自噬在眼鏡蛇神經(jīng)毒素誘導A549細胞死亡中的作用

申健 何靖康 唐興 韓蓉 李睿 徐澄澄 吳亞娟

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是目前常見的惡性腫瘤之一，對于其治療，主要是以手術為主的綜合治療，但療效不盡如人意，對于NSCLC抗癌藥物的研發(fā)、已投入了大量的人力、物力，取得了許多重要的成就，其中之一就是從天然物質(zhì)中尋找抗腫瘤活性成分[1,2]。cobrotoxin是從眼鏡蛇的毒素中分離出來的一種神經(jīng)毒素，近年來有國內(nèi)外文獻報道cobrotoxin具有抗腫瘤作用[3-5]。本實驗研究中，我們以人肺A549腺癌細胞株為實驗對象，觀察cobrotoxin的抗腫瘤作用并探討其可能的分子機制，為今后cobrotoxin應用于臨床提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 人肺A549腺癌細胞株、人肺成纖維細胞株（購自上海生科院），均為貼壁生長，A549腺癌細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的PRMI-1640培養(yǎng)液中，人肺成纖維細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，均在5%CO2的37oC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長至80%-90%融合時以0.25%胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2 藥物、主要試劑、儀器 cobrotoxin（由蘇州大學醫(yī)學部藥學院藥理學系饋贈），3-甲基腺嘌呤（3-MA，美國Sigma公司），SB203580（碧云天公司），二甲基亞砜（DMSO），四甲基偶氮唑鹽（MTT，美國Sigma公司），自動酶標儀（Benchmark，美國BID-RAD公司），二氧化碳孵育箱（Hera cell150，德國Heraeus），SDS-PAGE電泳儀，電轉(zhuǎn)移槽。

1.3 細胞生長抑制實驗（MTT法） 取對數(shù)生長期的A549細胞和HFL1細胞，經(jīng)0.25%胰酶消化后制成含細胞1.0×105/mL的單細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每組設6個平行孔，24 h細胞貼壁后實驗組換用含5 μg/mL cobrotoxin、10 μg/mL cobrotoxin、20 μg/mL cobrotoxin、10 μg/mL cobrotoxin+5 μmmol/L 3-MA、10 μg/mL cobrotoxin+10 μmmol/L SB203580、5 μmmol/L 3-MA、10 μmmol/L SB203580不同培養(yǎng)液，設陰性對照組和空白調(diào)零孔。培養(yǎng)48 h每孔加MTT（5 mg/mL）20 μL，于孵箱繼續(xù)作用4 h，棄上清每孔加DMSO 150 μL，微振10 min，用酶標儀測定570 nm附近光吸收值（OD值），實驗重復3次，結(jié)果取平均值。細胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%。

1.4 細胞集落平板克隆實驗 取對數(shù)生長期的A549細胞，經(jīng)0.25%胰酶消化后制成單細胞懸液（400 cell/mL），接種于24孔板，每孔200 cell。接種后于培養(yǎng)箱靜置24 h后，每孔換用含5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL三個不同濃度cobrotoxin的培養(yǎng)液，設陰性對照組，每組設6個平行孔，作用48 h后各實驗組更換為PRMI-1640完全培養(yǎng)基，每隔2天-3天更換培養(yǎng)液1次，培養(yǎng)2周后用甲醇固定，Giemsa工作液染色，于顯微鏡下計數(shù)50個細胞以上的集落數(shù)。集落形成抑制率（%）=（對照組集落形成率-實驗組集落形成率）/對照組集落形成率×100%。

