Ⅲ 1 μL，BamHⅠ1 μL， 質粒-PCR 混合物 15 μL，ddH2O定容至 20 μL，37℃反應 8 h后進行 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

表1 聚合酶鏈反應引物列表

1.2.3 pcDNA3.1-CGRP質粒溶液的配制 選取pcDNA3.1-CGRP鑒定為陽性克隆菌株，擴增后應用QIAGEN Plasmid Midi Kit提取質粒，0.22 μm濾器除菌干燥后加入到含20%蔗糖的PBS溶液中，配制成濃度為1.0 g/L的pcDNA3.1-CGRP質粒溶液，同時配制1.0 g/L的單純pcDNA3.1質粒溶液，-20℃保存待用。

1.2.4 動物的分組及模型制備 36只SD大鼠隨機分為A、B、C 3 組，每組 12 只，3.5%水合氯醛（1 mL/100g）腹腔麻醉，右下肢常規(guī)備皮消毒后，切開皮膚及皮下組織，分離暴露股骨，于股骨中點處用擺鋸將股骨橫行鋸斷，克氏針固定后逐層縫合。術后24、48 h兩個時間點，A組每只動物于骨折處經皮注入pcDNA3.1-CGRP質粒溶液1 mL，B組注入單純pcDNA3.1質粒溶液1 mL，C組注入PBS溶液1 mL作為陰性對照。于術后2、4周檢測骨折愈合情況。

1.2.5 骨折端的X線檢查 于術后觀察大鼠一般狀態(tài)及切口情況，對每組動物均進行X線檢查，記錄骨折復位情況。分別在2、4周時每組分別選取6只大鼠，在X線下觀察骨折斷端骨痂的形成情況，并與術后進行比較。

1.2.6 CGRP的免疫組化檢測 術后2、4周兩個時間點每組各隨機選取6只大鼠，乙醚麻醉后處死，取骨折端周圍骨組織、骨膜組織和骨骼肌，4%多聚甲醛固定后，骨組織EDTA脫鈣處理。切片脫蠟后，3%H2O2浸泡20 min，加入兔抗大鼠 CGRP單克隆抗體（1∶200），室溫過夜；PBS沖洗，加入生物素二抗（1∶400），37 ℃孵育 30 min；PBS 沖洗后加入新配制DAB顯色。以PBS代替一抗作為陰性對照，每個標本隨機選取6張切片，每張切片隨機選取6個高倍視野，應用Image-ProPlus圖像分析系統(tǒng)測定平均光密度值，并進行統(tǒng)計學分析。

1.2.7 CGRP的 Western blot檢測 術后 2、4周兩個時間點，取處死動物的骨膜組織，加入1 mL細胞裂解液，冰上裂解5 min，經超聲細胞粉碎儀粉碎后，4℃低溫離心10 min（12 000 r/min），取上清加入 5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液電泳。轉膜封閉后，加入兔抗大鼠CGRP單克隆抗體（1∶200），室溫過夜；TBST 沖洗后加入 AP 標記的二抗（1∶400），孵育1 h，加AP顯色液顯色。應用Image-ProPlus圖像分析系統(tǒng)測定平均光密度，并進行統(tǒng)計學分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 18.0采用統(tǒng)計學軟件進行數據分析，PCR、免疫組化及Western blot的檢測結果的相對值以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CGRP的PCR及酶切鑒定

質粒轉化后，對飽滿菌落PCR產物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，有4個克隆菌落在成像儀下可見大小相同的特異性片段，與CGRP的cDNA相吻合。對這4個克隆菌落提取質粒酶切后進行電泳，在凝膠成像儀下可見兩條特異性條帶，其大小分別與pcDNA3.1和CGRP相一致。

2.2 骨折端的X線檢查

實驗動物術后一般狀態(tài)良好，切口無感染，右下肢跛行。術后行X線檢測，各組動物骨折端對位對線良好，橫行骨折線清晰可見。術后2周時，A組動物可見明顯的骨性骨痂形成，B、C組骨性骨痂不明顯；術后4周時，A組動物骨折端均已骨性愈合，骨折線消失，2只動物出現骨髓腔再通，其余四肢尚未再通，B、C組動物可見骨性骨痂形成，骨折線模糊，其中B組1只動物未見骨痂形成。