1.5 蛋白免疫印跡法（Western blot）測定beclin-1、LC3、P62、P38及pP38蛋白的表達 0.25%胰酶消化對數(shù)生長期的A549貼壁細胞，制備成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1.0×105/mL，分別接種于6孔培養(yǎng)板中，實驗組A549細胞分別加入含5 μg/mL cobrotoxin、10 μg/mL cobrotoxin、20 μg/mL cobrotoxin、10 μg/mL cobrotoxin+5 μmmol/L 3-MA、10 μg/mL cobrotoxin+10 μmmol/L SB203580的培養(yǎng)液，陰性對照組A549細胞加入不含cobrotoxin的PRMI-1640完全培養(yǎng)液，作用48 h后收集細胞，加入50 μL蛋白裂解液，混勻后移至EP管中置于冰上超聲30 min，然后在4oC下12,000 r/min離心5 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度，上樣前蛋白煮沸變性，于SDS-PAGE凝膠中電泳分離，轉(zhuǎn)膜（硝酸纖維素膜PVDF）免疫雜交，一抗為兔抗人beclin-1單克隆抗體，兔抗人LC3單克隆抗體，兔抗人pP38單克隆抗體，兔抗人P38單克隆抗體，以β-actin為內(nèi)參，二抗為相應的HRP標記的抗體。化學發(fā)光檢測法測定蛋白表達結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學方法 計量資料用Mean±SD表示，實驗組與對照組采用兩樣本均數(shù)t檢驗，組間比較采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，檢驗水準α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Cobrotoxin對A549細胞和HFL1細胞生長的抑制作用 作用48 h后不同濃度cobrotoxin對A549細胞的生長均有明顯抑制作用，MTT法測得OD值與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），不同濃度的抑制率分別為21.8%（cobrotoxin 5 μg/mL）、34.2%（cobrotoxin 10 μg/mL）、53.0%（cobrotoxin 20 μg/mL）（P＜0.05）。不同濃度的細胞生長抑制率見表1。不同濃度cobrotoxin對HFL1細胞的生長無明顯影響。

2.2 3-MA、SB203580干預后cobrotoxin對A549細胞的生長抑制作用 作用48 h后cobrotoxin+3-MA、cobrotoxin+SB203580干預組對A549細胞的生長仍有明顯抑制作用，抑制率分別為27.0%（cobrotoxin+3-MA）、24.5%（cobrotoxin+SB203580）但較cobrotoxin組（10 μg/mL）抑制作用變?nèi)?，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；3-MA和SB203580單獨應用組對A549細胞的生長無明顯抑制作用（P＞0.05）（表2）。

2.3 Cobrotoxin對A549細胞集落形成能力影響 Cobrotoxin作用48 h與對照組比較，對A549細胞的集落形成能力有顯著抑制作用，不僅集落數(shù)目變少，而且體積變小，并隨劑量增加抑制能力提高，結(jié)果如表3所示，提示cobrotoxin能抑制A549細胞集落形成。

2.4 Western blot檢測各組beclin-1、LC3、 pP38及P38蛋白的表達水平 與對照組相比較各濃度的cobrotoxin組beclin-1、pP38蛋白表達明顯上調(diào)，II型/I型LC3比值增大，差異有統(tǒng)計學意義，并隨cobrotoxin濃度增高，差異越發(fā)明顯。cobrotoxin+SB203580干預組較cobrotoxin組（10 μg/mL）beclin-1、pP38蛋白表達水平下調(diào)，II型/I型LC3比值減小，差異有統(tǒng)計學意義。P38蛋白表達無明顯差異（圖1）。cobrotoxin+3-MA干預組較cobrotoxin組（10 μg/mL）P62蛋白表達升高，beclin-1蛋白表達水平下調(diào)，II型/I型LC3比值減小，差異有統(tǒng)計學意義（圖2）。

3 討論

Cobrotoxin是眼鏡蛇的毒素中分離出來的一種神經(jīng)毒素，是眼鏡蛇毒的主要成分之一，由于鎮(zhèn)痛效果確切被美國FDA批準應用于臨床。近年來有國內(nèi)外文獻報道cobrotoxin具有抗腫瘤作用，但其具體作用機制尚不明確，推測其抗腫瘤作用途徑可能與N型乙酰膽堿受體有關[6]。

表1 cobrotoxin對A549細胞生長的影響Tab 1 The effect of cobrotoxin on the growth of cell A549

表2 3-MA、SB203580干預后cobrotoxin對A549細胞生長的影響Tab 2 The effect of cobrotoxin on the growth of cell A549 after the intervention of 3-MA, SB203580

表3 cobrotoxin對A549細胞集落形成能力影響Tab 3 The effect of cobrotoxin on the formation of colony

圖 1 Western blot檢測cobrotoxin作用后各相關蛋白表達的情況。A：Western blot法檢測不同濃度的crobrotoxin作用A549細胞48 h后各相關蛋白的表達。B、C、D、E、F統(tǒng)計分析各相關蛋白的表達變化。與對照組相比：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。Fig 1 The expression of various related protein by Western blot after the intervention of cobrotoxin for 48 h. A549 cells were treated with different concentration of crobrotoxin for 48 h. Protein level was determined by Western blot analysis. A: The expression of related protein after cobrotoxin induction. B, C, D, E, F: Quantification of Western blot analysis. *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001, compared with controls.