2.3 CGRP的免疫組化檢測

術后2周時，A、B、C三組切片均可見CGRP的陽性表達，骨、骨膜、骨骼肌的CGRP平均光密度值見表2。A組的CGRP表達水平均高于B、C組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明CGRP基因在A組不同組織均有轉染；A組CGRP的表達水平在骨膜組織明顯高于骨組織和骨骼肌組織，說明CGRP基因在骨膜組織的轉染率較高。術后4周時，A組CGRP 表達較 2周時明顯下降（P ＜ 0.05，圖1）；B、C 組未見CGRP表達。

表2 術后2周時CGRP的免疫組化光密度值（±s）

表2 術后2周時CGRP的免疫組化光密度值（±s）

注：與A組比較，*P＜0.05

組別 只數 骨 骨膜 骨骼肌A組60.301±0.0150.415±0.0330.283±0.029 B組60.143±0.009*0.162±0.017*0.105±0.013*C組60.126±0.007*0.148±0.032*0.098±0.003*

圖1 術后2、4周時A組CGRP平均光密度值比較

2.4 CGRP的Western blot檢測

Western blot檢測采用管家基因GAPDH作為內參，電泳條帶亮度一致，三組蛋白形成的CGRP條帶密度不同。根據公式：CGRP相對量=CGRPF產物電泳條帶密度/GAPDH×100%，計算各組蛋白量，結果見表3。A組動物CGRP的表達量在兩個時間點較B、C組均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05），B、C 組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P ＞ 0.05）。

表3 三組 CGRP蛋白表達相對量比較（±s）

表3 三組 CGRP蛋白表達相對量比較（±s）

注：與A組比較，*P＜0.05

術后2周 術后4周組別 只數 相對量 只數 相對量A組60.438±0.02660.367±0.033 B組60.186±0.009*60.107±0.043*C組60.173±0.011*60.152±0.033*

3 討論

骨折是骨科最為常見的疾病之一[4]，多數由意外所致，給患者身心造成極大痛苦，如何提高骨折愈合時間，恢復患者的正常生活是創(chuàng)傷骨科臨床中面臨的重要問題之一[5]。對于骨折延遲愈合甚至不愈合，許多學者采用不同方法均取得一定療效[6-8]，但并未能完全解決這一難題。骨折的愈合是較為復雜的病理生理過程，在細胞水平涉及成骨細胞、破骨細胞、巨噬細胞等多種細胞的參與[9]；在分子水平又涉及多種細胞因子、炎癥因子的相互作用[10]。其中，由于CGRP參與骨代謝的過程，在骨折的愈合過程中顯得尤為重要。

CGRP最早發(fā)現于甲狀腺髓樣癌組織中，主要分布于感覺神經纖維，通過軸漿運輸到達神經末梢[11]。骨折發(fā)生后，隨著骨折的愈合，周圍神經逐漸長入骨折斷端，其中以CGRP陽性纖維居多[12]。本研究通過基因轉染方式，將外源性基因片段導入骨折斷端，使其在體內表達。質粒溶液導入體內后轉染效率雖然沒有病毒溶液高，但由于CGRP在10-8～10-9mol/L水平即能發(fā)揮作用，因此，本實驗采用質粒溶液轉染，是一種方便快捷的轉染方式。A組CGRP在骨、骨膜、骨骼肌組織中的表達水平均明顯高于B、C組，說明CGRP在體內轉染成功并形成有效的表達。本研究A組CGRP在骨膜中的含量高于骨組織和骨骼肌組織，證明外源性CGRP在骨膜組織中的轉染率高，這與內源性CGRP的分布水平相一致，是由于CGRP能夠調節(jié)成骨細胞的活性，所以分布于骨膜等成骨活躍的區(qū)域[13]。術后2周時CGRP在骨膜內的含量明顯高于4周時，說明CGRP主要在成骨的早期發(fā)揮作用，而在骨痂形成后的塑性期，其作用減弱。術后4周時，A組的CGRP表達仍較B、C組高，說明轉染的外源性基因表達較持久。雖然B、C組沒有外源性CGRP的轉染，但在骨折愈合的早期和晚期仍有CGRP的表達，可見內源性CGRP在骨折周圍組織中也有表達，而早期的表達水平高于晚期的動態(tài)變化，也說明了內源性CGRP在骨折愈合的過程中發(fā)揮一定的作用。CGRP發(fā)揮作用的通路可能與蛋白激酶 C（PKC）有關[14]，也有研究表明其可能是通過抑制核因子κB活化因子配體（RANKL）對NF-κB的激活作用而起效[15]。本實驗不足之處在于未能探究CGRP的具體作用通路及作用位點，尚需進一步研究。

綜上所述，降鈣素基因相關肽能夠加速骨痂形成，提高骨折的愈合效率。

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