本實驗研究發(fā)現(xiàn)cobrotoxin對A549細胞具有明顯的抗腫瘤作用，低、中、高三個劑量組抑制率分別為21.8%（5 μg/mL）、34.2%（10 μg/mL）、53.0%（20 μg/mL）。cobrotoxin能有效抑制A549細胞集落形成，抑制率分別為22.3%（5 μg/mL）、39.5%（10 μg/mL）、50.5%（20 μg/mL）。3-MA抑制自噬或SB203580抑制P38-MAPK通路后cobrotoxin對A549細胞的生長抑制作用降低，表明cobrotoxin的抗腫瘤作用與誘導自噬和激活P38-MAPK通路相關。

圖2 Western blot檢測cobrotoxin作用后各相關蛋白表達的情況。A：Western blot法檢測10 μg/mL cobrotoxin+5 μmmol/L 3-MA和10 μg/mL cobrotoxin分別作用A549細胞48 h后各相關蛋白的表達。B、C、D：統(tǒng)計分析各相關蛋白的表達變化。與10 μg/mL cobrotoxin組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。Fig 2 The expression of various related protein by Western blot after the intervention of 3-MA for 48 h. A549 cells were treated with 10 μg/mL cobrotoxin+5 μmmol/L 3-MA and 10 μg/mL cobrotoxin for 48 h. Protein level was determined by Western blot analysis. A: The expression of related protein after cobrotoxin induction. B, C, D: Quantification of Western blotting analysis. *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001, compared with 10 μg/mL cobrotoxin group.

自噬（autophagy）意為自體吞噬（serf-eating），簡稱自噬，是溶酶體對細胞內(nèi)的部分細胞質(zhì)、細胞器等進行的一系列降解過程的統(tǒng)稱。自噬的發(fā)生機制尚不明確，受多種機制調(diào)節(jié)和制約[7,8]。在自噬過程中，LC3I轉(zhuǎn)化為LC3II并插入新形成的自噬體膜上，因此，LC3通常被用作哺乳動物細胞中自噬的標志蛋白，尤其II型/I型LC3比值能很好反映自噬的發(fā)生[9,10]。自噬基因Beclin1是哺乳動物參與自噬的特異性基因，尤其是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Beclin1是重要的自噬誘導因子，檢測其表達可一定程度上反映自噬的發(fā)生[11]。本實驗我們觀察到A549細胞經(jīng)cobrotoxin處理后，Western blot法檢測到beclin-1蛋白表達水平、II型/I型LC3比值上調(diào)，P62蛋白表達下調(diào)證實了cobrotoxin誘導A549細胞自噬的作用，并隨著cobrotoxin濃度增加beclin-1表達水平和II型/I型LC3比值上調(diào)，P62蛋白表達下調(diào)。3-MA抑制自噬后，P62蛋白上調(diào)，beclin-1表達水平和II型/I型LC3比值下調(diào)，證實了自噬的發(fā)生。自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有雙重作用，一方面在血供不足導致營養(yǎng)障礙的情況下，腫瘤細胞通過自噬獲得代謝所需能量，維持腫瘤細胞生長，從而促進腫瘤細胞的生長，為保護作用；另一方面，自噬則導致腫瘤細胞死亡，即第二類程序性細胞死亡或自噬性細胞死亡[12,13]。本實驗中與單獨使用神經(jīng)毒素相比聯(lián)合應用3-MA處理A549細胞其細胞抑制率從34.2%降到27.0%，說明神經(jīng)毒素所誘導的自噬對A549細胞具有促死亡作用。絲裂原活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導通路是細胞內(nèi)重要的信號系統(tǒng)，在將胞外刺激信號轉(zhuǎn)導至細胞及其核內(nèi)、介導細胞生物學反應（如增殖、分化、轉(zhuǎn)化、凋亡及自噬等）的過程中具有重要的作用[14-16]。本實驗經(jīng)cobrotoxin處理后的A549細胞，Western blot法檢測到pP38蛋白表達隨著cobrotoxin濃度增加而上調(diào)。應用P38-MAPK通路特異性抑制劑SB203580后P62蛋白表達上調(diào)，beclin-1蛋白表達、II型/I型LC3比值均下調(diào)，據(jù)此，我們推斷cobrotoxin誘導A549細胞自噬作用可能和激活P38-MAPK信號通路有關。

Cobrotoxin對人肺A549腺癌細胞體外生長有抑制作用，其可能通過活化P38-MAPK通路激活自噬參與抗腫瘤過程。